Summary
Gelecekteki klinik uygulama için tükürük örnekleme göz önüne alındığında, bir lolipop gibi ultrafiltrasyon (LLUF) prob insan oral kavite sığacak şekilde imal edilmiştir. NanoLC-LTQ kütle spektrometresi tarafından sindirilmemiş tükürük Direkt analizi büyük proteinler ve yüksek bolluk proteinler kaldırmak ve düşük bol peptidler daha tespit yapmak LLUF probların yeteneğini göstermiştir.
Abstract
Insan tükürük proteom ve peptidome 1-2 ortaya sürülmüş olsa da onlar majorly triptik tükürük proteinleri sindirir identifiye edildi. Insan tükürük yerli peptidler, hastalığın tanısında hastalığın ilerlemesini tahminde ve terapötik etkinlik izlenmesi için potansiyel değerlerini sağlamak yana eksojen enzimler ile önceden sindirim olmadan insan tükürük yerli peptidome belirlenmesi, önem kazanmaktadır. Uygun örnekleme insan yerli tükürük peptidome belirlenmesi geliştirilmesi için önemli bir adımdır. 3-4 enkaz kaldırmak için santrifüj içeren insan tükürük örnekleme Geleneksel yöntemler çok zaman alıcı klinik kullanım için geçerli olması olabilir. Ayrıca, santrifüj enkaz kaldırma enfekte patojenlerin en temiz ve genellikle düşük bolluk peptidome belirlenmesine engel yüksek bolluk proteinleri kaldırmak mümkün olabilir.
Konvansiyonel proteomik yaklaşımlar priin-jel sindirim ile konjugasyon Marily kullanan iki boyutlu jel elektroforezi (2-DE) jeller birçok tükürük proteinleri 5-6 belirleme yeteneğine sahiptirler. Ancak, bu yaklaşım genellikle düşük bolluk peptid / protein tespit etmek için yeterince duyarlı değildir. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) tabanlı proteomik önce 2-DE ayrımı olmadan proteinler tespit edebilir bir alternatiftir. Bu yaklaşım, yüksek hassasiyeti sağlasa da, genel olarak önceden Örnek ön-fraksiyonasyon 7 ve zor bir hale getirir klinik kullanım için tripsin ile ön-sindirim ihtiyacı vardır.
Numune hazırlama nedeniyle kütle spektrometresi de engel aşmak için, kılcal ultrafiltrasyon (CUF) probları 8-11 denen bir teknik geliştirdik. Laboratuvar verileri CUF probları dinamik ve minimal invaziv şekilde 8 hayvanlarda çeşitli mikro gelen in vivo protein yakalama yeteneğine sahip olduğunu gösterdi -11. Negatif basınç numune alma sırasında çekilerek sadece şırınga ile oluşturulan bu yana hiçbir santrifüj gereklidir. LC-MS ile birlikte CUF probları başarıyla triptik-sindirilmiş protein 8-11 belirledik. Bu çalışmada, kolaylıkla insan oral kavite sığabilecek bir lolipop benzeri ultrafiltrasyon (LLUF) prob oluşturarak ultrafiltrasyon örnekleme tekniği yükseltti. Tripsin sindirim olmaksızın LC-MS ile doğrudan analizi keşif sahasında insan tükürük çeşitli proteinlerin elde edilen pek çok peptid fragmanları içerir gösterdi. LLUF problar ile tükürük Örnekleme santrifüj kaçınılması ama etkili birçok büyük ve yüksek bolluk proteinler kaldırıldı. Bizim kitle spektrometrik sonuçlar çok düşük bolluk peptitler LLUF problar ile daha büyük proteinler filtreleyerek sonra saptanabilir hale geldiği gösterilmiştir. Düşük bolluk tükürük peptidlerin Algılama kromatografisi ile birden fazla adım örnek ayrılması bağımsız oldu. Klinik uygulama için, LLUF probları dahilLC-MS ile d potansiyel tükürük hastalığın ilerlemesini izlemek için gelecekte kullanılabilir.
Protocol
1. LLUF Probları oluşturulması
- Polyethersulfone membranlar (2 cm 2) kürekler sınırları üzerine epoksi ile yapıştırma membranlar tarafından üçgen polipropilen kürekler (University of California, San Diego) ile mühürlendi. 30 kDa bir molekül ağırlığına cut-off (MWCO) ile bir negatif yüklü polyethersulfone membran kullanılmıştır.
