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Medicine

मानव स्वदेशी लार लॉलीपॉप की तरह एक ultrafiltration जांच का प्रयोग Peptidome नमूनाकरण: सरल और क्लीनिकल मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए पेप्टाइड जांच बढ़ाएँ

Published: August 7, 2012 doi: 10.3791/4108

Summary

भविष्य नैदानिक ​​आवेदन के लिए लार के नमूने को ध्यान में रखते हुए, लॉलीपॉप की तरह एक ultrafiltration जांच (LLUF) के मानव मौखिक गुहा में फिट था गढ़े. NanoLC-LTQ मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पचाया नहीं लार की प्रत्यक्ष विश्लेषण LLUF जांच की क्षमता के लिए बड़ी प्रोटीन और उच्च बहुतायत प्रोटीन हटाने के लिए, और कम प्रचुर पेप्टाइड्स अधिक से detectable का प्रदर्शन किया.

Protocol

1. LLUF जांच का निर्माण

  1. polyethersulfone झिल्ली (2 2 सेमी) त्रिकोण polypropylene के paddles के साथ (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन डिएगो) paddles के सीमाओं पर epoxy के साथ gluing झिल्ली द्वारा सील किया गया. 30 केडीए में एक आणविक वजन कट ऑफ (MWCO) के साथ एक नकारात्मक आरोप लगाया polyethersulfone झिल्ली में इस्तेमाल किया गया था.
  2. एक teflon fluorinated ethylene propylene ट्यूब (आंतरिक / बाहरी व्यास व्यास, 0.35/0.50 सेमी) एक त्रिकोण polypropylene के चप्पू का एक सिलेंडर बाहर निकलने के लिए संलग्न किया गया तो LLUF जांच एक 20 मिलीलीटर सिरिंज से जोड़ा जा सकता है.
  3. के polyethersulfone झिल्ली मानव लार में एक संस्कृति डिश (50 मिमी व्यास) में भिगोने के बाद, नकारात्मक दबाव एक सिरिंज वापस द्वारा बनाया गया था. नकारात्मक दबाव के साथ सिरिंज लार से प्रोटीन के नमूने के लिए ultrafiltration प्रक्रिया चलाई.
  4. जांच के 70% का उपयोग करने के लिए रात भर पूर्व शराब के साथ निष्फल गया. उचित सील प्रदर्शित करने के लिए, हम एक समाधान में LLUF जांच तैनातtion के 2 घंटे के लिए 2,000 केडीए के एक औसत आणविक जन के साथ नीले dextran (50 मिलीग्राम / एमएल) से युक्त. एकत्र नमूनों में नीले dextran के अभाव का संकेत है कि कोई लीक जांच के निर्माण और नमूने के दौरान विकसित.

2. लार संग्रह

  1. पूरे लार तीन स्वस्थ स्वयंसेवकों (दो पुरुषों और 20 और 40 उम्र के बीच एक महिला) कोई दवा लेने से एकत्र किया गया था, 6 मसूड़े की सूजन या cavities के कोई प्रकट संकेत के साथ.
  2. पानी के साथ मुँह rinsing के बाद, थूकना द्वारा पूरे लार के नमूने एकत्र किए गए थे, एक बर्फ ठंडा पोत में रासायनिक उत्तेजना के बिना,.
  3. सभी नमूनों जमा थे और संग्रह प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा.
  4. तुरंत संग्रह के बाद, लार (200 μl) LLUF जांच के साथ नमूना के लिए लागू किया गया था. नमूना एक 4 डिग्री सेल्सियस कमरे में प्रदर्शन किया गया था.
  5. लार प्रोटीन के साथ या के बिना LLUF जांच संग्रह (1.0 μg / μl) सीधे नैनो नियंत्रण रेखा मास के अधीन थेtryptic पाचन के बिना pectrometry विश्लेषण. प्रोटीन सांद्रता प्रोटीन जैव रेड 12 परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया है.

