Summary
Betragtning spyt prøver for fremtidig klinisk anvendelse, blev en slikkepind-lignende ultrafiltrering (LLUF) probe fremstillet til at passe i den humane mundhule. Direkte analyse af ufordøjet spyt ved NanoLC-LTQ massespektrometri viste evnen hos LLUF prober til at fjerne store proteiner og høje tæthed proteiner, og med en lav overflod peptider mere detekterbar.
Abstract
Selv humant spyt proteom og peptidome er blevet afsløret 1-2 blev de majorly identificeret fra tryptiske fordøjelser af spyt-proteiner. Identifikation af naturligt forekommende peptidome af humant spyt uden forudgående fordøjelse med exogene enzymer bliver det nødvendigt, eftersom native peptider i humant spyt tilvejebringe potentielle værdier til diagnosticering sygdom, forudsigelse sygdomsprogression, og overvågning terapeutisk virkning. Passende stikprøve er et afgørende skridt til forbedring af identifikation af humane indfødte spyt peptidome. Traditionelle metoder til prøvetagning menneskelig spyt involverer centrifugering for at fjerne snavs 3-4 kan være for tidskrævende at være gældende for klinisk brug. Endvidere kan debris fjernes ved centrifugering være i stand til at rense de fleste af de inficerede patogener og fjerne de høje tæthed proteiner, ofte hindrer identifikation af lav tæthed peptidome.
Konventionelle proteom tilgange, PRIprimært anvender to-dimensional gelelektroforese (2-DE) geler i konjugation med i-gel fordøjelse stand til at identificere mange spyt-proteiner 5-6. Men denne fremgangsmåde er generelt ikke tilstrækkeligt følsomme til at detektere lav hyppighed peptider / proteiner. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) baserede proteomik er et alternativ, som kan identificere proteiner uden 2-DE separation. Selvom denne fremgangsmåde giver en højere følsomhed, er det generelt nødvendigt forud prøve præ-fraktionering 7 og præ-fordøjelse med trypsin, hvilket gør det vanskeligt for klinisk anvendelse.
For at omgå den hindring i massespektrometri på grund af prøveforberedelse, har vi udviklet en teknik kaldet kapillær ultrafiltrering (CUF) sonder 8-11. Data fra vores laboratorium vist, at de CUF prober er i stand til at opfange proteiner in vivo af forskellige mikromiljøer i dyr i en dynamisk og minimalt invasiv måde 8 -11. Ingen centrifugering er nødvendig, eftersom et negativt tryk skabes ved at sprøjte trække under prøveopsamling. De CUF prober kombineret med LC-MS succes har identificeret tryptisk-fordøjede proteiner 8-11. I denne undersøgelse har vi opgraderet ultrafiltreringen stikprøveudtagningsteknik ved at skabe en slikkepind-lignende ultrafiltrering (LLUF) probe, der let kan passe ind i den humane mundhule. Den direkte analyse ved LC-MS uden trypsinfordøjelse viste, at humant spyt udvindes indeholder mange peptidfragmenter afledt af forskellige proteiner. Sampling spyt med LLUF prober undgås centrifugering men effektivt fjernes mange større og høj forekomst proteiner. Vores massespektrometriske resultater viste, at mange med lav hyppighed peptider blev spores efter filtrere større proteiner med LLUF sonder. Påvisning af lav hyppighed spyt peptider var uafhængig af multiple-trin prøve separation med kromatografi. For kliniske anvendelse, indarbejde LLUF sonderd med LC-MS potentielt kan anvendes i fremtiden til at overvåge sygdomsprogression fra spyt.
Protocol
1. Oprettelse af LLUF Probes
- De polyethersulfon membraner (2 cm 2) blev forseglet med trekant polypropylen padler (University of California, San Diego), ved at lime membraner med epoxy på grænsen af padler. En negativt ladet polyethersulfon-membran med en molekylvægt cut-off (MWCO) på 30 kDa blev anvendt.
- En teflon fluoreret ethylenpropylen rør (indre diameter / ydre diameter, 0.35/0.50 cm) blev fastgjort til en cylinder udgang af en trekant polypropylen skovl så LLUF proben kan forbindes til en 20 ml sprøjte.
- Efter gennemvædning af polyethersulfon-membran i humant spyt i en dyrkningsskål (50 mm diameter) blev negativt tryk skabes ved at trække en sprøjte. Sprøjten med negativt tryk kørte ultrafiltreringsprocessen for prøvetagning proteiner fra spyt.