- LLUF prob 20 ml'lik şırınga bağlanabilir böylece bir teflon florlu etilen propilen borusu (iç çap / dış çapı, 0.35/0.50 cm) bir üçgen polipropilen raket, silindir çıkış bağlanmıştır.
- Bir kültürün çanak (50 mm çap) insan tükürük içine polyethersulfone membran iliklerine sonra, negatif basınçlı bir enjektör çekilerek oluşturuldu. Negatif basınç ile şırınga tükürük proteinleri örnekleme ultrafiltrasyon sürecini sürdü.
- Probları kullanmak gece önce% 70 alkol ile sterilize edildi. Uygun sızdırmazlık göstermek için, bir çözüm haline LLUF probları konumlandırılmış2 saat süreyle 2000 kDa arasında bir ortalama molekül ağırlığına sahip mavi dekstran (50 mg / ml) içeren TION. Toplanan örneklerde mavi dekstran yokluğu sızıntı probu imalat ve örnekleme sırasında geliştiğini gösteriyordu.
2. Tükürük Koleksiyonu
- Tüm tükürük gingivitis veya boşluklar 6 hiçbir belirgin belirtileri ile, herhangi bir ilaç alarak üç sağlıklı gönüllüler (iki erkek ve yaşları 20 ile 40 arasında bir kadın) toplanmıştır.
- Su ile yıkandıktan sonra ağız, bütün tükürük örnekleri, bir buz ile soğutulan kabına, kimyasal uyarımı olmaksızın, tükürme ile toplandı.
- Bütün numuneler toplanması işlemi sırasında toplanmış ve buz üzerinde tutuldu.
- Hemen toplandıktan sonra, tükürük (200 ul) LLUF problar ile örnekleme uygulanmıştır. Bir numune 4 ° C oda sıcaklığında yapıldı.
- LLUF prob koleksiyonu ile veya olmadan Tükürük proteinlerinin (1.0 mikrogram / ml) doğrudan nano LC-kitle s tabi tutuldutriptik sindirim olmadan pectrometry analizi. Protein konsantrasyonları, bir Bio-Rad Protein Assay 12 kullanılarak belirlenmiştir.
3. NanoLC-LTQ MS Analizi
- Un-sindirilmiş tükürük (5 ul) doğrudan% 100 tamponu kullanılarak, otomatik örnekleyici tarafından Eksigent NanoLC sisteminin tuzağı kolonuna yüklendi A (% 2 acetonitrile/0.1% formik asit). NanoLC on-line bir Finnigan LTQ kütle spektrometresi ile birleştirilir.
- Örnek yükleme ve yıkadıktan sonra, vana geçildi ve 500 nl / dk doğrusal bir degrade tuzak ve ayırma sütun (uzunluğu 10 cm, 100 mikron id, in-house Synergi 4 mikron C18) ile paketlenmiş teslim edildi. Gradyan% 0-50 tampon B (% 80 acetonitrile/0.1% formik asit) ile 45 dakika oldu.
- NanoLC-LTQ MS aletleri xcalibur veri bağımlı modunda ameliyat edildi. 1 × 10 5 yoğunluk Yukarıda dört güçlü MS iyonlarının MS / MS spektrumları dinamik dışlanma ile toplandıetkin ve çarpışma enerjisinin% 35 olarak belirlenmiştir.
- Her numune NanoLC-LTQ MS sistemi tarafından iki kez çalıştırıldı. Üç ayrı preparatlar örnekler kullanılmıştır. Üç ayrı örnekleri belirlenmesini de peptitler Ek Tablolar 1 ve 2 de listelenmiştir. NanoLC-LTQ MS spektrası için temsili Şekil 3 de gösterilen edildi.
4. Veri Analizi ve Protein Veritabanı Arama
- Her RAW dosya Readw.exe kullanarak bir mzXML dosya dönüştürüldü.
- MzXML dosyası SEQUEST Sorcerer 2 sisteme giriş oldu ve Biyoteknoloji Bilgi (NCBI) enzim spesifisitesi kullanarak protein veritabanı için ilgili Ulusal Merkezi üretilen bir insan veritabanına karşı arandı. Prekürsör iyon kütle toleransı 1.5 Da olarak belirlendi. 16 Da bir molekül kütlesi oksidasyon için hesap ayırıcı ara metionin ilave edildi.