3. NanoLC-LTQ एमएस विश्लेषण

  1. संयुक्त राष्ट्र पचा लार के नमूने (5 μl) को सीधे autosampler से Eksigent NanoLC प्रणाली के जाल स्तंभ के लिए भरी हुई थी, 100% बफर का उपयोग (2% acetonitrile/0.1% चींटी एसिड). ऑन लाइन NanoLC एक Finnigan LTQ मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ मिलकर किया गया था.
  2. नमूना लोड हो रहा है और धोने के बाद, वाल्व बंद किया गया था और एक 500 / nl मिनट है रैखिक ढाल जाल और जुदाई स्तंभ (लंबाई में 10 सेमी, 100 माइक्रोन आईडी, घर में SYNERGI 4 माइक्रोन C18 के साथ पैक) के लिए दिया गया था. ढाल 0 से 50% बफर बी (80 acetonitrile/0.1%% चींटी एसिड) से 45 मिनट में था.
  3. nanoLC-LTQ एमएस उपकरणों Xcalibur द्वारा डेटा निर्भर मोड में संचालित किया गया. चार मजबूत एमएस 1 × 5 10 के एक तीव्रता ऊपर में आयनों के स्पेक्ट्रा एमएस / एमएस गतिशील अपवर्जन के साथ एकत्र किए गए थेसक्षम है और टक्कर की ऊर्जा का 35% पर सेट.
  4. प्रत्येक नमूना दो बार NanoLC LTQ एमएस प्रणाली द्वारा चलाया गया था. तीन अलग - अलग तैयारी से नमूने का इस्तेमाल किया गया. उन तीन अलग नमूनों में detectable पेप्टाइड्स पूरक 1 टेबल्स और 2 में सूचीबद्ध किया गया. NanoLC LTQ एमएस स्पेक्ट्रा के प्रतिनिधि चित्रा 3 में सचित्र किया गया था.

4. डेटा विश्लेषण और प्रोटीन डेटाबेस खोज

  1. प्रत्येक RAW फ़ाइल एक mzXML Readw.exe का उपयोग कर फ़ाइल के लिए परिवर्तित कर दिया गया.
  2. mzXML फ़ाइल SEQUEST जादूगर 2 प्रणाली में इनपुट और एक मानव जैव प्रौद्योगिकी (NCBI) सूचना प्रोटीन एंजाइम विशिष्टता का उपयोग डेटाबेस के लिए इसी राष्ट्रीय केंद्र से उत्पन्न डेटाबेस के खिलाफ खोज. अग्रदूत आयन के बड़े पैमाने पर सहिष्णुता 1.5 दा पर स्थापित किया गया था. 16 दा की आणविक जन ऑक्सीकरण के लिए अंतर खाते में खोज के लिए methionine के लिए जोड़ा गया है.
  3. SEQUEST खोज के बाद, परिणाम स्वचालित रूप से फ़िल्टर किया गया, एक मान्यघ PeptideProphet और ProteinProphet [सिस्टम्स बायोलॉजी के लिए संस्थान (आईएसबी) के द्वारा प्रदर्शित किया. PeptideProphet एक व्यापक संभावना स्कोर (पी) का अनुमान है कि एक पेप्टाइड काम "सही" बनाम यह SEQUEST स्कोर (Xcorr, ΔCn, सपा, आरएसपी) और प्रत्येक पेप्टाइड अनुक्रम की पहचान की अतिरिक्त जानकारी के आधार पर "गलत" है. ProteinProphet एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा को सौंपा पेप्टाइड्स के आधार पर प्रत्येक प्रोटीन के लिए 0 से 1 के लिए एक संभावना स्कोर गणना.
  4. झूठी सकारात्मक पहचान की कम से कम हम कड़े फ़िल्टर मापदंड का इस्तेमाल किया. पहला, कम से कम पी स्कोर cutoff 0.8 में किसी भी स्वीकार किए जाते हैं पेप्टाइड के लिए सेट कर दिया जाता है के लिए बहुत कम त्रुटि (बहुत कम से 3%) और काफी अच्छी संवेदनशीलता को आश्वस्त. 1.9, 2.2, और 3.0 एक के लिए, 2, और 3 प्रभारी: दूसरा,> 0.8 पी स्कोर के साथ सभी पेप्टाइड्स उच्च पार के सहसंबंध (Xcorr) एक ही समय में स्कोर होना चाहिए.

5. मौखिक जीवाणुओं की जांच LLUF साथ हटाना

  1. LLUF जांच की क्षमता का निर्धारण करने के लिए दूरमौखिक बैक्टीरिया, LLUF जांच संग्रह (धारा 3) से पहले और बाद में लार बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए अगर प्लेट पर फैल गया था.
  2. एरोबिक बैक्टीरिया एक एंटीबायोटिक मुक्त Lauria के Bertani (पौंड) 37 ° C पर एक दिन के लिए अगर प्लेट पर बड़े हो रहे थे.
  3. जीवाणु anaerobic शर्तों के तहत 37 ° C पर एक दिन के लिए गैस - पाक (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, CA) का उपयोग कर एक एंटीबायोटिक मुक्त ब्रूसिला शोरबा अगर प्लेट (बी.डी., स्पार्क्स, एमडी) पर बड़े हो रहे थे.