- Proberne blev steriliseret med 70% alkohol natten over før anvendelse. For at demonstrere korrekt tætning, vi positioneret LLUF sonder ind i en løsningtion indeholdende blå dextran (50 mg / ml) med en gennemsnitlig molekylvægt på 2.000 kDa i 2 timer. Fraværet af blå dextran i de indsamlede prøver viste, at ingen lækager udviklet under sonde fabrikation og sampling.
2. Spyt Collection
- Spyt blev opsamlet fra tre raske frivillige (to hanner og en hun i alderen 20 og 40), idet ingen medicin, med ingen åbenlyse tegn på gingivitis eller hulrum 6.
- Efter skylning af munden med vand, blev hele spytprøver opsamlet ved spyt, uden kemisk stimulering i et is-afkølet beholder.
- Alle prøver blev samlet og opbevaret på is under samlingen procedure.
- Umiddelbart efter indsamling, blev spyt (200 ul), der anvendes til prøveudtagning med LLUF sonder. Prøveudtagning blev udført ved en 4 ° C rum.
- Spyt-proteiner (1,0 ug / ul) med eller uden LLUF probe samling blev direkte udsat for nano LC-masse spectrometry analyse uden tryptisk fordøjelse. Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af en Bio-Rad Protein Assay 12.
3. NanoLC-LTQ MS Analyse
- De un-fordøjede spytprøver (5 pi) blev direkte indlæst til fælden kolonne Eksigent NanoLC systemet ved autosampler, under anvendelse af 100% buffer A (2% acetonitrile/0.1% myresyre). Den NanoLC blev on-line koblet med et Finnigan LTQ massespektrometer.
- Efter prøven lastning og vask blev ventilen tændt og 500 nl / min lineær gradient blev leveret til fælden og separationssøjlen (10 cm i længden, 100 um id, in-house pakket med Synergi 4 um C18). Gradienten var 0-50% puffer B (80% acetonitrile/0.1% myresyre) i 45 min.
- De nanoLC-LTQ MS instrumenter blev drevet i data afhængig af tilstanden af Xcalibur. MS / MS spektre af de fire stærkeste MS ioner over en intensitet på 1 × 10 5 blev indsamlet med dynamisk udelukkelseaktiveret og kollisionsenergi sat til 35%.
- Hver prøve blev kørt to gange med NanoLC-LTQ MS-system. Prøver fra tre separate præparater blev anvendt. Disse peptider kunne påvises i tre separate prøver blev opført i Supplerende tabel 1 og 2.. Repræsenterer NanoLC-LTQ MS-spektre blev illustreret i figur 3.
4. Dataanalyse og Protein databasesøgning
- Hver RAW fil blev konverteret til en mzXML fil ved hjælp af Readw.exe.
- Den mzXML fil var input til en SEQUEST Sorcerer 2-systemet, og søgte mod et menneske database genereret fra den tilsvarende National Center for Biotechnology Information (NCBI) protein database ved hjælp af ikke-enzym specificitet. Massen tolerance af precursor-ion blev indstillet til 1,5 Da. En molekylær masse på 16 Da sattes til methionin for differentiel søgningen hensyn til oxidation.
- Efter SEQUEST søgning, var resultaterne automatisk filtreret, valideret end vises ved PeptideProphet og ProteinProphet [Institut for Systembiologi (ISB)]. PeptideProphet estimerer en omfattende sandsynligheden (P) score, at et peptid opgave er "korrekt" vs "forkert" på grundlag af sin SEQUEST scoringer (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) og yderligere oplysninger for hver peptid identificeret sekvens. ProteinProphet beregnet sandsynlighed score 0-1 for hvert protein på basis af peptider tildelt MS / MS spektre.
- For at minimere falske positive identifikationer vi brugte strenge filterkriterier. For det første er den minimale P score cutoff sat til 0,8 for en accepteret peptid for at sikre en meget lav fejl (meget mindre end 3%) og forholdsvis god følsomhed. For det andet skal alle peptider med> 0,8 P score har høje krydskorrelationsintervallerne (Xcorr) scorer på samme tid: 1.9, 2.2 og 3.0 til +1, +2 og +3 opladning.
5. Fjernelse af mundbakterier med LLUF Prober
- At bestemme evnen af LLUF prober til at fjerneorale bakterier, spyt før og efter LLUF sonde opsamling (afsnit 3) blev spredt på agarplader til påvisning af bakterier.
