Summary
Учитывая, слюна выборки для будущего клинического применения, как леденец на палочке, ультрафильтрации (LLUF) зонда было сфабриковано, чтобы уместиться в ротовой полости человека. Прямой анализ слюны на непереваренные NanoLC-КТЛ масс-спектрометрии продемонстрировали способность датчиков LLUF для удаления крупных белков и белков высокой численности и сделать низкими обильные пептиды более обнаружить.
Protocol
1. Создание датчиков LLUF
- Полиэфирсульфона мембраны (2 см 2) были закрыты с треугольником полипропилена манипуляторы (Университет Калифорнии, Сан-Диего) склеиванием мембран с эпоксидной на границах весла. Отрицательно заряженные полиэфирсульфона мембраны с молекулярной массой отсечки (MWCO) в 30 кДа был использован.
- Тефлоновые трубки фторированных пропилена этилена (внутренний диаметр / наружный диаметр, 0.35/0.50 см) был прикреплен к цилиндру выхода весло полипропилена треугольник, поэтому зонд LLUF может быть подключен к 20 мл шприца.
- После замачивания мембран полиэфирсульфона в слюне человека в культуре блюдо (50 мм), отрицательное давление было создано снятии шприца. Шприц с отрицательным давлением вынудили ультрафильтрации процесс отбора проб из белков слюны.
- Зонды были стерилизованы с 70% спиртом ночь перед использованием. Чтобы убедиться в их исправности уплотнения, мы позиционировали LLUF зондов в растворахТион содержащие синий декстран (50 мг / мл) со средней молекулярной массой 2000 кДа в течение 2 часов. Отсутствие синего декстрана в собранных образцов показал, что никаких утечек разработана при изготовлении зонда и отбора проб.
2. Слюна коллекции
- Всего слюны были собраны из трех здоровых добровольцев (двое мужчин и одна женщина в возрасте 20 и 40), не принимающих лекарства, без явных признаков гингивита или полости 6.
- После полоскания полости рта водой, все образцы слюны были собраны плеваться, без химической стимуляции, в охлажденной льдом судна.
- Все образцы были объединены и держится на льду во время процедуры взыскания долга.
- Сразу же после сбора, слюны (200 мкл) был применен для отбора проб с LLUF зондов. Отбор проб проводили при 4 ° C комнате.
- Слюна белков (1,0 мкг / мкл) с или без взимания LLUF зонд непосредственно подвергаются нано LC-массы сpectrometry анализ без триптического пищеварения. Концентрации белка определяли с помощью Bio-Rad белка Анализ 12.
3. NanoLC-КТЛ MS Analysis
- ООН-переваривается слюны (5 мкл) непосредственно загружены в ловушку колонке Eksigent NanoLC системы автоматического пробоотборника, используя 100% буфера (2% acetonitrile/0.1% муравьиной кислоты). NanoLC была на линии в сочетании с масс-спектрометра Finnigan КТЛ.
- После загрузки образца и промывки, клапан был включен и 500 Нл / мин линейный градиент был доставлен в ловушку и разделительной колонки (10 см в длину, 100 мкм идентификатор, в доме упакован Synergi 4 мкм C18). Градиент от 0 до 50% буфера В (80% acetonitrile/0.1% муравьиной кислоты), в 45 мин.
- NanoLC-КТЛ MS инструменты работают в режиме данные, зависящие от Xcalibur. MS / MS спектры четырех сильнейших ионов MS выше интенсивность 1 × 10 5 были собраны с динамическим исключениевключена и энергии столкновения установлен на 35%.
- Каждый образец был запущен дважды NanoLC-КТЛ системы MS. Образцы из трех отдельных препаратов были использованы. Эти пептиды обнаруживаются в трех отдельных образцах были перечислены в Дополнительных таблицах 1 и 2. Представитель NanoLC-КТЛ MS спектров показано на рисунке 3.
4. Анализ данных и поисковых баз данных белков
- Каждый RAW файл конвертируется в файл с помощью mzXML Readw.exe.
- MzXML файл был введен в философский SEQUEST 2 системы и искали против человеческой базы данных, генерируемых соответствующий Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) белка базы данных с использованием не-фермент специфику. Масса толерантности предшественником ионных был установлен на уровне 1,5 Da. Молекулярной массой 16 Да был добавлен в метионин для дифференциального поиска для учета окисления.
