Summary
HMBA樹脂から切断手順を "安全キャッチ"を利用し、官能ビスペプチド三量体の効率的な固相ペプチド合成が記載されている。
Abstract
1962年に、RBメリフィールドは、効率的にペプチドを合成するための新しいルートとして固相ペプチド合成を使用して、最初の手順を公開しました。このテクニックは、すぐに時間と労力の両方で、その液相の前任者よりも有利を証明した。固体支持体の性質に関する改善、保護グループが採用し、過去50年間にわたって採用カップリング法は、メリフィールドの元のシステムの有用性を増加している。今日は、Bocベースの保護およびベース/求核開裂可能な樹脂戦略またはFmocベースの保護と酸性の開裂可能な樹脂の戦略の使用は、最も一般的なペプチド1の合成に使用され、RCシェパードによって開拓された。
メリフィールドの固体サポート戦略に触発され、我々は、本明細書中に記載されている官能基、ビス-ペプチド2のアセンブリののBoc / tert-ブチル固相合成の戦略を開発しました。トンと比較して固相合成の使用O液相方法論は、メリフィールド1で説明したように時間と労力の両方にのみ有利で はなく、また、ビス-ペプチドライブラリーの合成でより容易にすることができます。ここで示している合成は、2段階のジケトピペラジン形成による樹脂からビス - ペプチドの官能を解放するためのメカニズムを "安全キャッチ"を使用して、最終的な開裂段を内蔵しています。
ビスペプチドは、タイプと立体モノマー単位の、各モノマーの間の接続によって制御され、予測可能で設計可能な方法で機能を配置することができます - ビス - アミノ酸の剛性、スピロラダーオリゴマーである。各ビス-アミノ酸は2つのアミノ酸（α-アミンとカルボン酸）3,4が含まれている立体化学的に純粋な、環状の足場です。当研究室では、現在、触媒、タンパク質 - タンパク質相互作用とnを含む幅広い分野にわたる機能のビスペプチドの可能性を調査しているanomaterials。
Protocol
1。セットアップ
- 固相合成用の反応セットアップは、 図1に示すように、真空下で囲まれたフィルタリングフラスコにポリプロピレンチューブを介して接続されているポリプロピレンフィルターカートリッジやガラス反応器である。反応は、マグネチックスターラーバーまたは反応器を通して窒素をバブリングすることにより混合することができます。
- それは反応容器を不活性雰囲気下で含まれるようになり、密閉容器から試薬の除去を可能にするように乾燥管とオイルバブラーを装備し、アルゴンシリンダーに接続されたガスマニホールドも推奨されます。
- すべての操作はドラフト内で実行され、適切な個人用保護具（安全メガネ、白衣とニトリル手袋）が必要です。
2。樹脂上にビス-ペプチド最初のロード
- 8 mLの反応容器にHMBA-AM樹脂（0.88ミリモル/ gローディング、100μmol）を114 mgを秤量し、マグネチックスターラーバーを追加します。目の上にキャップをeは、ラバーセプタムで容器と、少なくとも5分間アルゴンでチューブをパージします。
- その間に、 図3（586.63グラム/モル、2EQ）と1の59.2 mgの化合物1の117.3 mgを量る- （メシチレン-2 -スルホニル）-3 -ニトロ-1,2,4 -トリアゾール（MSNT、296.0 g /モル、2EQ）を15mL使い捨て遠心チューブに2 mLの無水ジクロロメタン（DCM）に溶解する。完全に溶解するまで溶液と混合する1 - メチルイミダゾール（NMI、80.81 mLの/モル、3eq）24μLを追加します。
- シリンジを介して反応容器に活性化されたソリューションを転送し、アルゴンで一晩（〜10時間）の下で撹拌することができます。
- セプタムを取り外し、反応混合物を排出する。 DCM（5x）を、ジメチルホルムアミド（DMF）（5x）を有する樹脂を洗浄します。樹脂の負荷の程度を評価するために、セクション10.1に記載されている "メチルレッドテスト"を実行します。樹脂は、メチルレッドテスト中に赤色のままならば、2.2および2.3が繰り返されるべきで繰り返します。負のメチルレッド試験を示す黄色の色が、好まれます。しかし、残りの水酸基は、次のステップ、わずかに陽性の結果（光オレンジ色の樹脂の色）でキャップされるので、許容できるかもしれません。
3。上限まず、ビス-ペプチドとの同時樹脂の脱保護
- 反応容器に、DCMの1 mLを追加し、30秒（バブリングが発生した）上で酢酸を滴下し、1 mLの33％臭化水素を追加し、15分間撹拌することができます。 DCM（5x）を有する樹脂を排出し、洗浄し、もう一度手順を繰り返します。
- その後DCM（5x）をDMF（5倍）で樹脂を洗浄します。再度DCM（5倍）およびDMF（5x）をDMFで洗浄におけるN、N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）の5％（v / v）の溶液で2回洗浄することにより樹脂を中和する。 "メチルレッドテスト"およびセクション10.1と10.2で説明した "クロラニルテスト"を実行します。結果は、クロラニルテストのためのメチルレッドテストと正のために負でなければなりません。