6. प्रतिनिधि परिणाम

1. LLUF जांच और नमूने लार की एक नक़ल मौखिक वातावरण में निर्माण

यदि नमूने लार चूसने एक लॉलीपॉप के रूप में प्रदर्शन किया जा सकता है, प्रक्रिया 13-14 संग्रह उपकरणों में spitted लार की गिरावट से बचना होगा. महत्वपूर्ण बात, यह भी संभव हो करने के लिए रोगियों को मौखिक cavities से गतिशील और स्थानीय स्तर पर की निगरानी जाएगा. इसके अलावा, अगर नमूना लार का उपयोग तैयारी सरल किया जा सकता है, चिकित्सकों को आसानी से facil होगाअगले नैदानिक ​​आपरेशन पर अपने निर्णय में तेजी लाने की प्रक्रिया itate. मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक सबसे संवेदनशील तकनीकों का पता लगाने के लिए और समय की एक बहुत ही कम अवधि में अनुक्रम प्रोटीन भी है. हालांकि, नमूना तैयार करने के लिए जटिल प्रक्रियाओं क्लिनिक में इस तकनीक का उपयोग कर बाधा उत्पन्न की है. इसके अलावा, यह ज्ञात है कि उच्च बहुतायत नैदानिक ​​नमूनों में उच्च आणविक भार (लार में जैसे एमिलेज) बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण 15-16 में मुखौटा कम बहुतायत प्रोटीन के साथ प्रोटीन या प्रोटीन. उपर्युक्त बाधाओं को पार करने के लिए, हम एक लॉलीपॉप की तरह ultrafiltration युक्ति नाम LLUF जांच (चित्रा 1) विकसित की है. 30 केडीए (चित्र 1 ए) एक polypropylene चप्पू (चित्र 1 ए, ख) के लिए सरेस से जोड़ा हुआ था पर एक MWCO के साथ एक नकारात्मक आरोप लगाया polyethersulfone झिल्ली. यह LLUF जांच के सामने लार में बड़ा प्रोटीन को छानने के इरादे के साथ तैनात किया गया था. मानव मौखिक पर्यावरण (चित्रा 1 ए, जी की नकल), एक स्पंज (चित्रा 1 ए, ई) लार में एक संस्कृति डिश (चित्र 1 ए, च) में लथपथ था. पूरी तरह से सिरिंज (चित्र 1 ए, घ) वापस लेने के बाद, फ़िल्टर लार से जुड़ा ट्यूब (चित्रा 1 ए, सी) के साथ शुरू हुई और एकत्र किया गया था.