- SEQUEST arama yaptıktan sonra, sonuçlar, otomatik olarak filtre doğrulanmıştırd PeptideProphet ve ProteinProphet [Sistem Biyolojisi Enstitüsü (ISB)] tarafından görüntülenir. PeptideProphet bir peptid atama s SEQUEST puanları (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) ve tanımlanan her peptid sekansı ek bilgileri bazında "doğru" vs "yanlış" olduğunu kapsamlı bir olasılığı (P) skoru tahmin ediyor. ProteinProphet MS / MS spektrası için atanan peptidlerin bazında her protein için 0 ila 1 arasında bir olasılığı skoru hesaplanmıştır.
- Yalancı pozitif tanımlamalar aza indirmek için biz sıkı filtre ölçütleri kullanılmıştır. İlk olarak, minimum P puanı kesim çok düşük hata (çok% 3 ünden az) ve oldukça iyi hassasiyeti sağlamak için kabul edilen herhangi bir peptid için 0.8 olarak belirlenmiştir. 1.9, 2.2 +1 ve 3.0, +2, +3 şarj: İkinci,> 0.8 P puanı ile tüm peptidler yüksek çapraz korelasyon (Xcorr) aynı anda puanları olmalıdır.
5.. LLUF Problar Oral Bakteri giderimi
- Kaldırmak için LLUF probların yeteneği belirlemek içinoral bakteriler, LLUF prob toplama (Bölüm 3) öncesi ve sonrası tükürük bakteriyel tespiti için agar üzerine yayıldı.
- Aerobik bakteriler bir gün için 37 ° C'de bir antibiyotik içermeyen Lauria-Bertani (LB) agar plaka üzerinde yetiştirilmiştir.
- Anaerobik bakteriler bir gün 37 ° C'de gaz Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) kullanılarak anaerobik koşullarda bir antibiyotik içermeyen Brucella broth agar (BD, Sparks, MD) üzerinde yetiştirilmiştir.
6. Temsilcisi Sonuçlar
1. Bir taklit ağız ortamındaki LLUF probları ve örnekleme tükürük Fabrikasyon
Örnekleme tükürük bir lolipop emme olarak yapılabilir, prosedür toplama cihazları 13-14 yılında Titriyormuşçasına tükürük bozulmasını önlemek olacaktır. Önemlisi, aynı zamanda sözlü boşluklardan dinamik ve yerel hastalara izlemek mümkün olacak. Tükürük ile numune hazırlama basitleştirilmiş olabilir, buna ek olarak, klinisyenler kolayca facil olurdusonraki klinik çalışma konusundaki kararını hızlandırmak için prosedürü itate. Kütle spektrometresi bir zaman çok kısa bir süre içinde dizi proteinleri tespit ve düzleştirmek için en hassas tekniklerinden biridir. Ancak, numune hazırlama için karmaşık prosedürler klinikte bu tekniği kullanarak engel olmuştur. Ayrıca, bilinir ki kütle spektrometresi ile analiz 15-16 klinik örneklerde yüksek molekül ağırlığına (tükürük örneğin amilaz) maske düşük bolluk proteinler ile daha bol protein ya da proteinler. Yukarıda bahsedilen engellerin üstesinden gelmek için, LLUF sondalar (Şekil 1) adında bir lolipop gibi ultrafiltrasyon cihazı geliştirdi. 30 kDa (Şekil 1A, a) polipropilen raket (Şekil 1A, b) yapıştırıldı bir MWCO ile negatif yüklü polyethersulfone membran. Bu, tükürük içinde daha büyük proteinleri filtrelenmesi amacıyla LLUF prob önüne yerleştirilmiştir edildi. Insan oral ortamda (Şekil 1A, g taklit etmek), Bir sünger (Şekil 1A, e) Bir kültür kaplarına (Şekil 1A, f) tükürük içine sırılsıklam olmuştu. Tamamen şırınganın (Şekil 1A, d) çıkarıldıktan sonra, filtrelenmiş tükürük bağlı bir tüpün (Şekil 1A, c) boyunca hareket eden başladı ve toplanmıştır.