4。カップリングのBoc / tBuので保護された官能ビスアミない酸ません
- 無水DCMで3回洗浄することにより樹脂を含有する反応容器に不活性雰囲気を再導入は、中隔およびアルゴン線を接続します。パージおよび無水DCM 1-2 mLを加え、アルゴンラインバブラーが上昇し始めるまで、容器を排出し、30秒間撹拌させることで容器を洗浄する。少なくとももう一度この操作を行う。
- 炎のDMF乾燥テスト：0.15 Mの官能ビス-アミノ酸（3eq）と2:1 DCM 2ml中の1 - ヒドロキシ-7 - azabenzotriazole（HOAT、136.11グラム/モル、18eq）の245 mgの溶液を調製アルゴン雰囲気下でチューブ。ジイソプロピル47μL（DIC、156.6 mLの/モル、3eq）を追加し、90分間かき混ぜる。
- 樹脂に666μLの無水DMFで35μLDIPEA（174.19 / mLのモル、2EQ）を追加し、5分間攪拌することができます。
- シリンジを介して反応容器に予め活性化されたビスアミノ酸溶液を移し、一晩撹拌することができます。
- 反応混合物を排出し、下にある間、無水DCMで2回洗浄するアルゴン。
- ジケトピペラジンの閉鎖を促進するため、1:1 DCM 4mLのHOAT（136.11グラム/モル、10eq）とDIC（156.6 / mLのモル、10eq）の0.25 M溶液を追加します。DMFを、アルゴン下で撹拌することができます1時間インキュベートした。
- セプタムを取り外し、反応混合物を排出する。 DCM（5×）およびDMF（5x）を有する樹脂を洗浄します。必要な場合は、セクション10.2で説明した "クロラニルテスト"を実行します。
5。のBoc / tBuの保護官能ビス-アミノ酸の脱保護
- 反応容器にトリイソプロピルシラン（TIPS）、それが1時間撹拌することができます：95:5 trifluororacetic酢酸（TFA）の溶液2mLを追加します。ドレインしてから、もう一度処理を繰り返すDCM（5倍）で約30秒間樹脂を洗浄する。
- その後DCM（5x）をDMF（5倍）で樹脂を洗浄します。その後DCM（5x）を、再びDMFを（5x）を洗い、DMF中のDIPEAの5％（v / v）の溶液で2回洗浄することにより樹脂を中和する。必要な場合は、セクション10.2で説明した "クロラニルテスト"を実行します。
7。ビスペプチドProlidineエンドを官能
- 成長ビス-ペプチドのprolidine終わりはジケトピペラジンを介して独立にまたは一緒にアシル化することができます。また、この終わりは遊離アミノ酸がもたらさ、後者を切断される、保護されたままにすることができます。必要に応じて、カップリング効率を評価するためにセクション10.2で説明した "クロラニルテスト"を実行します。
8。ビス-ペプチドの第四紀の終わりのFmocおよびアシル基の脱保護
- DMF中20％ピペリジン2mLの溶液を添加し、反応を20分間混合される。 DMF（5x）を有する樹脂を排出し、洗浄してもう一度プロセスを繰り返します。
- その後DCM（5x）をDMF（5倍）で樹脂を洗浄します。
- MG 2 114とN-メチルピロリドンの2 mLの（NMP）中のアミノ酸（3eq）の0.15 M溶液を調製し - （7 - アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1 - イル）-1,1,3,3 - テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート （HATU、380.2グラム/モル、3eq）と104.5μLDIPEA（174.19 / mLのモル、6eq）とよく混ぜる。反応容器に追加し、6時間撹拌することができます。
- その後DCM（5x）をDMF（5倍）で樹脂を洗浄します。
9。樹脂からアミノ酸を樹脂に結合し、切断からBoc基を除去する
- 反応容器にDCM溶液と30分間撹拌することができます：1:1 TFAの2 mLを追加します。 DCM（5x）を有する樹脂を排出し、洗浄し、もう一度手順を繰り返します。
- その後DCM（5x）をDMF（5x）を30秒間樹脂を洗浄し、水気を切る。
- 無水DMF中10％DIPEAの溶液2mLを追加し、24〜48時間を攪拌することができます。
- 事前に計量丸底フラスコに反応混合物を収集します。 LC-MSバイアルにTHF 450μLに、この液30μLを転送し、分析のために提出してください。 DMFの追加のアリコートで樹脂を洗浄し、丸底フラスコに集めるには、その後、減圧下で溶媒を除去。
10。ビス-ペプチドの精製