2. स्वदेशी लार peptidome की NanoLC LTQ एमएस द्वारा की पहचान

मुकाबले नियंत्रण रेखा chromatograms, हम पहले और के बाद LLUF (चित्रा 2) नमूने लार की अलग chromatograms पाया गया है, यह दर्शाता है कि वहाँ लार में विभिन्न प्रोटीन के रचनाओं LLUF नमूने के बाद कर रहे हैं. के प्रोटीन रचनाओं का निर्धारण, हम NanoLC-LTQ मास स्पेक्ट्रोमेट्री है कि तुरंत एक बहु प्रोटीन मिश्रण से अनुक्रम पेप्टाइड्स करने में सक्षम हो जाता है कार्यरत हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए नमूना तैयार करने को आसान बनाने, रासायनिक या एंजाइमी पाचन के बिना पूरे लार NanoLC LTQ एमएस विश्लेषण के लिए लागू किया गया था. अप्रत्याशित रूप से, हम 131 पेप्टाइड्सपचाया नहीं लार (पूरक तालिका 1) में पहचान कर रहे हैं. इन पेप्टाइड्स विभिन्न प्रोलाइन समृद्ध प्रोटीन, actin, अल्फा amylase, एक ग्लोबिन अल्फा, बीटा ग्लोबिन, 1 histain, केरातिन 1, 7 mucin, polymeric इम्मुनोग्लोबुलिन रिसेप्टर, satherin, और S100A9 से व्युत्पन्न टुकड़े कर रहे हैं. छब्बीस अद्वितीय पेप्टाइड्स LLUF जांच (पूरक तालिका 2) के साथ छानने के बाद लार में पहचान की गई. इन पेप्टाइड्स मुख्य रूप से विभिन्न प्रोलाइन युक्त प्रोटीन से व्युत्पन्न टुकड़े कर रहे हैं. Polymeric immunoglobulin (83.24 केडीए) रिसेप्टर और अल्फा amylase, जैसे प्रोटीन से व्युत्पन्न पेप्टाइड्स से undetectable थे, बड़े और प्रचुर मात्रा में प्रोटीन को हटाने के के में LLUF जांच की क्षमता का प्रदर्शन है. अल्फा amylase के एक आंतरिक पेप्टाइड PFIAIHAEAESKL इसी पेप्टाइड एमएस / एमएस की एक स्पेक्ट्रम 3A चित्रा में सचित्र है. सबसे दिलचस्प, बड़ा प्रोटीन को हटाने के बाद, अनुक्रम 18 26 पेप्टाइड्स LLUF लार जांच नमूना (टेबल में detectable बन गया) 1. इन 18 पेप्टाइड्स प्रोलाइन युक्त प्रोटीन या काल्पनिक है कि प्रोटीन (पी) प्रोलाइन के साथ समाप्त हो गया से प्राप्त किए गए glutamine (क्यू) (PQ), सपा, - SR या पीपी सी टर्मिनस चित्रा 3B / एमएस दिखाया. स्पेक्ट्रम की PQGPPQQGGHPRPP पेप्टाइड कि जांच नमूना LLUF लार में पाया गया था. पेप्टाइड - प्रोलाइन युक्त प्रोटीन HaeIII एक उपपरिवार और 2 (तालिका 1) से प्राप्त किया जा सकता है.

चित्रा 1
आकृति 1. रचनाओं LLUF जांच और मानव मौखिक गुहा की नकल से पूरे लार के नमूने के पैनल: (क) एक अर्द्ध पारगम्य 30 केडीए MWCO के साथ polyethersulfone, (ख) एक polypropylene चप्पू, (ग) एक teflon fluorinated ethylene propylene ट्यूब; (घ) एक 20 मिलीलीटर सिरिंज पैनल बी: (ई) स्पंज (एक मजाक उड़ाया जीभ) एक संस्कृति पकवान बनाने के लिए मानव लार युक्त (च) में भिगो गया थाएक कृत्रिम मानव मौखिक गुहा (छ). परिणामस्वरूप नकारात्मक दबाव पूरी तरह से एक सिरिंज वापस लेने के द्वारा बनाई गई सिरिंज के भीतर से जुड़ा ट्यूब (तीर) और साथ बनाया अंतरिक्ष (नोक) की ओर ले जाने एकत्र तरल पदार्थ ड्राइव. मधुशाला: 2.0 सेमी.

चित्रा 2
चित्रा 2. पहले और बाद LLUF नमूना अंतर नियंत्रण रेखा / एमएस / एमएस मानव पूरे लार में लार की. Chromatograms प्रोटीन (1.0 / μg μl) के बिना या एक LLUF जांच के साथ फ़िल्टर किया गया. Tryptic पाचन के बिना प्रोटीन सीधे NanoLC LTQ एमएस कि एक Eksigent नैनो नियंत्रण रेखा प्रणाली के साथ संयुग्मित सामग्री और तरीके में वर्णित के रूप में किए थे. लार की आधार शिखर chromatograms के पहले (44 एमआईएम प्रतिधारण समय के साथ) (ए) और (बी) के बाद LLUF नमूना सचित्र गया.

चित्रा 3
चित्रा 3. Detecलार peptidome की NanoLC LTQ एमएस अनुक्रमण. लार प्रोटीन से पहले tion (ए) और (बी) नमूने LLUF जांच के साथ NanoLC-LTQ के रूप में प्रायोगिक प्रक्रिया में वर्णित एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया. Tryptic पाचन के बिना प्राकृतिक मानव लार से प्राप्त लार peptidome पूरक 1 टेबल्स और 2 में प्रदर्शन किया गया. (PFIAIHAEAESKL) पेप्टाइड अल्फा एमिलेज से प्राप्त विशेष रूप से LLUF जांच (ए) के साथ संग्रह के बिना लार के नमूने में पाया, illustrating कि बड़े प्रोटीन को हटाने में LLUF जांच की क्षमता है. PQ साथ कई पेप्टाइड्स - SR, सपा या पीपी सी टर्मिनी ultrafiltration LLUF जांच के बाद नमूने में केवल थे. विभिन्न प्रोलाइन समृद्ध प्रोटीन से व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (PQGPPQQGGHPRPP) (बी) दिखाया गया है. एमएस / एमएस विशेषता "वाई" और "ख" श्रृंखला आयनों के साथ स्पेक्ट्रा दोनों पेप्टाइड्स की पहचान की पुष्टि की.