- Aerobe bakterier blev dyrket på et antibiotikum-frit Lauria-Bertani (LB)-agarplade ved 37 ° C i en dag.
- Anaerobe bakterier blev dyrket på et antibiotikum-frit brucellanæringsvæske agarplade (BD, Sparks, MD) under anaerobe betingelser under anvendelse af Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) ved 37 ° C i en dag.
6. Repræsentative resultater
1. Fabrikation af LLUF sonder og prøvetagning spyt i et efterlignet orale miljø
Hvis prøveudtagning spyt kan udføres som suge en slikkepind, vil proceduren undgå nedbrydning af spiddet spyt i opsamlingsindretninger 13-14. Vigtigt, vil det også blive muligt at overvåge patienter dynamisk og lokalt fra mundhulen. Hertil kommer, at hvis prøvefremstilling ved hjælp af spyt kan forenkles ville klinikere let Facilitate proceduren for at fremskynde deres beslutning om den næste kliniske operation. Massespektrometri er en af de mest følsomme metoder til påvisning og endog sekvens proteiner i en meget kort tidsperiode. Imidlertid har komplicerede procedurer for prøveforberedelse bremset ved hjælp af denne teknik i klinikken. Endvidere er det kendt, at højere tæthed proteiner eller proteiner med høj molekylvægt i kliniske prøver (f.eks amylase i spyt) maskesekvenser lav hyppighed proteiner i massespektrometrisk analyse 15-16. At overvinde de forhindringer der er nævnt ovenfor, har vi udviklet en slikkepind-lignende ultrafiltreringsindretningen navngivet LLUF prober (figur 1). En negativt ladet polyethersulfon-membran med en MWCO på 30 kDa (figur 1A, a) blev limet på en polypropylen skovl (figur 1A, b). Det blev anbragt foran LLUF proben med henblik på at frafiltrere større proteiner i spyt. At efterligne det menneskelige orale miljø (fig. 1A, g), Blev en svamp (fig. 1A, e) gennemvædet i spyt i en dyrkningsskål (figur 1A, f). Efter fuldstændig tilbagetrækning af sprøjten (figur 1A, d), begyndte filtreret spyt bevæger sig langs en tilsluttet slange (figur 1A, c) og blev opsamlet.
2. Identifikation af indfødte spyt peptidome af NanoLC-LTQ MS
Sammenligning LC chromatogrammer, fandt vi forskellige chromatogrammer af spyt før og efter LLUF prøvetagning (fig. 2), hvilket indikerer, at der er forskellige proteinpræparater i spyt efter LLUF prøvetagning. At bestemme proteinpræparater, anvendte vi NanoLC-LTQ massespektrometri som vides at være i stand til hurtigt sekvens peptider fra et multipelt proteinblanding. Mere vigtigt, for at forenkle prøvepræparation til kliniske formål blev spyt uden kemisk eller enzymatisk fordøjelse anvendes til NanoLC-LTQ MS-analyse. Uventet 131 peptider vire identificeret i ufordøjet spyt (Supplemental tabel 1). Disse peptider er fragmenter afledt fra forskellige prolinrige proteiner, actin, alfa-amylase, alfa 1 globin, beta-globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymert immunoglobulin receptor, satherin og S100A9. Seksogtyve unikke peptider blev identificeret i spyt efter filtrering med LLUF prober (supplerende tabel 2). Disse peptider er fragmenter hovedsageligt afledt af forskellige prolin-rige proteiner. Peptider afledt fra proteiner, såsom det polymere immunoglobulin-receptoren (83,24 kDa) og alfa-amylase var upåviselige, hvilket viser evnen til LLUF prober fjernelse af større og rigelige proteiner. En MS / MS-spektrum af PFIAIHAEAESKL peptid svarende til en indre peptid af alfa-amylase vist i figur 3A. Mest Interessant nok, efter fjernelse af større proteiner, blev 18 af 26 sekventerede peptider kan påvises i LLUF probe-samplet spyt (tabel1). Disse 18 peptider blev afledt fra prolin-rige proteiner eller hypotetiske proteiner, der resulterede i en prolin (P) -. Glutamin (Q) (-PQ),-SR,-SP-eller-PP C-terminus figur 3B viste en MS / MS spektrum af PQGPPQQGGHPRPP peptid, blev detekteret i LLUF probe-prøver spyt. Peptidet kan være afledt fra prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien 1 og 2 (tabel 1).
