Summary
Med tanke på saliv provtagning för framtida klinisk tillämpning, var en klubba-liknande ultrafiltrering (LLUF) sond tillverkas för att passa i den mänskliga munhålan. Direkt analys av osmält saliv genom NanoLC-LTQ masspektrometri visade förmågan hos LLUF prober för att avlägsna stora proteiner och höga proteiner överflöd, och gör låg rikliga peptider mer detekterbar.
Abstract
Även om mänsklig saliv proteom och peptidome har avslöjat 1-2 de majorly identifieras tryptiska digereringar av saliv proteiner. Identifiering av inhemska peptidome i mänsklig saliv utan föregående uppslutning med exogena enzymer blir absolut nödvändigt, eftersom infödda peptider i mänsklig saliv ge potentiella värden för att diagnostisera sjukdomar, förutsäga sjukdomsutveckling och övervakning terapeutisk effekt. Lämplig provtagning är ett kritiskt steg för förbättring av identifiering av mänskligt inhemska saliv peptidome. Traditionella metoder för provtagning mänsklig saliv innebär centrifugering för att avlägsna skräp 3-4 kan vara för tidskrävande att gälla för klinisk användning. Dessutom kan skräp avlägsnas genom centrifugering inte att rengöra de flesta av de smittade patogener och ta bort de höga överflöd proteiner som ofta hindrar identifiering av låg förekomst peptidome.
Konventionella proteomik metoder som främstligen använda två-dimensionell gelelektrofores (2-DE) geler i konjugation med i-gel-digerering är i stånd att identifiera många saliv proteiner 5-6. Emellertid är denna metod i allmänhet inte tillräckligt känsligt för att detektera låga förekomst peptider / proteiner. Vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) proteomik är ett alternativ som kan identifiera proteiner utan föregående 2-DE-separation. Även om detta tillvägagångssätt tillhandahåller högre känslighet, behöver den i allmänhet före provet före fraktionering 7 och pre-nedbrytning med trypsin, vilket gör det svårt för klinisk användning.
Att kringgå hinder i masspektrometri på grund av provberedning, har vi utvecklat en teknik som kallas kapillär ultrafiltrering (CUF) sonder 8-11. Data från vårt laboratorium visat att de CUF sonderna har förmåga att fånga proteiner in vivo från olika mikromiljöer i djur i en dynamisk och minimalt invasiva sätt 8 -11. Ingen centrifugering är nödvändig eftersom ett undertryck skapas genom att helt enkelt spruta dra under provtagning. De CUF sonderna kombination med LC-MS har lyckats identifierat tryptisk-nedbrutna proteiner 8-11. I denna studie uppgraderade vi tekniken ultrafiltrering provtagning genom att skapa en klubba-liknande ultrafiltrering (LLUF) sond som lätt får plats i den mänskliga munhålan. Den direkta analysen genom LC-MS utan trypsin-digerering visade att human saliv utvinning innehåller många peptidfragment härstammande från olika proteiner. Provtagning saliv med LLUF sonder undvikas centrifugering men effektivt bort många större och hög förekomst proteiner. Våra masspektrometriska resultat visade att många låg förekomst peptider blev detekterbar efter att filtrera bort större proteiner med LLUF sonder. Detektering av låga peptider överflöd saliv var oberoende av flera steg prov separation med kromatografi. För klinisk tillämpning av LLUF sonderna införlivad med LC-MS skulle kunna användas i framtiden för att följa sjukdomens progression från saliv.
Protocol
1. Skapande av LLUF prober
- De polyetersulfon membran (2 cm 2) tätades med triangeln polypropylen paddlar (University of California, San Diego) genom limning membran med epoxi på gränsen till paddlar. En negativt laddad polyetersulfon-membran med en molekylvikt cut-off (MWCO) på 30 kDa användes.
- En Teflon fluorerad etylenpropylen röret (inre diameter / ytterdiameter, 0.35/0.50 cm) fästes till en cylinder utgång av en triangel polypropen paddel så LLUF sonden kan anslutas till en 20 ml spruta.
- Efter blötläggning av polyetersulfonmembran i human saliv i en odlingsskål (50 mm i diameter), var negativt tryck som skapas genom att dra tillbaka en spruta. Sprutan med negativt tryck for ultrafiltreringsprocessen för sampling proteiner från saliven.