चित्रा 4
<मजबूत> 4 चित्रा मौखिक बैक्टीरिया LLUF जांच के दौरान प्रयोग की निकालना. एक LLUF जांच सामग्री और तरीकों में वर्णित के रूप में निर्माण किया गया. जांच मानव लार में एक नक़ल मौखिक पर्यावरण (चित्रा 1) के भीतर तैनात किया गया था. LLUF जांच के अंत में सिरिंज के लिए एक नकारात्मक दबाव है कि लार के नमूने के लिए ultrafiltration प्रक्रिया चलाई बनाने के लिए वापस ले लिया गया. नमूने के दौरान पूरे लार चुनिंदा polyethersulfone झिल्ली के माध्यम से पार किया और एक सिरिंज के अंदर जमा. एक LLUF जांच के नमूने से पहले पूरे लार एक नियंत्रण के रूप में सेवा की. पहले और के बाद LLUF जांच नमूने लार (10 μl) अगर प्लेट पर बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए फैल गया था पैनल (LLUF +) के साथ और बिना लार (+ LLUF) LLUF जांच नमूने एक एंटीबायोटिक मुफ्त पक्ष द्वारा साइड में फैल गया था अगर प्लेट लेग 37 डिग्री सेल्सियस एक दिन के लिए पैनल बी: लार के साथ और के बिना LLUF जांच नमूने एक एंटीबायोटिक मुक्त ब्रूसिला शोरबा अगर थाली पर फैल गया था.anaerobic शर्तों के तहत 37 ° C पर एक दिन के लिए गैस - पाक (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, CA) का उपयोग कर. बैक्टीरिया अगर जांच नमूना LLUF लार के साथ फैल प्लेटों पर विकसित नहीं था, एरोबिक को नष्ट करने के रूप में अच्छी तरह से anaerobic मौखिक जीवाणुओं में LLCF जांच की क्षमता का प्रदर्शन. बार: 1.0 सेमी.

पेप्टाइड अनुक्रम / मापाकरे पेप्टाइड जन अवाप्ति क्रमांक नाम
1 AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ

2485.3
सैनिक | 41349484 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BstNI उपपरिवार 1 isoform 2 अग्रदूत
सैनिक | 41349482 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BstNI उपपरिवार 1 isoform एक अग्रदूत
सैनिक | 60301553 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन BstNI उपपरिवार 2
2 GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576.9
सैनिक | 4826944 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन HaeIII उपपरिवार 2
सैनिक | 9945310 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन HaeIII 1 उपपरिवार
3 GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126.2
सैनिक | 37537692 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन BstNI उपपरिवार 4 अग्रदूत
4 GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028.3
सैनिक | 113423660 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन
5 GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077.8
सैनिक | 113423262 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन isoform 5
सैनिक | 41349482 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BSTएनआई एक उपपरिवार isoform एक अग्रदूत
सैनिक | 60301553 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन BstNI उपपरिवार 2
सैनिक | 113423663 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन
सैनिक | 41349484 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BstNI उपपरिवार 1 isoform 2 अग्रदूत
सैनिक | 41349486 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BstNI उपपरिवार 1 isoform 3 अग्रदूत
6 GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918.5
सैनिक | 9945310 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन HaeIII 1 उपपरिवार
7 GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131.3
सैनिक | 113423660 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन
8 GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030
सैनिक | 113423663 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन
सैनिक | 41349482 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BstNI उपपरिवार 1 isoform एक अग्रदूत
सैनिक | 113423262 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन isoform 5
सैनिक | 60301553 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन BstNI उपपरिवार 2
9 GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866.6
सैनिक | 4826944 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन HaeIII उपपरिवार 2
10 GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713.8
सैनिक | 9945310 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन HaeIII 1 उपपरिवार
सैनिक | 4826944 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन HaeIII उपपरिवार 2
11 GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083.1
सैनिक | 9945310 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन HaeIII 1 उपपरिवार
सैनिक | 4826944 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन HaeIII उपपरिवार 2
12 GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512.6
सैनिक | 4826944 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन HaeIII उपपरिवार 2
सैनिक | 9945310 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन HaeIII 1 उपपरिवार
13 NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720.2
सैनिक | 113423262 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन isoform 5
सैनिक | 113423663 भविष्यवाणी: हरियाणाpothetical प्रोटीन
14 PQGPPQQGGHPRPP
1450.1
सैनिक | 9945310 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन HaeIII 1 उपपरिवार
सैनिक | 4826944 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन HaeIII उपपरिवार 2
15 QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791.1
सैनिक | 4826944 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन HaeIII उपपरिवार 2
सैनिक | 9945310 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन HaeIII 1 उपपरिवार
16 SPPGKPQGPPPQ
1186.9
सैनिक | 113423262 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन isoform 5
सैनिक | 41349482 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BstNI उपपरिवार 1 isoform एक अग्रदूत
सैनिक | 60301553 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन BstNI उपपरिवार 2
सैनिक | 113423663 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन
सैनिक | 41349484 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BstNI उपपरिवार 1 isoform 2 अग्रदूत
सैनिक | 41349486 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BstNI उपपरिवार 1 isoform 3 अग्रदूत
17 SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720.3
सैनिक | 113423663 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन
सैनिक | 41349482 प्रोलाइन युक्त प्रोटीन BstNI उपपरिवार 1 isoform एक अग्रदूत
सैनिक | 113423262 भविष्यवाणी: काल्पनिक प्रोटीन isoform 5
सैनिक | 60301553 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन BstNI उपपरिवार 2
18 SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870.9
सैनिक | 37537692 प्रोलाइन अमीर प्रोटीन BstNI उपपरिवार 4 अग्रदूत