Figur 1. Sammensætningerne ifølge LLUF prober og prøveudtagning af spyt fra efterligne humane mundhule Panel A: (a) en semipermeabel polyethersulfon med en MWCO på 30 kDa (b) en polypropylen skovl (c) en teflon fluoreret ethylenpropylen rør; (d) en 20 ml sprøjte Panel B:. en svamp (e) (a efterlignede tunge) blev gennemvædet i en dyrkningsskål (f) indeholdende humant spyt for at skabeen kunstig human mundhulen (g). Den resulterende negative tryk, der skabes ved fuldt trække en sprøjte driver opsamlede væske at bevæge sig langs en tilsluttet røret (pil) og hen imod en skabte rum (pilespids) i sprøjten. Bar: 2,0 cm.
Figur 2. Differentiel LC / MS / MS-kromatogrammer af spyt før og efter LLUF prøveudtagningen. Proteiner (1,0 ug / ul) i humant spyt blev filtreret med eller uden en LLUF probe. Proteiner uden tryptisk fordøjelse blev direkte udsat for NanoLC-LTQ MS, der var konjugeret med en Eksigent Nano LC system som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Base-peak chromatogrammer (med 44-MIM retentionstider) af spyt før (A) og efter (B) LLUF prøveudtagning blev belyst.
Figur 3. Detektorertion af spyt peptidome ved NanoLC-LTQ ms sekvensering. spyt-proteiner før (A) og efter (b) prøveudtagning med LLUF prober blev analyseret ved NanoLC-LTQ MS som beskrevet i Forsøgsprocedurer. Spyt peptidome afledt fra naturligt humant spyt uden tryptisk fordøjelse blev påvist i Supplerende tabel 1 og 2.. Et peptid (PFIAIHAEAESKL) afledt fra alfa-amylase blev udelukkende fundet i en spytprøve uden opkrævning med LLUF prober (A), viser, at evnen til LLUF prober til at fjerne store proteiner. Mange peptider med-PQ,-SR,-SP-eller-PP C-termini var kun i prøver efter ultrafiltrering LLUF prober. En (PQGPPQQGGHPRPP) af peptider afledt af forskellige prolinrige proteiner blev påvist (B). MS / MS spektre med karakteristiske "y" og "b"-serien ioner bekræftede identiteten af begge peptider.
<strong> Figur 4. Fjernelse af orale bakterier ved hjælp af under LLUF sonder. En LLUF probe blev konstrueret som beskrevet i Materialer og metoder. Proben blev anbragt i humant spyt i et efterlignet orale miljø (fig. 1). Sprøjten ved afslutningen af LLUF probe blev udtaget for at skabe et negativt tryk, der kørte ultrafiltreringsprocessen for spyt prøveudtagning. Under prøvetagning, krydsede helspyt selektivt gennem polyethersulfon membranen og akkumuleret inde i en sprøjte. Spyt før prøveudtagning med en LLUF probe tjente som kontrol. Spyt (10 pi) før og efter LLUF probe prøvetagning blev spredt på agarplader til bakteriepåvisning Panel A:. Spyt med (+ LLUF) og uden (+ LLUF) LLUF probe prøveudtagning blev spredt side om side på en antibiotika-fri LB-agarplade ved 37 ° C i en dag Panel B:. spyt med og uden LLUF probe prøver blev spredt på et antibiotikum-frit brucellanæringsvæske agarpladeunder anaerobe betingelser under anvendelse af Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) ved 37 ° C i en dag. Bakterier ikke vokser på agarplader fordelt med LLUF probe-samplet spyt, hvilket viser evnen til LLCF prober eliminere aerobe og anaerobe mundbakterier. Bar: 1,0 cm.