- Sonderna steriliserades med 70% alkohol under natten före användningen. För att visa korrekt försegling, placerade vi LLUF sonder till en lösningning innehållande blå dextran (50 mg / ml) med en genomsnittlig molekylmassa av 2000 kDa för 2 timmar. Frånvaron av blå dextran i de insamlade proverna visade att inget läckage utvecklats under sond tillverkning och provtagning.
2. Saliv Collection
- Hela saliv samlades in från tre friska frivilliga (två hanar och en hona i åldrarna 20 och 40) tar inga mediciner, inga uppenbara tecken på gingivit eller hålrum 6.
- Efter sköljning av munnen med vatten, det hela salivprover samlades genom spottande, utan kemisk stimulering, i ett is-kylt kärl.
- Alla prover samlades och förvarades på is under insamlingen förfarandet.
- Omedelbart efter uppsamling, var saliv (200 pl) appliceras för att ta prover med LLUF prober. Den provtagning utfördes vid en 4 ° C rum.
- Saliv proteiner (1,0 pg / pl), med eller utan LLUF sond uppsamling var direkt utsattes för nano LC-massa spectrometry analys utan tryptisk digerering. Proteinkoncentrationer bestämdes med användning av en Bio-Rad Protein Assay 12.
3. NanoLC-LTQ MS Analysis
- De icke-digererade salivprover (5 pl) laddades direkt till fällan kolumnen i Eksigent NanoLC systemet genom den automatiska provtagningsanordningen, med användning av 100% buffert A (2% acetonitrile/0.1% myrsyra). Den NanoLC var on-line tillsammans med en Finnigan LTQ masspektrometer.
- Efter provsatsning och tvättning tillsattes ventilen stängs och en 500 nl / min linjär gradient levererades till fällan och separationen kolonn (10 cm i längd, 100 ^ m id, internt packade med Synergi 4 | im C18). Gradienten var från 0 till 50% buffert B (80% acetonitrile/0.1% myrsyra) under 45 min.
- De nanoLC-LTQ MS instrument som drivs i data beroende läge genom Xcalibur. MS / MS-spektra av de fyra starkaste MS joner ovan en intensitet av 1 x 10 5 uppsamlades med dynamisk uteslutningaktiverad och kollisionen energin satt till 35%.
- Varje prov kördes två gånger av NanoLC-LTQ MS-system. Prover från tre separata preparat, användes. Dessa peptider kan påvisas under tre separata prover anges i Supplemental tabellerna 1 och 2. Representativa för NanoLC-LTQ MS-spektra var som visas i fig 3.
4. Dataanalys och protein databassökning
- Varje RAW fil konverteras till en mzXML fil med Readw.exe.
- Den mzXML filen var ingången till en SEQUEST Sorcerer 2-system och sökte mot en människa databas som genereras från motsvarande National Center for Biotechnology Information (NCBI) protein databas med hjälp av icke-enzym specificitet. Massan tolerans prekursorjonen fastställdes till 1,5 Da. En molekylär massa av 16 Da sattes till metionin för differentiell sökning till kontot för oxidation.
- Efter SEQUEST sökning, var resultaten automatiskt filtreras, validerade end visas med PeptideProphet och ProteinProphet [Institutet för systembiologi (ISB)]. PeptideProphet uppskattar en omfattande sannolikhet (P) betyget som en peptid uppdrag är "korrekt" kontra "fel" på grunderna för IT: s SEQUEST poäng (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) och ytterligare information av varje identifierad peptid sekvens. ProteinProphet beräknas en sannolikhetspoängen 0 till 1 för varje protein på grundval av peptider som tilldelats till MS / MS-spektra.
- För att minimera falska positiva identifikationer vi använde stränga filterkriterier. Först är den minsta P poäng cutoff inställd på 0,8 för alla godkända peptid för att säkerställa en mycket låg fel (mycket mindre än 3%) och relativt god känslighet. För det andra måste alla peptider med> 0,8 P betyg har höga över korrelation (Xcorr) poäng samtidigt: 1.9, 2.2 och 3,0 för +1, +2 och +3 laddning.
5. Borttagning av orala bakterier med LLUF sonder
- För att bestämma förmågan hos LLUF prober för att avlägsnaorala bakterier, saliv före och efter LLUF sond Collection (avsnitt 3) spreds på agarplattor för bakteriell detektion.
- Aeroba bakterier odlades på en antibiotikafri Lauria-Bertani (LB)-agarplatta vid 37 ° C under en dag.