2. NanoLC-LTQ MS tarafından yerli tükürük peptidome belirlenmesi
LC kromatogramları karşılaştırılması, farklı protein kompozisyonları LLUF numune alındıktan sonra tükürük olduğunu belirten LLUF örnekleme (Şekil 2) önce ve sonra tükürük farklı kromatogramları bulundu. Protein kompozisyonlar belirlemek için, bir çok protein karışımından derhal sekansı peptidler mümkün olduğu bilinmektedir NanoLC-LTQ kütle spektrometrisi kullanılmıştır. Daha da önemlisi, klinik amaçlar için numune hazırlama basitleştirmek için, kimyasal veya enzimatik sindirim olmadan tamamen tükürük NanoLC-LTQ MS analizi için uygulandı. Beklenmedik bir şekilde, 131 peptidler bizyeniden sindirilmemiş tükürük (Ek Tablo 1) belirlenmiştir. Bu peptidler, çeşitli prolin zengin bir protein, aktin, alfa amilaz, alfa 1 globin, beta globin, histain 1, keratin 1, musin 7, polimerik immünoglobulin reseptörü, satherin ve S100A9 türetilen parçası bulunmaktadır. Yirmi altı benzersiz peptitler LLUF sondalar (Ek Tablo 2) ile filtreleme sonra tükürük tespit edilmiştir. Bu peptidler esas olarak çeşitli prolin zengin proteinler elde parçalarıdır. Bu tür polimer immünoglobulin reseptörü (83,24 kDa) ve alfa amilaz, proteinler gibi elde edilen peptidler daha büyük ve daha bol miktarda protein çıkarılması LLUF prob özelliği gösteren, saptanamaz edildi. Alfa-amilaz bir iç peptid tekabül PFIAIHAEAESKL peptid A MS / MS spektrumu Şekil 3A 'de gösterilmiştir. En ilgi çekici, daha büyük proteinler çıkardıktan sonra, 18 26 sıralı peptidler LLUF prob-örneklenmiş tükürük (Tablo saptanabilir oldu1). Bu peptidler, bir 18 (P), prolin ile sonuçlandı prolin-zengin proteinleri veya varsayımsal proteinleri elde edildi -. Glutamin (Q) (-PQ),-SR,-SP-veya C-terminusta PP Şekil 3B, bir MS / MS gösterdi LLUF prob-örneklenmiş tükürük tespit edildi PQGPPQQGGHPRPP peptid spektrumu. Peptid-prolin zengin protein HaeIII alt familyası 1 ve 2 (Tablo 1) elde edilebilir.
Şekil 1.. LLUF probları ile insan ağız boşluğu taklit gelen bütün tükürük örnekleme kompozisyonlar Panel. A: (a) 30 kDa MWCO olan bir yarı-geçirgen bir polyethersulfone, (b) bir polipropilen paddle, (c), bir teflon florinlenmiş etilen propilen tüp; (d) bir 20 ml şırınga Panel B:. bir sünger (e) (a taklit dili) yaratmak için insan tükürük içeren bir kültür çanağı (f) içine batırılmış edildiyapay bir insan ağız boşluğu (g). Tam bir şırınga çekilerek oluşturulan çıkan negatif basınç şırınga içinde bağlı bir tüp (ok) boyunca ve yaratılan boşluk (ok) doğru taşımak için toplanan sıvı sürücüler. Bar: 2.0 cm.
Şekil 2. LLUF örnekleme önce ve sonra tükürük Diferansiyel LC / MS / MS kromatogramlar. Proteinler (1.0 ug / ul) insan tam tükürük içinde olmadan veya bir LLUF probu ile filtre edildi. Tryptic sindirim olmaksızın doğrudan proteinleri Malzeme ve Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi bir Eksigent Nano LC sistemi ile konjuge olmuştur NanoLC-LTQ MS tabi tutuldu. Tükürük taban-tepe kromatogramları (44-mim tutma süreleri ile) (A) ve sonrası (B) LLUF örnekleme örneklendirilmiştir önce.