| Peptidsekvensen / målt peptidmasse | Tiltrædelse nummer | Navn | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485,3 | GI | 41349484 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform 2 precursor |
| GI | 41349482 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform en prækursor | ||
| GI | 60301553 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576,9 | GI | 4826944 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien 2 |
| GI | 9945310 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien en | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126,2 | GI | 37537692 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien 4 precursor |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028,3 | gi | 113423660 | Forudsiges: hypotetisk protein |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077,8 | gi | 113423262 | Forudsiges: hypotetisk protein isoform 5 |
| GI | 41349482 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform en prækursor | ||
| GI | 60301553 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien 2 | ||
| gi | 113423663 | Forudsiges: hypotetisk protein | ||
| GI | 41349484 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform 2 precursor | ||
| GI | 41349486 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform 3 prækursor | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918,5 | GI | 9945310 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien en |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131,3 | gi | 113423660 | Forudsiges: hypotetisk protein |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | gi | 113423663 | Forudsiges: hypotetisk protein |
| GI | 41349482 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform en prækursor | ||
| gi | 113423262 | Forudsiges: hypotetisk protein isoform 5 | ||
| GI | 60301553 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866,6 | GI | 4826944 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713,8 | GI | 9945310 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien en |
| GI | 4826944 Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien 2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083,1 | GI | 9945310 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien en |
| GI | 4826944 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512,6 | GI | 4826944 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien 2 |
| GI | 9945310 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien en | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720,2 | gi | 113423262 | Forudsiges: hypotetisk protein isoform 5 |
| gi | 113423663 | Forudsiges: hypothetical protein | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450,1 | GI | 9945310 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien en |
| GI | 4826944 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791,1 | GI | 4826944 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien 2 |
| GI | 9945310 | Prolin-rige proteiner HaeIII-underfamilien en | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186,9 | gi | 113423262 | Forudsiges: hypotetisk protein isoform 5 |
| GI | 41349482 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform en prækursor | ||
| GI | 60301553 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien 2 | ||
| gi | 113423663 | Forudsiges: hypotetisk protein | ||
| GI | 41349484 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform 2 precursor | ||
| GI | 41349486 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform 3 prækursor | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720,3 | gi | 113423663 | Forudsiges: hypotetisk protein |
| GI | 41349482 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien en isoform en prækursor | ||
| gi | 113423262 | Forudsiges: hypotetisk protein isoform 5 | ||
| GI | 60301553 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870,9 | GI | 37537692 | Prolin-rige proteiner BstNI-underfamilien 4 precursor |
Tabel 1. Peptider var udelukkende spores i LLUF-indsamlede prøver.
Supplerende Tabel 1. Klik her for at se supplerende tabel 1 .
Supplerende Tabel 2. Klik her for at se supplerende tabel 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har fundet, at mange peptidfragmenter findes i humant ufordøjet spyt. Disse peptidfragmenter er derivater fra forskellige former for prolin-rige proteiner, actin, alfa-amylase, alfa 1 globin, beta-globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymert immunoglobulin receptor, satherin, S100A9. Der kan være mange faktorer, der bidrager til produktion af peptider med ubestemte spaltningssteder. For eksempel kan nogle peptidfragmenter være naturligt til stede i humant spyt. Mange peptider med-PQ C-termini, blev identificeret (tabel 1 og Supplerende tabel 1 og 2). Prolin-rige proteiner kan klassificeres som sure, basiske eller glycosylerede proteiner og kodes af seks gener grupperet i en enkelt region 17. Mere end 30 forskellige prolin-rige proteiner skyldes allelisk variation, differentiel RNA-splejsning, proteolytisk processering, og post-translationelle modifikationer 17. Efter sekretion, det sure prolin-rige proteins hurtigt knyttet til tandflader og nedbrudt til potentielle medfødte immunitet peptider ved plak proteolyse 18-19. Både gramnegative og grampositive bakterier, udtrykker en bred vifte af glycosidaser og proteaser 18. Det er blevet rapporteret, at sure prolin-rige proteiner kan nedbrydes i potentielle medfødt-immunitet-lignende peptider ved oral Streptococcus og Actinomyces arter 18. Glutamin (Gln) - Glycin (Gly) spaltning er biologisk kritisk med hensyn til bakteriel nedbrydning af spyt sure prolinrige proteiner og produktion af en bakterie-bindende-PQ C-terminus 18, 20-22. Bindingen af-PQ termini af prolin-rige proteiner bakterier blev bekræftet ved et in vitro eksperiment under anvendelse af en syntetisk RGRPQ pentapeptid 18. Efter aftale med vores data, var SJ Fisher gruppe i stand til at identificere flere peptider med-PQ C-termini i ufordøjet menneskelige parotideale spyt 23,antyder flere peptider med-PQ C-termini, kan udvindes eksistere i humant spyt. Humant spyt indeholder multiple peptider med-PQ C-termini, der kan fungere som medfødt-immunitet-lignende peptider 18, 19. Når orale bakterier er til stede, kan prolin-rige proteiner straks nedbrydes til forskellige fragmenter med-PQ C-termini for at effektivt at dræbe bakterier.