- Anaeroba bakterier odlades på en antibiotikafri Brucella-buljong agarplatta (bd, Sparks, MD) under anaeroba betingelser med användning av gas-Pak (BD Biosciences, San José, CA) vid 37 ° C under en dag.
6. Representativa resultat
1. Tillverkning av LLUF prober och provtagning saliv i en imiterade oral miljö
Om proven saliv kan utföras som suger en slickepinne, kommer förfarandet att undvika nedbrytning av spottade saliv i uppsamlingsanordningar 13-14. Viktigt blir det också möjligt att övervaka patienter dynamiskt och lokalt från orala kaviteter. Dessutom, om provberedning med saliv skulle kunna förenklas, skulle kliniker facil lättitate förfarandet för att påskynda sitt beslut på nästa klinisk drift. Masspektrometri är en av de mest känsliga tekniker för att detektera och även sekvensen proteiner på mycket kort tid. Har dock komplicerade förfaranden för provberedning hämmats använda denna teknik i klinik. Vidare är det känt att högre förekomst proteiner eller proteiner med höga molekylvikter i kliniska prover (t.ex. amylas i saliven) mask låg förekomst proteiner i masspektrometrisk analys 15-16. För att övervinna de hinder som nämns ovan, har vi utvecklat en klubba-liknande ultrafiltreringsanordning heter LLUF sonder (Figur 1). En negativt laddad polyetersulfonmembran med en MWCO på 30 kDa (figur 1 A, en) limmades till en polypropen paddel (figur 1 A, B). Det var placerad framför den LLUF sonden i syfte att filtrera bort större proteiner i saliv. Att efterlikna den humana orala miljön (figur 1 A, g) Tillsattes en svamp (Fig. 1 A, e) blötlades i saliv i en odlingsskål (figur 1 A, f). Efter fullständigt dra tillbaka sprutan (figur 1 A, d), startas filtrerades saliv som rör sig längs en ansluten slang (figur 1 A, c) och uppsamlades.
2. Identifiering av inhemska saliv peptidome med NanoLC-LTQ MS
Jämföra LC kromatogram, fann vi tydliga kromatogram av saliv före och efter LLUF provtagning (figur 2), vilket indikerar att det finns olika protein kompositioner i saliv efter LLUF provtagning. För att bestämma proteinkompositionerna, använde vi NanoLC-LTQ masspektrometri som är känt för att vara möjlighet att omedelbart sekvens peptider från en multipel protein blandning. Ännu viktigare är att förenkla provberedning för kliniska ändamål var helt saliv utan kemisk eller enzymatisk spjälkning ansökt om NanoLC-LTQ MS-analys. Oväntat, 131 peptider vire anges i osmält saliv (Supplemental tabell 1). Dessa peptider är fragment härledda från olika prolinrika proteiner, aktin, a-amylas, alfa 1-globin, p-globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymeriska immunglobulinreceptorn, satherin och S100A9. Tjugosex unika peptider identifierades i saliv efter filtrering med LLUF prober (kompletterande tabell 2). Dessa peptider är fragment härrör huvudsakligen från olika prolinrika proteiner. Peptider härledda från proteiner, såsom den polymeriska immunglobulinreceptorn (83,24 kDa) och a-amylas, kunde inte detekteras, vilket visar förmågan hos LLUF prober i avlägsnande av större och riklig proteiner. En MS / MS-spektrumet för den PFIAIHAEAESKL peptid motsvarande en inre peptid av a-amylas är visad i fig. 3A. Mest förbryllande, efter att ha tagit större proteiner, blev 18 av 26 sekvenserade peptider detekteras i LLUF sond-prov saliv (tabell1). Dessa 18 peptider härledda från prolinrika proteiner eller hypotetiska proteiner som slutade med en prolin (P) -. Glutamin (Q) (-PQ),-SR,-SP eller-PP C-terminalen figur 3B visade en MS / MS- spektrum av PQGPPQQGGHPRPP peptid som detekterades i LLUF sond-prov saliv. Peptiden kan vara härledd från prolin-rikt protein Haelll-subfamiljen 1 och 2 (Tabell 1).