- После SEQUEST поиска, результаты были автоматически фильтруется, проверяетсяг отображается PeptideProphet и ProteinProphet [Института системной биологии (МОБ)]. PeptideProphet оценивает всеобъемлющие вероятность (Р) счет, что пептид назначение "правильного" против "неправильных" на основе ее SEQUEST баллов (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) и дополнительную информацию о каждой пептидной последовательности определены. ProteinProphet вычислить вероятность шкале от 0 до 1 для каждого белка на основе пептидов назначен MS / MS спектров.
- Чтобы свести к минимуму ложных срабатываний идентификации использовались строгие критерии фильтрации. Во-первых, минимальное количество баллов P отсечка установлена на уровне 0,8, для всех обслуживаемых пептид для обеспечения очень низкого ошибки (гораздо меньше, чем 3%) и достаточно хорошей чувствительностью. Во-вторых, все пептиды с> 0,8 P счет должен иметь высокую кросс-корреляцию (Xcorr) забивает гол в то же время: 1.9, 2.2 и 3.0 +1, +2, +3 и бесплатно.
5. Удаление бактерий ротовой полости с LLUF зонды
- Для определения возможности зондов LLUF удалитьбактерии полости рта, слюне до и после LLUF зонд коллекции (раздел 3) было распространено на агаром для бактериальных обнаружения.
- Аэробные бактерии выращивались на антибиотик без Лория-Бертани (LB) агар пластин при 37 ° С в течение одного дня.
- Анаэробных бактерий, выращенных на антибиотик без Brucella бульон агар пластины (BD, Sparks, MD) в анаэробных условиях с использованием газо-Пак (BD Biosciences, San Jose, CA) при 37 ° C в течение одного дня.
6. Представитель Результаты
1. Изготовление датчиков LLUF и отбор проб слюны в ротовой полости подражали
Если отбор проб слюны может быть выполнена как сосать леденец, процедура позволит избежать деградации плюнул слюной в коллекцию устройств 13-14. Важно отметить, что также станет возможным для наблюдения за пациентами динамично и локально полости рта. Кроме того, если пробоподготовки использованием слюны может быть упрощена, врачи бы легко Facilitate процедуру ускорить их решение на следующей клинической работы. Масс-спектрометрия является одним из наиболее чувствительных методов обнаружения и даже последовательность белков в очень короткий период времени. Тем не менее, сложные процедуры для подготовки проб препятствовали использовании этого метода в клинике. Кроме того, известно, что выше обилие белков или белков с большим молекулярным весом в клинических образцов (например, амилазы в слюне) маска низкой белков изобилия в масс-спектрометрического анализа 15-16. Чтобы преодолеть препятствия уже упоминалось выше, мы разработали леденец, как ультрафильтрация устройство с именем LLUF зондов (рис. 1). Отрицательно заряженные полиэфирсульфона мембраны с MWCO на 30 кДа (рис. 1А,) был приклеен к полипропилена весло (рис. 1а, б). Он был расположен в передней части датчика LLUF с целью фильтрации больше белков в слюне. Для имитации человеческой среды полости рта (рис. 1А, г), Губки (рис. 1А, е), была пропитана слюной в культуре блюдо (рис. 1А, е). После полного снятия шприца (рис. 1А, г), фильтруют слюной начал двигаться вдоль связано трубки (рис. 1а, в) и была собрана.
2. Определение коренных peptidome слюны NanoLC-КТЛ MS
Сравнение LC хроматограмм, мы обнаружили различные хроматограммы слюны до и после LLUF выборки (рис. 2), указав, что существуют различные композиции белков в слюне после отбора проб LLUF. Для определения белка композиции мы использовали NanoLC-КТЛ масс-спектрометрии, который, как известно, чтобы иметь возможность оперативно последовательность пептидов из смеси нескольких белков. Более того, для упрощения подготовки образцов для клинических целей, весь слюной без химического или ферментативного пищеварения был применен для NanoLC-КТЛ анализа MS. Неожиданно, 131 пептидов, мыповторно выявленных в непереваренной слюны (Справочная таблица 1). Эти пептиды являются фрагментами, полученные из различных пролин богатый белками, актин, альфа-амилазы, альфа-1 глобина, бета-глобина, histain 1, кератин 1, муцина 7 полимерных рецептора иммуноглобулина, satherin и S100A9. Двадцать шесть уникальных пептиды были выделены в слюне после фильтрации с зондами LLUF (Справочная таблица 2). Эти пептиды являются фрагментами в основном из различных пролин-богатыми белками. Пептиды, полученные из белков, таких как полимерные рецептора иммуноглобулина (83,24 кДа) и альфа-амилаза, было обнаружить, что свидетельствует о возможности LLUF зондов удаление крупных и обильных белков. MS / MS спектр PFIAIHAEAESKL пептид, соответствующий внутренний пептида альфа-амилазы показано на рисунке 3А. Еще более удивительно, после удаления больше белков, 18 из 26 пептидов последовательный стал обнаруживается в LLUF зонд-пробы слюны (табл.1). Эти 18 пептиды, полученные из пролин-богатых белками или гипотетические белки, которые закончились пролина (P) -. Глютамин (Q) (-Ро),-SR, SP-или-ПП С-конца Рисунок 3B показали, MS / MS Спектр пептид PQGPPQQGGHPRPP, который был обнаружен в LLUF зонд-пробы слюны. Пептид может быть получен из пролин-богатых белком HaeIII подсемейства 1 и 2 (табл. 1).