Şekil 3. Dedekönce NanoLC-LTQ MS sıralama. Tükürük proteinler tarafından tükürük peptidome ğünü (A) ve (B) LLUF problar ile örnekleme olarak Deneysel Prosedürler açıklanan NanoLC-LTQ MS ile incelendi. Tryptic sindirim olmadan doğal insan tükürük türetilen Saliva peptidome Ek Tablolar 1 ve 2 'de gösterildi. Alfa-amilaz türetilen A peptit (PFIAIHAEAESKL) özel olarak gösteren, LLUF probları (A) sahip toplama olmadan tükürük örneği tespit edildi, büyük proteinleri sökmede LLUF prob kabiliyeti. -PQ sahip birçok peptidler,-SR,-SP ya da-C-PP termini ultrafiltrasyon LLUF probları sonra örnekleri, sadece edildi. Çeşitli prolin zengin proteinler türetilmiş peptit biri (PQGPPQQGGHPRPP) (B) gösterilmiştir. MS / MS karakteristik "y" ve "b" serisi iyonları ile spektrumları hem peptidlerin kimlikleri teyit etti.
<strong> Şekil 4. LLUF sondaları sırasında kullanıldığı oral bakterilerin uzaklaştırılması. Malzemeler ve Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi bir prob LLUF inşa edildi. Prob, bir taklit ağız ortamı (Şekil 1) içinde insan tükürük içine yerleştirildi. LLUF prob sonunda şırınga tükürük örnekleme için ultrafiltrasyon sürecini sürdü negatif basınç oluşturmak için geri çekildi. Örnekleme sırasında, tüm tükürük polyethersulfone zarını geçerek seçici olarak geçti ve bir şırınga içinde birikmiş. Bir LLUF prob ile örnekleme önce tüm tükürük bir kontrol olarak görev yaptı. LLUF prob örnekleme öncesi ve sonrası tükürük (10 ul) bakteriyel tespiti için agar üzerine yayılarak Panel A:. Ile (+ LLUF) ve olmayan Tükürük (+ LLUF) LLUF prob örnekleme bir antibiyotik içermeyen yan yana yayıldı 37 LB agar ° C bir gün için Panel B:. LLUF prob örnekleme olan ve olmayan Tükürük bir antibiyotik içermeyen Brucella broth agar plaka üzerine yayılarakBir gün için 37 ° C'de gaz-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) kullanılarak anaerobik koşullar altında. Bakteriler aerobik ortadan kaldırarak yanı sıra anaerobik bakteriler ağız içinde LLCF prob özelliği gösteren, LLUF prob-örneklenmiş tükürük ile yayılır agar üzerinde büyümek vermedi. Bar: 1.0 cm.
| Peptid sekansı / Ölçülen peptid kütle | Katılım sayısı | Isim | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485.3 | gi | 41349484 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 2 habercisi |
| gi | 41349482 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 1 habercisi | ||
| gi | 60301553 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576.9 | gi | 4826944 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 2 |
| gi | 9945310 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 1 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126.2 | gi | 37537692 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 4 habercisi |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028.3 | gi | 113423660 | TAHMİN: varsayımsal protein |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077.8 | gi | 113423262 | TAHMİN: Varsayılan protein izoform 5 |
| gi | 41349482 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 1 habercisi | ||
| gi | 60301553 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 2 | ||
| gi | 113423663 | TAHMİN: varsayımsal protein | ||
| gi | 41349484 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 2 habercisi | ||
| gi | 41349486 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 3 habercisi | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918.5 | gi | 9945310 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 1 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131.3 | gi | 113423660 | TAHMİN: varsayımsal protein |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | gi | 113423663 | TAHMİN: varsayımsal protein |
| gi | 41349482 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 1 habercisi | ||
| gi | 113423262 | TAHMİN: Varsayılan protein izoform 5 | ||
| gi | 60301553 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866.6 | gi | 4826944 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713.8 | gi | 9945310 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 1 |
| gi | 4826944 Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 2 | |||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083.1 | gi | 9945310 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 1 |
| gi | 4826944 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512.6 | gi | 4826944 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 2 |
| gi | 9945310 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 1 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720.2 | gi | 113423262 | TAHMİN: Varsayılan protein izoform 5 |
| gi | 113423663 | TAHMİN: hypothetical protein | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450.1 | gi | 9945310 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 1 |
| gi | 4826944 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791.1 | gi | 4826944 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 2 |
| gi | 9945310 | Proline-zengin protein HaeIII altfamilya 1 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186.9 | gi | 113423262 | TAHMİN: Varsayılan protein izoform 5 |
| gi | 41349482 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 1 habercisi | ||
| gi | 60301553 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 2 | ||
| gi | 113423663 | TAHMİN: varsayımsal protein | ||
| gi | 41349484 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 2 habercisi | ||
| gi | 41349486 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 3 habercisi | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720.3 | gi | 113423663 | TAHMİN: varsayımsal protein |
| gi | 41349482 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 1 izoform 1 habercisi | ||
| gi | 113423262 | TAHMİN: Varsayılan protein izoform 5 | ||
| gi | 60301553 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870.9 | gi | 37537692 | Proline-zengin protein BstNI altfamilya 4 habercisi |
Tablo 1. Peptitler LLUF-Toplanan örneklerde sadece tespit edildi.
