Summary
我们描述了一种方法，亲和标签的重组蛋白的纯化，使用的液体处理机器人。此方法通常是适用于小规模纯化的可溶性的带有His标记的蛋白质在高吞吐量的格式。
Abstract
X-射线晶体给出的方法是用于获得蛋白质的结构的详细视图。这样的研究需要辅之以进一步的生化分析，以获得详细的结构/功能关系的深入了解。寡核苷酸基因合成技术的进展进行大规模突变的战略越来越可行的，其中包括所有其他19个氨基酸的替代目标残留物。增益或损失的函数的表型，然后使系统的得出的结论，如特定的残基的催化活性，蛋白质的稳定性和/或蛋白质 - 蛋白质相互作用的特异性的贡献。
以属性的不同表型的突变的性质 - 而不是波动的实验条件下 - 这是至关重要的纯化和分析的蛋白质在一个控制和可重复的方式。高吞吐量的战略和自动化的手动协议，机器人液体处理平台，创造了机会进行这样的复杂的分子生物学方法很少人工干预，最少的错误率1-5。
这里，我们提出的带有His标记的重组蛋白中的高通量的方式纯化的一般方法。在最近的研究中，我们采用这种方法的详细调查TFIIB，结构与功能的基础转录机器的一个组成部分。 TFIIB是不可缺少的启动子体外转录前起始复合物6-8成的RNA聚合酶的招聘是必不可少的。 TFIIB包含柔性连接域贯通RNA聚合酶9-11裂的活性部位。这种链接域赋予两个生化量化活动TFIIB，即（i）在“流产”的转录起始阶段刺激的催化活性，及（ii）额外的贡献，具体招聘的RNA聚合酶的前起始复合4,5,12。我们利用高通量纯化的方法来产生单人间，双人间和三人间替代和缺失突变在TFIIB连接器和，随后分析他们的功能分析的刺激效应对催化活性的RNA聚合酶4。总之，我们产生，纯化和分析381突变体 - 一个将是费时和费力的手动执行的任务。我们在生产和检测中的蛋白质multiplicates，让我们体会到任何实验性的变化，给了我们一个清晰的思路，我们的研究结果的可重复性。
此方法作为一个通用的协议，用于带有His标记的蛋白质纯化，并已成功地用于纯化其它重组蛋白。目前优化的24种蛋白质的纯化，但也可以适于净化多达96个蛋白质。
Protocol
第一部分：高通量增长的细菌培养。
1。在2毫升的自身诱导中过夜培养细菌利用24孔板
- 微波灭菌的24孔板。
- ，接种1.5毫升新鲜生长的细菌菌落或冷冻甘油股票的的自身诱导介质（隔夜快件中）。我们通常接种三口井每突变体与三个独立克隆的殖民地。储备六口井为阳性和阴性对照。对于阳性对照，我们长大3野生型克隆和阴性对照，我们长大2已转化的非表达质粒的克隆。检查是否有足够的消毒板留下一个空白中只控制。
- 成长的细胞在37℃下18小时，并以250rpm摇动。我们使用lac启动诱导BL21（DE3）中罗塞塔2细胞。自身诱导培养基中含有的葡萄糖和乳糖的混合物。这种细菌最初喂葡萄糖和然后开始使用乳糖，也诱导重组蛋白的表达“。
- 取下盖子，并把机器人平台上的板。
PART B：机器人纯化重组蛋白。
2。准备的机器人平台
化妆由20mM咪唑的洗涤缓冲液，0.1％的Triton X-100，0.5 M氯化钠，20mM的Tris-乙酸盐，pH值为7.9的10mM MgOAc 2，0.7 mM的ZnOAc 2，10％甘油，和洗脱缓冲液的组成的0.5M咪唑，0.1％的Triton X-100，0.5 M的NaCl，20mM的Tris-乙酸盐，pH值为7.9的10mM MgOAc 2，0.7 mM的ZnOAc 2，10％甘油。这些缓冲器将被用来洗珠后的标签的蛋白质已被绑定到这些，或分别从珠，洗脱蛋白质。
- 化妆的细菌稀释液（100毫升蒸馏水中，用15μl的防沫试剂）。这种解决方案将用于使稀释过夜培养的细菌的光密度（A600）测量。消泡剂的存在下在稀释剂中防止形成气泡，会干扰与板读数器测量。
- 裂解液的10倍快攻试剂，2微升lysonase每个样品15毫米MgOAc 2的 。快攻包含打破细菌细胞壁和促进细胞内的蛋白质释放的去垢剂和它的盐的组合。 lysonase是一个专有的混合溶菌酶和核酸。溶菌酶协助破坏细胞壁和核酸酶消化释放的细菌的核酸。
- 可选：6M的盐酸胍解决方案。一些重组蛋白往往坚持的特氟纶涂层的移液针。盐酸胍溶液变性蛋白质和洗它们逐出更有效地比常规使用的水冲洗可水洗机器人吸头后，每个第一EP。
- 准备的BCA蛋白定量试剂（二辛可宁酸）通过混合二辛可宁酸溶液（试剂A）和硫酸铜溶液（试剂B）：肽债券减少铜2 +从CuSO 4的成分中存在的BCA试剂为Cu 1 +由此的Cu 1 +的量是溶液中存在的肽键的数目成正比。在第二步骤中，两分子的二辛可宁酸螯合铜1 +在562 nm处的吸光度移位所导致，导致在一个紫色。的显色反应是时间依赖性的，并且通常需要几个小时的时间是确定的。在那之后的颜色是稳定的几个小时。
- 大小合适的填充槽或板，并将其放置在他们的机器人平台的预分配的位置上。
- 放置一个24孔板上的盐酸胍废物，两个明显的96 -孔板的OD 600和吸光度测量和一个蓝色的第96 -孔板Ê自己的立场纯化的蛋白的平台上。将一个96深孔板的磁性底座上。