Рисунок 1. Композиции LLUF зондов и выборки весь слюной от человека имитировать полости рта группы.: (А) полупроницаемую полиэфирсульфона с MWCO 30 кДа, (б) полипропилен весла; (с) тефлоновой трубкой фторированных пропилена этилена; (г) 20 мл шприц Группа B:. губку (е) (передразнил язык) была пропитана в культуре блюдо (F), содержащий слюне человека для созданияискусственных человеческих полости рта (г). В результате отрицательного давления, создаваемого полностью снятии шприца диски собрали жидкость двигаться по трубе подключены (стрелка) и к созданным пространства (стрелки) в шприц. Бар: 2,0 см.
Рисунок 2. Дифференциальные LC / MS / MS хроматограмм слюны до и после отбора проб LLUF. Белки (1,0 мкг / мл) в слюне человека все были отфильтрованы или без датчика LLUF. Белки без триптического пищеварения непосредственно подвергаются NanoLC-КТЛ MS, что было сопряжено с системой Eksigent Nano LC, как описано в Материалы и методы. Базовый пик хроматограммы (с 44-мим время удерживания) слюны до (А) и после (б) LLUF выборки были проиллюстрированы.
Рисунок 3. ДетекторовТион слюны peptidome по NanoLC-КТЛ MS последовательности. белков слюны до (А) и после (б) отбор проб с зондами LLUF были проанализированы NanoLC-КТЛ MS, как описано в экспериментальной процедуры. Слюна peptidome из натуральных слюне человека без триптического пищеварения были продемонстрированы в Дополнительных таблицах 1 и 2. Пептида (PFIAIHAEAESKL), полученных из альфа-амилазы исключительно обнаружены в слюне без взимания с зондами LLUF (A), что свидетельствует о том, что возможности зондов LLUF в удалении крупных белков. Многие пептиды с PQ-,-SR, SP-или-ПП С-концов были только в образцах после ультрафильтрации LLUF зондов. Один (PQGPPQQGGHPRPP) пептиды, полученные из различных пролин богатый белками показали (B). MS / MS спектры с характерным "у" и "б" ионов серии подтвердили личность и пептидов.
<сильный> Рисунок 4. Удаление бактерий ротовой полости во время использования LLUF зондов. Зонд LLUF был построен, как описано в материалах и методах. Зонд был помещен в слюне человека в подражали среды полости рта (рис. 1). Шприц в конце LLUF зонд был снят для создания отрицательного давления, которые привели процесс ультрафильтрации для слюны выборки. Во время отбора проб, весь слюной пересек выборочно через мембрану полиэфирсульфона и накопленных внутри шприца. Всего слюны до отбора проб с зондом LLUF служили в качестве контроля. Слюна (10 мкл) до и после отбора проб LLUF зонд был распространен на агаром для обнаружения бактериальной группы. Слюна с (+ LLUF) и без (+ LLUF) LLUF пробоотборника было распространено бок о бок на антибиотик без LB агар пластин при 37 ° С в течение одного дня группа B:. слюны и без отбора проб LLUF зонд был распространен на антибиотик без Brucella пластины агара бульономв анаэробных условиях с использованием газо-Пак (BD Biosciences, San Jose, CA) при 37 ° C в течение одного дня. Бактерии не растут на агаром распространяться с LLUF зонд-пробы слюны, что свидетельствует о возможности LLCF зондов в ликвидации аэробных и анаэробных бактерий ротовой полости. Бар: 1,0 см.