तालिका 1. पेप्टाइड्स LLUF एकत्र नमूनों में विशेष रूप से detectable थे.

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पूरक टेबल 2. लिए यहाँ क्लिक करें. पूरक टेबल 2 देखने .

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Discussion

हमने पाया है कि कई पेप्टाइड टुकड़े पचाया नहीं मानव लार में मौजूद हैं. इन पेप्टाइड टुकड़ों प्रोलाइन युक्त प्रोटीन, actin, अल्फा amylase, एक ग्लोबिन अल्फा, बीटा ग्लोबिन, 1 histain, केरातिन 1, 7 mucin, polymeric इम्मुनोग्लोबुलिन रिसेप्टर, satherin, S100A9 के विभिन्न रूपों से डेरिवेटिव हैं. वहाँ कई अनिर्धारित दरार साइटों के साथ पेप्टाइड्स के उत्पादन के लिए योगदान कारक हो सकता है. उदाहरण के लिए, कुछ पेप्टाइड टुकड़ों स्वाभाविक रूप से मानव पूरे लार में मौजूद हो सकता है. सी टर्मिनी PQ साथ कई पेप्टाइड्स पहचान की गई है (तालिका 1 और पूरक टेबल्स 1 और 2). प्रोलाइन अमीर प्रोटीन अम्लीय, बुनियादी या ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है और छह एक ही क्षेत्र में 17 क्लस्टर जीन द्वारा इनकोडिंग हैं. तीस से अधिक विभिन्न प्रोलाइन समृद्ध allelic परिवर्तन, अंतर शाही सेना splicing, proteolytic प्रसंस्करण, और बाद translational 17 संशोधनों के प्रोटीन से परिणाम. स्राव के बाद, अम्लीय prot प्रोलाइन अमीरEins तेजी से दांत सतहों और दंत पट्टिका 18-19 proteolysis द्वारा संभावित सहज रोगक्षमता पेप्टाइड में अपमानित से जुड़े होते हैं. दोनों ग्राम नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया glycosidases और 18 के proteases एक किस्म व्यक्त करते हैं. यह बताया गया है कि अम्लीय प्रोलाइन अमीर प्रोटीन मौखिक स्ट्रैपटोकोकस और एक्टिनोमाइसेस प्रजातियों के 18 संभावित सहज रोगक्षमता - जैसे पेप्टाइड में अपमानित किया जा सकता है. Glutamine (GLN) Glycine दरार (Gly) जैविक लार अम्लीय प्रोलाइन अमीर प्रोटीन और बैक्टीरिया बाध्यकारी PQ 18 सी टर्मिनस, 20-22 के उत्पादन के जीवाणु गिरावट के संबंध में महत्वपूर्ण है. PQ के बंधन बैक्टीरिया के प्रोलाइन युक्त प्रोटीन के Termini द्वारा इन विट्रो प्रयोग में सिंथेटिक RGRPQ 18 pentapeptide का उपयोग कर पुष्टि की गई. हमारे डेटा के साथ समझौते में, एसजे फिशर समूह के अव्यवस्थित मानव कर्णमूलीय लार 23 में सी टर्मिनी PQ साथ कई पेप्टाइड्स की पहचान करने में सक्षम था,सी टर्मिनी PQ साथ कई पेप्टाइड्स सुझाव मानव पूरे लार में देश में ही मौजूद हो सकता है. मानव लार PQ साथ कई पेप्टाइड्स सी - के Termini जो 18 पेप्टाइड्स, 19 जन्मजात प्रतिरक्षा - तरह के रूप में कार्य हो सकता है. जब मौखिक बैक्टीरिया मौजूद हैं, प्रोलाइन प्रोटीन युक्त विभिन्न टुकड़ों के लिए तुरंत नीचे तोड़ सकता है सी टर्मिनी PQ साथ आदेश में कुशलतापूर्वक जीवाणुओं को मारने.