Figur 1. Kompositionerna enligt LLUF prober och provtagning av hela saliv från efterlikna mänsklig munhålan Panel A: (a) ett semipermeabelt polyetersulfon med en COMV av 30 kDa, (b) en polypropen paddel, (c) en Teflon fluorerad etenpropen röret; (d) en 20 ml spruta Panel B:. en svamp (e) (en härmade tunga) blötlades i en odlingsskål (f) innehållande humant saliv för att skapaen artificiell human munhåla (g). Den resulterande negativa trycket som skapas genom att helt dra tillbaka en spruta driver den uppsamlade fluiden att röra sig längs en ansluten slang (pil) och i riktning mot en skapade utrymmet (pilspets) inom spruta. Bar: 2,0 cm.
Figur 2. Differentiell LC / MS / MS-kromatogram av saliv före och efter LLUF provtagning. Proteins (1,0 pg / pl) i humant helblod saliv filtrerades utan eller med en LLUF sond. Proteiner utan tryptisk digerering var direkt utsattes för NanoLC-LTQ MS som var konjugerad med en Eksigent Nano LC-system som beskrivits i Material och Metoder. De bas-topp kromatogram (med 44-MIM retentionstider) av saliv före (A) och efter (B) LLUF provtagning belystes.
Figur 3. Detekning av saliv peptidome genom NanoLC-LTQ MS sekvensering. Saliv proteiner före (A) och efter (B) sampling med LLUF prober analyserades genom NanoLC-LTQ MS såsom beskrivits i experimentella procedurer. Saliv peptidome härledd från naturligt humant saliv utan tryptisk digerering visades i Supplemental tabellerna 1 och 2. En peptid (PFIAIHAEAESKL) härrör från a-amylas uteslutande detekterades i ett salivprov utan uttag med LLUF prober (A), visar att förmågan hos LLUF prober för att avlägsna stora proteiner. Många peptider med PQ-SR,-SP eller-PP C-terminalerna var endast i proverna efter prober ultrafiltrering LLUF. En (PQGPPQQGGHPRPP) av peptider härledda från olika prolinrika proteiner påvisades (B). MS / MS-spektra med karakteristisk "y" och "b" joner serien bekräftade identitet båda peptider.
<strong> Figur 4. Borttagning av orala bakterier med hjälp av under LLUF sonder. En LLUF prob konstruerades såsom beskrivits i Material och metoder. Sonden var placerad i mänsklig saliv i en imiterade oral miljö (Figur 1). Sprutan vid slutet av LLUF sond avlägsnades för att skapa ett negativt tryck som drev ultrafiltreringsprocessen för saliv provtagning. Under provtagning, korsade hel saliv selektivt genom polyetersulfon membranet och ackumuleras i en spruta. Hela saliv före provtagning med en LLUF sond tjänade som en kontroll. Saliv (10 pl) före och efter LLUF sond provtagning spreds på agarplattor för bakteriell detektion Panel A:. Saliv med (+ LLUF) och utan (+ LLUF) LLUF sond provtagning spreds sida vid sida på en antibiotikafri LB-agarplatta vid 37 ° C under en dag Panel B:. Saliv med och utan LLUF sond provtagning spreds på en antibiotikafri Brucella-buljong agarplattaunder anaeroba betingelser med användning av gas-Pak (BD Biosciences, San José, CA) vid 37 ° C under en dag. Bakterier inte växa på agarplattor spridda med LLUF sond-prov saliv, vilket visar förmågan hos LLCF prober i eliminera aerob liksom anaeroba orala bakterier. Bar: 1,0 cm.