En anden grund til peptidfragmenter, der findes i ufordøjet spyt, at nogle af de endogene proteaser findes i spyt, kan forblive aktive i prøvefremstilling 24-25. Spaltningen forekommer i disse proteiner med endogene proteaser i mundhulen kan fortsættes før massespektrometri-analyse. For eksempel kan mucin spaltes ved spyt protease ned til en mindre form, der er mere kompetent bakteriel clearance 26. Det er også muligt at proteaser fra mundbakterier kan spaltes de orale proteinerne før eller efter spyt Collection. Det er blevet dokumenteret, at flere spyt proteiner kan hakkes af proteaser fra orale Streptococcus og Actinomyces arter 27-29.
Den semi-permeable membran er en vigtig del af LLUF sonder. Membranen er nødvendig for selektivt at fjerne større stoffer, herunder proteiner, orale bakterier og rester. LLUF virker som en selektiv barriere, som tillader passage af visse komponenter og afviser andre komponenter i en kunstig mundhulen. Den semipermeable membran muliggør lille molekyle for at passere gennem membranen, mens bortset makromolekyler. Nylige data fra vores laboratorium har vist, at LLUF prober effektivt kan fjerne både aerobe og anaerobe mundbakterier (figur 4). Spytprøver før og efter samling med LLUF prober blev spredt ud på antibiotika-fri agarplader og inkuberet under aerobe og anaerobe betingelser. Bakterier ikke vokse, når agarplader blev smurt med LLUF probe-samplet spyt, hvilket viser evnen til LLUF prober fjernes aerobe og anaerobe mundbakterier. Vi søgte alle spektre med et humant database, som ikke indeholder protein-databaser af humane orale mikroorganismer. Identifikation af proteomanalyse / peptidome af orale mikrober bliver muligt, hvis en omfattende protein database med alle orale mikroorganismer kan etableres. Et organisk (polyethersulfon) membran blev anvendt til at fremstille LLUF prober. Selv om membranen var kendt for at have en 30 kDa MWCO, prøveudtagning resultater også afhænger af andre faktorer såsom interaktion af spyt-proteiner til negative ladninger på membranoverfladen 30. Ændringerne i pH-værdier og temperaturer samt protein kompleksitet i mundhulen påvirker også prøveudtagning. Vore data viste, at 18 peptider var udelukkende til stede i LLUF probe-samplet spyt (tabel 1). Peptiderne endte med-PQ,-SR,-SP-eller-PP C-termini er fortrinsvis afledt fra prolin-rigt proteins. Det er blevet rapporteret, at nettet negativt ladede prolin-rige proteiner viste en stærk adsorption til en negativt ladet overflade 31.
Sammenfattende kan i et forsøg på at påvise specifikke grupper af proteiner i fremtiden, semi-permeable membraner foran LLUF prober ændres under anvendelse af forskellige porestørrelser og materialer, der har forskellige overfladeladninger. For eksempel, spænder nanofiltreringsmembraner med porestørrelser fra 0,05 mikron til 1 nanometer kan adskille virus fra spytprøver 32. LLUF prober kan også anvendes til overvågning af koncentrationen af forskellige stoffer, såsom glucose og lactat i spytprøver. Selv ultrafiltreringsmembraner har gjort brug af protein adskillelse via centrifugal ultrafiltrering 33, har de sjældent blevet anvendt til at opsamle proteiner via påføring af negativt tryk over en semipermeabel membran. Sammenkædning de LLUF sonderne med avanceret massespektrometer som Fourier transform ion-cyklotron-resonans (FT-ICR) kan muliggøre identifikation af den intakte spyt proteiner 34-35. Især kan on-line analyse af dynamiske mønstre af spyt proteomanalyse og peptidome være afgørende for den kliniske anvendelse af LLUF sonder. Efter opsamling af LLUF prober, blev mange peptidfragmenter afledt fra prolin-rige proteiner identificeret fra ufordøjet spyt. Prolin-rige proteiner kan vekselvirke med orale bakterier at påvirke udviklingen af dental caries 36 og kan være betydelig i beskytte slimhindeoverflader mod virusinfektion 37. Endvidere er det blevet dokumenteret, at ekspressionen af prolin-rige proteiner blev ændret i patienter med rheumatoid arthritis 38. Disse undersøgelser støtter at prolin-rige proteiner opsamlet ved LLUF prober kan tjene som markører for overvågning af forskellige humane sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Tilskud (R01-AI067395-01, R21-R022754-01, og R21-I58002-01). Vi takker C. Niemeyer til kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