पचाया नहीं लार में मौजूदा पेप्टाइड टुकड़ों के लिए एक अन्य कारण हैं कि अंतर्जात पूरे लार में मौजूद proteases की कुछ नमूना 24-25 तैयारी के दौरान सक्रिय रह सकती है. मौखिक गुहा में अंतर्जात proteases से इन प्रोटीनों में होने वाली दरार की संभावना मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले जारी रखा. उदाहरण के लिए, mucin एक छोटे रूप कि बैक्टीरियल 26 निकासी में सक्षम है करने के लिए नीचे लार प्रोटीज द्वारा cleaved जा सकता है. यह भी संभव है कि मौखिक बैक्टीरिया से proteases लार collectio के पहले या बाद में मौखिक प्रोटीन फोड़नाएन. यह प्रलेखित किया गया है कि कई लार प्रोटीन मौखिक स्ट्रैपटोकोकस और एक्टिनोमाइसेस 27-29 प्रजातियों से proteases से कटा हुआ जा सकता है.

अर्द्ध पारगम्य झिल्ली LLUF जांच के एक प्रमुख घटक है. झिल्ली चुनिंदा प्रोटीन, मौखिक बैक्टीरिया और मलबे सहित बड़ी पदार्थों को हटाने के लिए आवश्यक है. LLUF एक चयनात्मक बाधा है कि कुछ घटकों के पारित होने के परमिट और एक कृत्रिम मौखिक गुहा के भीतर अन्य घटकों को खारिज कर दिया है के रूप में कार्य करता है. अर्द्ध पारगम्य झिल्ली के छोटे अणु झिल्ली के माध्यम से पारित करने के लिए, जबकि बड़े अणुओं को छोड़कर की अनुमति देता है. हमारी प्रयोगशाला से हाल के आंकड़ों से पता चला है कि LLUF जांच को प्रभावी ढंग से दोनों एरोबिक और anaerobic मौखिक बैक्टीरिया (चित्रा 4) निकाल सकते हैं. पहले और बाद LLUF जांच के साथ संग्रह लार के नमूने एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त अगर प्लेट पर फैल रहे थे और एरोबिक और anaerobic शर्तों के तहत incubated रहे. बैक्टीरिया जब अगर प्लेट LLUF साथ फैल गया विकसित नहीं किया जांचलार नमूना, एरोबिक और anaerobic मौखिक बैक्टीरिया को दूर करने में LLUF जांच की क्षमता का प्रदर्शन है. हम एक मानव डेटाबेस है कि मानव मौखिक रोगाणुओं के प्रोटीन डेटाबेस शामिल नहीं किया था के साथ सभी स्पेक्ट्रा की तलाशी ली. के proteome / मौखिक रोगाणुओं के peptidome की पहचान संभव हो है अगर सभी मौखिक रोगाणुओं के साथ एक व्यापक प्रोटीन डेटाबेस स्थापित किया जा सकता है. एक कार्बनिक झिल्ली (polyethersulfone) लिए LLUF जांच बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि झिल्ली एक 30 केडीए MWCO जाना जाता था, नमूना प्रदर्शन भी लार प्रोटीन की झिल्ली 30 सतह पर नकारात्मक आरोप को बातचीत के रूप में अन्य कारकों पर निर्भर करता है. पीएच मान और के रूप में अच्छी तरह के रूप में मौखिक गुहा में प्रोटीन जटिलता के तापमान में परिवर्तन भी नमूना प्रदर्शन को प्रभावित कर रहे हैं. हमारे डेटा का प्रदर्शन किया है कि 18 पेप्टाइड्स LLUF जांच नमूना लार (तालिका 1) में विशेष रूप से उपस्थित थे. पेप्टाइड्स के साथ PQ समाप्त, एसआर, सपा या पीपी सी - Termini मुख्य रूप से प्रोलाइन अमीर पी से प्राप्त कर रहे हैंroteins. यह बताया गया है कि शुद्ध नकारात्मक आरोप लगाया प्रोलाइन प्रोटीन युक्त एक नकारात्मक चार्ज 31 सतह के लिए एक मजबूत सोखना प्रदर्शित.