Ek Tablo 1. tamamlayıcı Tablo 1 görmek için buraya tıklayın .
Ek Tablo 2. ek Tablo 2 görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz pek çok peptid fragmanları insan sindirilmemiş tükürük var olduğunu bulduk. Bunlar, peptit parçaları prolin-zengin proteinler, aktin, alfa amilaz, alfa 1 globin, beta globin, histain 1, keratin 1, musin 7, polimerik immünoglobulin reseptörü, satherin, S100A9 çeşitli formları arasından türevleridir. Saptanmamış yarılma bölgeleri olan peptitler üretimine katkıda bulunan bir çok faktör var olabilir. Örneğin bazı peptit parçaları insan tam tükürük doğal olarak mevcut olabilir. C-termini-PQ sahip birçok peptidleri (Tablo 1 ve Ek Tablolar 1 ve 2) tespit edilmiştir. Proline zengin proteinler asidik, bazik veya glikozile proteinler olarak sınıflandırılır ve tek bir bölgede 17 kümelenmiş altı genler tarafından kodlanır. Allelik varyasyon, diferansiyel RNA ekleme, proteolitik işleme ve post-translasyonel modifikasyonlar 17 otuzdan fazla farklı prolin zengin proteinler sonucu. Salgılanması sonra, asidik prolin-zengin proteins hızla diş yüzeylerinde ve diş plağı proteoliz 18-19 potansiyel doğal bağışıklığın peptidler indirgenir bağlıdır. Hem gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerin glycosidases ve proteazlar 18 çeşitli ifade. Asidik prolin zengin proteinler sözlü Streptococcus ve Actinomyces türleri 18 potansiyel doğal-bağışıklık-benzeri peptidler içine bozulmuş olabileceği bildirilmiştir. Glutamin (Gln) - glisin (Gly) bölünme tükürük asidik prolin zengin bir protein ve bir bakteri bağlama-PQ C-terminali 18, 20-22 üretimi bakteriyel bakımından bozunma biyolojik olarak kritik önem taşır. -PQ bağlayıcı bakterilere prolin-zengin proteinlerin termini bir sentetik RGRPQ pentapeptid 18 kullanılarak in vitro deney bir tarafından teyit edilmiştir. Bizim veri ile anlaşmaya varılarak, SJ Fisher grubu, sindirilmemiş insan parotis tükürük 23 C terminallerine-PQ birkaç peptidler tespit etmeyi başardıC terminallerine-PQ ile çeşitli peptidler düşündüren keşif sahasında insan tam tükürük bulunabilir. İnsan tükürüğü-PQ ile birden peptidler içeren peptidler 18, 19-doğuştan gelen bağışıklık benzeri görev alabilir C terminallerine. Oral bakteri mevcutsa, prolin zengin proteinler anında verimli bakterileri öldürmek için C terminallerine-PQ ile çeşitli parçaları aşağı kırılabilir.
Sindirilmemiş tükürük mevcut peptid fragmanları için bir başka neden bütün tükürükte bulunan endojen proteazlar bazı numune hazırlama 24-25 sırasında etkin kalır olabilir vardır. Ağız boşluğu içinde endojen proteazlar tarafından bu proteinlerin meydana bölünme olasılıkla kütle spektrometre analizi önce devam etti. Örneğin, müsin bakteriyel klirensi 26 daha yetkin olan daha küçük bir form için aşağı tükrük proteaz tarafından bölünebilir olabilir. Bu da mümkün olduğu ağızdan bakterilerden proteazlar Mayıs çatlatma tükürük collectio önce ya da sonra ağız proteinlerin. Birkaç tükürük proteinleri sözlü Streptococcus ve Actinomyces türleri 27-29 arası proteazlar tarafından doğranmış edilebilir ortaya konmuştur.