| Пептид последовательности / Измеренные массы пептида | Присоединение номер | Имя | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485,3 | ги | 41349484 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 2 предшественника |
| ги | 41349482 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 1 предшественника | ||
| ги | 60301553 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576,9 | ги | 4826944 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2 |
| ги | 9945310 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126,2 | ги | 37537692 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 4 предшественник |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028,3 | ги | 113423660 | Предсказал: гипотетический белок |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077,8 | ги | 113423262 | Предсказал: гипотетический изоформы белка 5 |
| ги | 41349482 | Proline богатые белком BstН.И. подсемейства 1 изоформы 1 предшественника | ||
| ги | 60301553 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 2 | ||
| ги | 113423663 | Предсказал: гипотетический белок | ||
| ги | 41349484 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 2 предшественника | ||
| ги | 41349486 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 3 предшественник | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918,5 | ги | 9945310 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131,3 | ги | 113423660 | Предсказал: гипотетический белок |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | ги | 113423663 | Предсказал: гипотетический белок |
| ги | 41349482 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 1 предшественника | ||
| ги | 113423262 | Предсказал: гипотетический изоформы белка 5 | ||
| ги | 60301553 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866,6 | ги | 4826944 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713,8 | ги | 9945310 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1 |
| ги | 4826944 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083,1 | ги | 9945310 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1 |
| ги | 4826944 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512,6 | ги | 4826944 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2 |
| ги | 9945310 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720,2 | ги | 113423262 | Предсказал: гипотетический изоформы белка 5 |
| ги | 113423663 | Предсказал: гигипотетических белков | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450,1 | ги | 9945310 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1 |
| ги | 4826944 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791,1 | ги | 4826944 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2 |
| ги | 9945310 | Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186,9 | ги | 113423262 | Предсказал: гипотетический изоформы белка 5 |
| ги | 41349482 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 1 предшественника | ||
| ги | 60301553 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 2 | ||
| ги | 113423663 | Предсказал: гипотетический белок | ||
| ги | 41349484 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 2 предшественника | ||
| ги | 41349486 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 3 предшественник | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720,3 | ги | 113423663 | Предсказал: гипотетический белок |
| ги | 41349482 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 1 предшественника | ||
| ги | 113423262 | Предсказал: гипотетический изоформы белка 5 | ||
| ги | 60301553 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870,9 | ги | 37537692 | Proline богатые белком BstNI подсемейства 4 предшественник |
Таблица 1. Пептиды были обнаружены только в LLUF-проб.
Справочная таблица 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительной таблице 1 .
Справочная таблица 2. Щелкните здесь для просмотра дополнительной таблице 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы обнаружили, что многие пептидные фрагменты существуют в человеческой слюне непереваренной. Эти пептидные фрагменты, являются производными от различных форм пролин-богатых белков, актина, альфа-амилазы, альфа-1 глобина, бета-глобина, histain 1, кератин 1, муцина 7 полимерных рецептора иммуноглобулина, satherin, S100A9. Там может быть много факторов, влияющих на производство пептиды с неопределенным сайты расщепления. Например, некоторые пептидные фрагменты могут быть естественным образом присутствуют в человеческой слюне целом. Многие пептиды с PQ-C-концов были определены (табл. 1 и Справочная таблицах 1 и 2). Proline богатой белками могут быть классифицированы как кислые, основные и гликозилированного белка и кодируются шесть генов сосредоточены в одном регионе 17. Более тридцати различных пролин-богатых белков в результате аллельных вариаций, дифференциальные РНК сплайсинга, протеолитической обработки и пост-трансляционной модификации 17. После выделения, кислый пролин-богатых протEins быстро прикреплены к поверхности зубов и деградировали в потенциальную врожденный иммунитет, пептиды зубной налет протеолиза 18-19. Оба грамотрицательных и грамположительных бактерий выражать различные гликозидазами и протеаз 18. Сообщается, что кислая пролин-богатых белков может снизиться в потенциальную врожденный иммунитет, подобные пептиды устной стрептококки и Actinomyces видов 18. Глутамин (Gln) - глицина (Gly) расщепление биологически критических по отношению к бактериальной деградации слюне кислая пролина богатые белками и производство бактерий связывания PQ С-концом 18, 20-22. Связывание-PQ концов пролина богатые белками бактерий было подтверждено в лабораторных эксперимент с использованием синтетических RGRPQ пентапептид 18. В соответствии с нашим данным, группа SJ Фишера удалось выявить несколько пептидов с PQ-С-концы в непереваренной человека околоушной слюной 23предлагая несколько пептидов с PQ-C-концов может исконно существует в человеческой слюне целом. Человека слюна содержит несколько пептидов с PQ-С-концы, которые могут функционировать как врожденный иммунитет, подобные пептиды, 18, 19. Когда бактерии полости рта присутствуют, пролин-богатых белков может мгновенно разрушить различные фрагменты с PQ-C-концов для того, чтобы эффективно убить бактерии.