| Peptidsekvensen / uppmätt peptidmassan | Accessionsnummer | Namn | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485,3 | gi | 41349484 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 2 föregångare |
| gi | 41349482 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 1 föregångare | ||
| gi | 60301553 | Proline-rika protein BstNI underfamilj 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576,9 | gi | 4826944 | Proline-rika protein Haelll underfamilj 2 |
| gi | 9945310 | Proline-rika protein Haelll underfamiljen 1 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126,2 | gi | 37537692 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 4 föregångare |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028,3 | gi | 113423660 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077,8 | gi | 113423262 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein isoform 5 |
| gi | 41349482 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 1 föregångare | ||
| gi | 60301553 | Proline-rika protein BstNI underfamilj 2 | ||
| gi | 113423663 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein | ||
| gi | 41349484 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 2 föregångare | ||
| gi | 41349486 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 3 föregångare | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918,5 | gi | 9945310 | Proline-rika protein Haelll underfamiljen 1 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131,3 | gi | 113423660 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | gi | 113423663 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein |
| gi | 41349482 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 1 föregångare | ||
| gi | 113423262 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein isoform 5 | ||
| gi | 60301553 | Proline-rika protein BstNI underfamilj 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866,6 | gi | 4826944 | Proline-rika protein Haelll underfamilj 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713,8 | gi | 9945310 | Proline-rika protein Haelll underfamiljen 1 |
| gi | 4826944 Proline-rika protein Haelll underfamilj 2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083,1 | gi | 9945310 | Proline-rika protein Haelll underfamiljen 1 |
| gi | 4826944 | Proline-rika protein Haelll underfamilj 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512,6 | gi | 4826944 | Proline-rika protein Haelll underfamilj 2 |
| gi | 9945310 | Proline-rika protein Haelll underfamiljen 1 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720,2 | gi | 113423262 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein isoform 5 |
| gi | 113423663 | FÖRUTSEDDA: hypothetical proteinet | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450,1 | gi | 9945310 | Proline-rika protein Haelll underfamiljen 1 |
| gi | 4826944 | Proline-rika protein Haelll underfamilj 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791,1 | gi | 4826944 | Proline-rika protein Haelll underfamilj 2 |
| gi | 9945310 | Proline-rika protein Haelll underfamiljen 1 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186,9 | gi | 113423262 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein isoform 5 |
| gi | 41349482 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 1 föregångare | ||
| gi | 60301553 | Proline-rika protein BstNI underfamilj 2 | ||
| gi | 113423663 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein | ||
| gi | 41349484 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 2 föregångare | ||
| gi | 41349486 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 3 föregångare | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720,3 | gi | 113423663 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein |
| gi | 41349482 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 1 isoform 1 föregångare | ||
| gi | 113423262 | FÖRUTSEDDA: hypotetiskt protein isoform 5 | ||
| gi | 60301553 | Proline-rika protein BstNI underfamilj 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870,9 | gi | 37537692 | Proline-rika protein BstNI underfamiljen 4 föregångare |
Tabell 1. Peptider enbart detekteras i LLUF samlas in prover.
Kompletterande tabell 1. Klicka här för att se extra tabell 1 .
Kompletterande tabell 2. Klicka här för att se extra tabell 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har funnit att många peptidfragment existera i human saliv osmält. Dessa peptidfragment är derivat från olika former av prolinrika proteiner, aktin, a-amylas, alfa 1-globin, p-globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymeriska immunglobulinreceptorn, satherin, S100A9. Det kan finnas många faktorer som bidrar till produktion av peptider med obestämda klyvningsställen. Till exempel kan vissa peptidfragment vara naturligt närvarande i humant helblod saliv. Många peptider med PQ C-terminalerna identifierades (tabell 1 och Supplemental tabellerna 1 och 2). Prolinrika proteiner kan klassificeras som sura, basiska eller glykosylerade proteiner och kodas av sex gener klustrade i en enda region 17. Mer än 30 olika prolinrika proteiner beror allelvariation, differential RNA splitsning, proteolytisk bearbetning och post-translationella modifieringar 17. Efter sekretion, den sura prolinrika protEins snabbt bifogas tandytor och försämrade till potentiella medfödda immunitet peptider med plack proteolys 18-19. Såväl gram-negativa och gram-positiva bakterier uttrycka en mångfald av glykosidaser och proteaser 18. Det har rapporterats att sura prolinrika proteiner kan nedbrytas in potentiella medfödda-immunitet-liknande peptider genom oral Streptococcus och Actinomyces arter 18. Den Glutamin (Gin) - Glycin (Gly) klyvning är biologiskt kritisk med avseende på bakteriell nedbrytning av saliv sura prolinrika proteiner och produktion av en bakterie-bindning-PQ C-terminalen 18, 20-22. Bindningen av PQ ändstationer prolinrika proteiner till bakterier bekräftades genom en in vitro-experiment med användning av en syntetisk RGRPQ pentapeptid 18. I samförstånd med våra uppgifter var SJ Fisher grupp kunna identifiera flera peptider med-PQ C-terminalerna i osmält mänskliga parotid saliv 23,tyder flera peptider med-PQ C-terminalerna kan inhemska existera i människans hela saliv. Human saliv innehåller multipla peptider med PQ C-terminalerna, vilka kan fungera som medfödda-immunitet-liknande peptider 18, 19. När orala bakterier är närvarande, kan prolinrika proteiner bryts omedelbart ner till olika fragment med PQ C-terminalerna för att effektivt döda bakterierna.