Yarı geçirgen bir zar LLUF probları önemli bir bileşenidir. Membran seçici proteinler, oral bakteriler ve enkaz gibi büyük maddeler kaldırmak için gereklidir. LLUF, bazı bileşenler geçişine izin veren ve yapay bir ağız boşluğu içindeki diğer bileşenlerle red seçici bir baryer olarak işlev yapar. Yarı geçirgen bir zar makromoleküllerin hariç ise küçük molekül zarından geçmesine izin verir. Laboratuvarımızda son verilerde LLUF probları etkili aerobik ve anaerobik hem oral bakteriler (Şekil 4) kaldırmak olduğunu gösterdi. LLUF problar ile toplama öncesi ve sonrası tükürük örnekleri antibiyotikler-free agar plaklarına yayıldı ve aerobik ve anaerobik koşullarda inkübe edildi. Agar LLUF ile yayıldı zaman Bakteri büyümeye vermedi prob-aerobik ve anaerobik bakteriler ağız giderilmesinde LLUF prob özelliği gösteren, tükürük örnekleri. Biz insan oral mikropların protein veritabanları içermiyordu bir insan veritabanı ile tüm spektrumu aradı. Tüm sözlü mikroplar ile kapsamlı bir protein veri tabanı oluşturulacaktır eğer ağız mikrop proteom / peptidome belirlenmesi mümkün olacak. Organik (polyethersulfone) membran LLUF probları imal için kullanıldı. Membranı, bir 30 kDa MWCO sahip olduğu bilinmektedir olmasına rağmen, aynı zamanda, örnekleme performansı membranı yüzeyi 30 üzerinde negatif şarjların tükürük proteinlerin etkileşimi gibi diğer faktörlere bağlı. PH değerleri ve sıcaklık gibi ağız boşluğu protein karmaşıklığı değişiklikler de örnekleme performansı etkiler. Bizim veri 18 peptidler LLUF prob-örneklenmiş tükürük (Tablo 1) sadece mevcut olduğunu göstermiştir. Peptitler ile PQ-sona eren,-SR,-SP ya da-C-PP termini esas olarak prolin-zengin p türetilenroteins. Bu net olumsuz prolin-zengin proteinler eksi yüklü bir yüzey 31 ile kuvvetli bir adsorpsiyon gösterilmiştir tahsil olduğu rapor edilmiştir.
Özetle, LLUF probları önüne gelecek, yarı geçirgen membranların proteinlerin belirli grupları tespit etmek için bir girişim farklı yüzey ücrete sahip çeşitli gözenek boyutları ve malzemeler kullanılarak değiştirilebilir. Örneğin, gözenek boyutları ile nanofiltrasyon membranları 0.05 mikron 1 nanometre arasında değişir tükürük örnekleri 32 virüs ayırabilirsiniz. LLUF probları ayrıca, tükürük örnekleri glukoz ve laktik asit gibi çeşitli maddelerin konsantrasyonu izlenmesi için uygulanabilir. Ultrafiltrasyon membranları santrifüj ultrafiltrasyon 33 ile protein ayırma kullanımı yapılmış olmasına rağmen, nadiren yarı geçirgen bir zar boyunca negatif basınç uygulaması ile proteinlerin toplamak için kullanılmıştır. Böyle fourier t gibi gelişmiş kütle spektrometresi ile LLUF problar Bağlamaransform iyonsiklotron rezonans (FT-ICR) sağlam tükürük kimlik 34-35 proteinleri izin verebilir. Özellikle, tükürük proteom ve peptidome dinamik desen on-line analiz LLUF prob klinik uygulama için hayati olabilir. LLUF problar ile toplanmasından sonra, prolin zengin proteinler elde edilen pek çok peptid fragmanları sindirilmemiş tüm tükürük tespit edildi. Proline zengin proteinler diş çürüğü 36 gelişimini etkilemek için ve viral enfeksiyon 37 mukozal yüzeylerin korunmasında önemli olabilir oral bakteriler ile etkileşime girebilir. Dahası, prolin-zengin proteinlerinin ifadesini romatoid artrit hasta 38 değiştirilmiş olduğu belgelenmiştir. Bu çalışmalar güçlü LLUF sondaları tarafından toplanan Prolinden zengin proteinler çeşitli insan hastalıklarının izlenmesi için biyolojik olarak hizmet kanaatini verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık Hibeler National Institutes (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 ve R21-I58002-01) tarafından desteklenmiştir. Biz yazının eleştirel okuma C. Niemeyer teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