Еще одна причина пептидные фрагменты, существующие в непереваренной слюны, что некоторые из эндогенных протеаз, присутствующих в слюне целом может оставаться активным в течение 24-25 пробоподготовки. Расщепление происходит в эти белки эндогенных протеаз в полости рта, вероятно, продолжалось до масс-спектрометрического анализа. Например, муцина может расщепляться слюнных протеазы до меньшего форме, которая более компетентна в бактериальную очистку 26. Возможно также, что протеазы из бактерий ротовой полости может расщеплять белки устные до или после слюны Collectioл. Документально подтверждено, что некоторые белки слюны может быть нарезанной протеаз из устных и Streptococcus Actinomyces вид 27-29.
Полупроницаемую мембрану является ключевым компонентом LLUF зондов. Мембраны необходимо избирательно удалять больше веществ, включая белки, бактерии полости рта и мусора. LLUF действует как избирательный барьер, который разрешает прохождение определенных компонентов и отвергает другие компоненты искусственной полости рта. Полупроницаемую мембрану позволяет небольшой молекулы проходят через мембрану, исключая макромолекул. По последним данным нашей лаборатории, показали, что LLUF зонды могут эффективно удалить аэробных и анаэробных бактерий ротовой полости (рис. 4). Образцы слюны до и после сбора с датчиков LLUF были распространены на антибиотики без пластин агар и инкубируют в аэробных и анаэробных условиях. Бактерии не расти, когда агаром были распространены с LLUF зонд-пробы слюны, что свидетельствует о возможности LLUF зондов в удалении аэробные и анаэробные бактерии полости рта. Мы искали все спектры с человеческим базу данных, которая не включает белок базы данных человека устные микробов. Идентификация протеома / peptidome устной микробов станет возможным, если всеобъемлющая база данных белков с все устные микробов может быть установлено. Органические (полиэфирсульфона) мембраны, используемые для изготовления LLUF зондов. Несмотря на то, мембранные, как известно, 30 кДа MWCO, производительность выборки также зависит от других факторов, таких как взаимодействие слюне белки отрицательные заряды на поверхности мембраны 30. Изменения в значениях рН и температуры, а также белка сложности в полости рта также влияют на производительность выборки. Наши данные показали, что 18 пептидов были исключительно присутствует в LLUF зонд-пробы слюны (табл. 1). Пептиды закончился, PQ,-SR, SP-или-ПП С-концы получены главным образом из пролин-богатых рroteins. Сообщается, что чистая отрицательно заряженных пролин-богатых белков отображается активная адсорбция отрицательно заряженной поверхности 31.
Таким образом, в попытке обнаружить определенные группы белков в будущем, полупроницаемых мембран перед зондами LLUF могут быть изменены с помощью различных размеров пор и материалов, которые имеют разные заряды поверхности. Например, нанофильтрации мембраны с размером пор в диапазоне от 0,05 мкм до 1 нм можно выделить вирусы из слюны 32. LLUF датчиков также может применяться для контроля концентрации различных веществ, таких как глюкозы и лактата в слюне. Несмотря на то, ультрафильтрации мембраны использовали разделения белков с помощью центробежной ультрафильтрации 33, они редко используются для сбора белков путем применения отрицательного давления через полупроницаемую мембрану. Связь LLUF датчиков с расширенными масс-спектрометра, такие как Фурье тransform ионного циклотронного резонанса (FT-ICR) может позволить определение интактного слюне белки 34-35. В частности, он-лайн анализ динамических моделей слюны протеома и peptidome может иметь жизненно важное значение для клинического применения датчиков LLUF. После сбора с датчиков LLUF, многие пептидные фрагменты, полученные от пролин-богатых белков были идентифицированы все непереваренные слюны. Proline богатые белки могут взаимодействовать с устным бактерии влияют на развитие кариеса зубов 36 и может быть значительным в защите слизистой оболочки от поверхности вирусной инфекции 37. Кроме того, было документально подтверждено, что выражение пролин-богатых белков был изменен в пациентов с ревматоидным артритом 38. Эти исследования полностью поддерживаем, что пролин-богатых белков собраны LLUF зондов могут служить в качестве биомаркеров для мониторинга различных заболеваний человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 и R21-I58002-01). Мы благодарим С. Нимейер за критическое чтение рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