En annan orsak till peptidfragment som finns i osmält saliv är att några av de endogena proteaser som finns i sin helhet saliv kan vara aktiva under beredningen av proverna 24-25. Klyvningen sker i dessa proteiner genom endogena proteaser i munhålan fortsatte sannolikt innan masspektrometrianalys. Till exempel kan mucin klyvas med saliv proteas ner till en mindre form som är mer kompetent i bakteriell clearance 26. Det är också möjligt att proteaser från orala bakterier kan sönderdelas de orala proteiner före eller efter saliv collection. Det har dokumenterats att flera saliv proteiner kan hackas av proteaser från Oral Streptococcus och Actinomyces arter 27-29.
Den semi-permeabla membran är en nyckelkomponent i LLUF sonder. Membranet är nödvändigt att selektivt ta bort större ämnen, inklusive proteiner, orala bakterier och skräp. LLUF fungerar som en selektiv barriär som tillåter passage av vissa komponenter och avvisar andra komponenter inom en artificiell munhålan. Det semi-permeabla membranet möjliggör liten molekyl att passera genom membranet, medan ej makromolekyler. Färska uppgifter från vårt laboratorium visade att LLUF sonder effektivt kan ta bort både aeroba och anaeroba orala bakterier (Figur 4). Salivprov före och efter samling med LLUF sonder spreds ut på antibiotika-fria agarplattor och inkuberades under aeroba och anaeroba förhållanden. Bakterier inte växa när agarplattor spreds med LLUF probe-samplade saliv, visar förmåga LLUF sönder i avlägsna aeroba och anaeroba orala bakterier. Vi sökte alla spektra med ett mänskligt databas som inte innehöll protein databaser av mänskliga orala mikrober. Identifiering av proteome / peptidome av orala mikrober kommer att bli möjligt om en omfattande protein databas med alla orala mikrober kan fastställas. En organisk (polyetersulfon) membran användes för att tillverka de LLUF prober. Även membranet var känd för att ha en 30 kDa MWCO, beroende på provtagning prestanda även om andra faktorer såsom interaktionen av saliv proteiner till negativa laddningar på membranytan 30. Förändringarna i pH-värden och temperaturer samt protein komplexitet i munhålan påverkar också provtagning prestanda. Våra data visade att 18 peptider var enbart närvarande i LLUF prob-prov saliv (tabell 1). Peptiderna slutade med-PQ,-SR,-SP eller-PP C-terminalerna i huvudsak härrör från prolinrika proteins. Det har rapporterats att nätet negativt laddade prolinrika proteiner visas en stark adsorption till en negativt laddad yta 31.
Sammanfattningsvis kan i ett försök att detektera specifika grupper av proteiner i framtiden, semi-permeabla membran framför LLUF prober ändras med användning av olika porstorlekar och material som har olika ytladdningar. Exempelvis nanofiltreringsmembran med porstorlekar sträcka sig från 0,05 mikron till 1 nm kan separera virus från salivprover 32. LLUF prober kan också användas för övervakning av koncentrationen av olika substanser, såsom glukos och laktat i salivprover. Även ultrafiltreringsmembran har utnyttjat proteinseparation via centrifugalultrafiltrering 33, har de sällan använts för att samla proteiner via applicering av negativt tryck över en semi-permeabelt membran. Länka LLUF sonderna med avancerad masspektrometer som fourier transform jon cyklotron resonans (FT-ICR) tillåta identifiering av intakta saliven proteiner 34-35. Anmärkningsvärt kan on-line analys av dynamiska mönster av saliv proteom och peptidome vara avgörande för den kliniska tillämpningen av LLUF sonder. Efter samling med LLUF sonder, var många peptidfragment som härrör från prolinrika proteiner identifieras från osmält hela saliv. Proline-rika proteiner kan interagera med orala bakterier för att påverka utvecklingen av karies 36 och kan vara betydande för att skydda slemhinnorna från virusinfektion 37. Vidare har det dokumenterats att uttrycket av prolinrika proteiner ändrades i patienter med reumatoid artrit 38. Dessa studier stödjer starkt att prolinrika proteiner som samlats in av LLUF sonder kan fungera som biomarkörer för att övervaka olika mänskliga sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 och R21-I58002-01). Vi tackar C. Niemeyer för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