- 稀释MagneHis镍颗粒结合蛋白通过形成螯合物与他们的His-标签在蒸馏水中的5倍，并填充到胎圈搅拌单元。接通搅拌器保持在悬浮液中的小珠。
- 切换机器人平台上，并冲洗移液针几分钟，以除去气泡，否则会干扰移液精度。可重复使用的移液的针被刷新个人之间的移液操作步骤。可替换地，可以使用一次性吸头。所有随后的步骤进行机器人。该机器人的协议可应要求提供。
3。经过测量OD600细胞生长
- 10微升过夜培养物稀释在90微升稀释剂溶液。
- 测量的OD 600，以保证细菌生长在相似密度（ 图1）。
4。磁珠结合的细胞破坏释放的蛋白质，并允许
- 磁性镍微珠悬浮液分配到第二个24孔板的各孔中加入100μl。
- 每个小规模的细菌培养的900微升转移到24孔板上，含有小珠。添加100μl的的10倍快攻/ lysonase的混合。
- 快速摇动（每分钟800转），在室温下的30分钟的振动平台转移到24孔板上。细菌细胞壁被破坏由一个组合的机械力和化学作用的重组产生的蛋白被释放到溶液中。凭借其亲和标签，他们立即绑定顺的螯合镍珠。
5。珠洗水
- 包含重新悬浮磁珠的细胞溶胞产物转移到在96深孔板，其被定位在支架上与magnetic棒，井间的滑动。 96 - 孔板有一个正方形的锥形底部，允许更容易地除去上清液。该井可容纳体积达至2.1毫升，但都充满了更小的体积。这使我们能够进行剧烈振荡的步骤没有样品交叉污染的情况下飞溅。
- 吸头进行清洗6 M盐酸胍个人之间的步移液操作。这一步是至关重要的净化TFIIB和其他的“粘性”的蛋白质，以避免交叉污染。与其他蛋白质，它可能是足够广泛冲洗针与水之间的移液管的步骤。
- 磁性支架的磁性杆，吸引的顺磁性珠，拉它们远离井的中心，并允许移液针免费访问上清液。弃去上清液。
- 第一次添加到500微升的洗涤缓冲液的24孔板上，并随后将其转移到96孔板中以电子邮件nsure珠粒的完全转移。的24孔板上，从摇动器中除去。
- 另外500微升的洗涤缓冲液中直接加入到96孔板中，该板被转移到振动筛，并剧烈振摇1分钟。该板向后移动到磁性底座和丢弃的洗涤缓冲液。
- 此步骤重复两次，并在洗涤过程完成后通过除去任何缓冲从板残余。
6。洗脱洗脱缓冲液中蛋白质
- 100微升洗脱缓冲液添加到珠粒，该板被移动到振动筛，并剧烈振摇30分钟，在室温下。
- 该板向后移动到振动筛和洗脱液，含有纯化的重组蛋白，被转移到一个新的平板。
7。测量浓度的纯化蛋白
- 190微升的BCA试剂混合的一个明确的96孔板中，并转移到10微升的亲蛋白质的解决方案。
- 经过几个小时的孵育（通常为5-6或过夜），测量的吸光度和BSA标准进行比较，以确定每个纯化的蛋白制剂（图2）的浓度。
- 在适当的浓度（图3），将纯化的蛋白质，现在可以用于下游应用。
8。代表性的成果
的纯化的协议提供了两个质量控制阶段，显示了其中的例子。我们能够识别并记录可能出现的问题，在细菌的生长阶段（ 图1），后来在评估的纯化蛋白的产量（ 图2）。我们通常蛋白质纯化，并对其进行测试，一式三份。结合的质量控制措施，这给了我们信心，我们的功能分析，我们观察到任何变化的突变是由于phenotypE（ 图3），并且不是由于实验的变化的或失败的纯化。获得的收益率通常范围从50-200微克，超过足够的各种功能检测。
图1。直方图与过夜培养的24孔板的OD测量六个TFIIB突变的变体，以及野生型TFIIB三个克隆已生长。只携带非表达质粒的构建和一个与介质的两个克隆作为阴性对照。 OD测量结果表明，在增长率之间的文化，也有小的变化。
图2。从这些培养获得的蛋白质产量的BCA法所确定的，并通过SDS-PAGE证实。不表达变体之一的是，在高的水平。在COMbination与图1中 ，我们可以得出这样的结论：这是由于差细胞生长，但由于蛋白的表达不正确所引起的。
图3。的转录测定的代表性的结果 。 RNAP小流产的成绩单，生产上，我们测得的刺激活动的TFIIB的变种。在这里，示出一个完整的图书馆TFIIB残渣K87的单个氨基酸取代的刺激效应。高度的再现性确认由小的错误率。描述了三个突变体的表现相比，野生型（WT），阴性对照组（NC）和洗脱缓冲液的样本凝胶只控制下。
Discussion
这里所描述的自动重组蛋白的纯化方法允许在高重现性的条件下在一个小规模的格式的大量的突变体蛋白的生产和纯化，以最小的人为干预。 图1和图2示出的结果，系统的质量控制和示例纯化的蛋白质。 图3表明，在本实施例中使用的纯化的转录因子在一个高度可重复的方式在功能测定执行。
即使为古细菌TFIIB纯化程序开发，它是广泛适用的亲和标签的蛋白的纯化。因此这种自动净化协议的使用将显着促进重组蛋白的生化分析，从而将进一步了解我们的蛋白质 - 蛋白质相互作用的规模是难以实现手动。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的，由惠康项目资助（078043/Z/05/Z）ROJW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
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