सारांश में, एक भविष्य LLUF जांच के सामने अर्द्ध पारगम्य झिल्ली में प्रोटीन के विशिष्ट समूहों का पता लगाने के प्रयास में विभिन्न ध्यान में लीन होना आकार और सामग्री है कि अलग सतह आरोप है का उपयोग कर परिवर्तित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, रोमकूप आकार के साथ nanofiltration झिल्ली 0.05 माइक्रोन से 1 नैनोमीटर से लेकर 32 लार के नमूने से वायरस को अलग नहीं कर सकता. LLUF जांच और लार के नमूने में ग्लूकोज लैक्टेट के रूप में विभिन्न पदार्थों की एकाग्रता की निगरानी के लिए भी लागू किया जा सकता है. हालांकि ultrafiltration झिल्ली प्रोटीन जुदाई के केन्द्रापसारक 33 ultrafiltration के माध्यम से उपयोग किया है, वे शायद ही कभी एक अर्द्ध पारगम्य झिल्ली के पार नकारात्मक दबाव के आवेदन के माध्यम से प्रोटीन लेने के लिए इस्तेमाल किया गया है. जैसे फूरियर टी के रूप में उन्नत मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ LLUF जांच जोड़नेransform आयन साइक्लोट्रॉन प्रतिध्वनि (एफटी ICR) अनुमति दे सकता है बरकरार लार की पहचान है 34-35 प्रोटीन. विशेष रूप से, लार के proteome और peptidome गतिशील पैटर्न के विश्लेषण पर लाइन LLUF जांच के नैदानिक ​​आवेदन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. LLUF जांच के साथ संग्रह के बाद, कई पेप्टाइड प्रोलाइन युक्त प्रोटीन से व्युत्पन्न टुकड़े अव्यवस्थित पूरे लार से पहचान की गई. प्रोलाइन युक्त प्रोटीन मौखिक जीवाणुओं के साथ बातचीत के दंत क्षय का 36 विकास को प्रभावित कर सकते हैं और वायरल संक्रमण 37 से mucosal सतहों की रक्षा में महत्वपूर्ण हो सकता है. इसके अलावा, यह प्रलेखित किया गया है कि प्रोलाइन युक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति रुमेटी गठिया के रोगियों में 38 बदल दिया गया था. इन अध्ययनों से जोरदार समर्थन कि प्रोलाइन अमीर LLUF जांच द्वारा एकत्रित प्रोटीन बायोमार्कर के रूप में विभिन्न मानव रोगों की निगरानी के लिए सेवा कर सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य अनुदान (R01-01-AI067395, R21-R022754-01, और R21 I58002-01) द्वारा समर्थित किया गया. हम सी. Niemeyer पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethersulfone membranes Pall Corporation 30 kDa MWCO
Teflon fluorinated ethylene propylene tube Upchurch Scientific
Blue dextran Sigma
Nano LC system Eksigent
C18 trap column Agilent 5065-9913
LTQ linear ion-trap mass spectrometer Thermo Fisher
Sorcerer 2 Sage-N Research
Acetonitrile-0.1% formic acid J.T. Baker 9832-03 LC/MS grade
Water-0.1% formic acid J.T. Baker 9834-03 LC/MS grade

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मेडीसिन 66 अंक आण्विक जीवविज्ञान आनुवंशिकी नमूनाकरण लार Peptidome ultrafiltration मास स्पेक्ट्रोमेट्री
मानव स्वदेशी लार लॉलीपॉप की तरह एक ultrafiltration जांच का प्रयोग Peptidome नमूनाकरण: सरल और क्लीनिकल मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए पेप्टाइड जांच बढ़ाएँ
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Zhu, W., Gallo, R. L., Huang, C. M.More

Zhu, W., Gallo, R. L., Huang, C. M. Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (66), e4108, doi:10.3791/4108 (2012).

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