- ジメチルスルホキシドの最小量（100から250μL）にビスペプチド原油溶解し、HPLCバイアルインサートに転送します。エクステラ準備MS C185μmの7.8x150 mmカラムと100μL注入ループを搭載したセミprepitive HPLCシステム（ヒューレット·パッカード1100シリーズ）のオートサンプラに挿入配置します。
- 274 nmでモニターしながら30分かけて0.1％ギ酸を水で5〜95％アセトニトリルのグラジエントプログラムを使用してサンプルの複数の50μLの注入を実行します。事前に計量使い捨て遠心管製品のピークを収集し、凍結乾燥機を使用して乾燥した凍結。 注意は、一般に観察され、分析LCMSに比べてピークの保持時間のわずかなシフトとして、最初の実行で撮影する必要があります。
11。評価手法
- メチルレッドテスト7：使い捨てピペットを介して乾燥した樹脂の約1 mgを削除して、4 mLの反応容器にすすいでください。 500μL無水DCM中の20 mgのメチルレッド、50μLN、N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、及び5 mgの4 - ジメチルアミノピリジン（DMAP）の溶液を追加し、5〜10分間攪拌することができます。ドレインと濾液が無色になるまで、DCMで樹脂を洗浄します。積極的な指示は、オレンジや赤の残りの樹脂ビーズです。
- クロラニル試験12：乾燥樹脂の約1 mg使い捨てピペットを介して小さなバイアルに転送。 0.8mmのDMF溶液中でのクロラニルとDMF溶液中で2％のアセトアルデヒドの両方の3滴を加え、5〜10分間室温で放置します。肯定的な表示が紫色/青オフ樹脂ビーズです。
- ACTIVATIONトラップTEST：合成中に活性化合物は、液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）ピロリジンの50μLを含むバイアルに活性化液の少量（5〜10μL）を転送することによって評価することができる。数秒間、手で混ぜる（solutiのテトラヒドロフラン（THF）450μLで希釈し、LC-MS分析のために提出して）黄色になるはずです。
- 分析LC-MS：最終的な製品および活性中間体は、ウォーターズエクステラMS C183.5μmで4.6ミリメートル×150 mmのカラムと水で5〜95％アセトニトリルのグラジエントシステムを搭載したHP 1200シリーズLC-MSシステムを用いて評価することができる30分以上0.1％ギ酸を含む。
12。代表的な結果
原油（ 図4）、精製（ 図5）LCMSトレースの両方の例が用意されています。約10％の精製収率は、上記の方法を使用して期待されています。
図1固相合成のための実験のセットアップの図。
図2。ビス-アミノ酸/ビス - ペプチドの関連名称。
図3全体の合成スキームは拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4a 274 nmの粗生成物のHPLCトレース。
図4b。粗生成物のピークのMSスペクトル。
図5a。274 nmでの製品の精製HPLCトレース。
精製された生産の図5b。MSスペクトルトンピーク。
Discussion
本明細書に示される合成法は、一般的な固相ペプチド合成技術を用いてビス-アミノ酸ビルディングブロックからの官能ビス - ペプチドの合成方法を提供する。トランス-4 -ヒドロキシプロリン3からこれらの"PRO4"ビルディング·ブロックのモノマー合成は非常にスケーラブルであり、成功した600ミリモル（234グラム）スケール（未発表）でヒダントインステージに完了しました。一度モノマーが手にあり、固相技術の使用は、反応ワークアップおよび中間精製の 必要性を排除することによって我々の現在の液相の手法4より、ビス-ペプチド合成のより迅速な方法を提供します。
固相合成における主要な課題は中間体が単離されていませんので、解決合成の進歩と問題を診断しています。これは、遊離アミン（カイザーテスト10）またはフリーhydroxどうかを確認するには、それらを含む多くの発色テストの開発をリードしているyls（メチルレッド試験7）樹脂に公開されています。残念ながら、一般的に使用されるカイザーテスト10級炭素に結合した第二級アミンまたはアミンのほぼ排他的使用のために私たちの固相合成で一般的に適用されません。 HMBA樹脂上の評価のための他のオプションはヒドラジン11、UV / VIS 1,11によって監視される定量的なFmocを切断し、着信活性化合物を捕捉し、分析などの求核試薬を使用してテスト切断が含まれています。
固相合成におけるもう一つ見落とさ問題は、オペレータが必要とする合成ステップの反復的な性質である。これは心であると手動で固相ペプチド合成を行う際に、著者らは強く、スプレッドシートやチェックリストの使用をお勧めします。
一般的なα-アミノ酸に比べて固相合成用ビスペプチドの使用に難しく、立体ホアヒンのために多くの困難なカップリングの可能性が含まれていますdrance、樹脂上のジケトピペラジンの閉鎖の必要性、および同時脱保護カルボニル（Boc / tBuの、カルボ/ TBU）。別難しく、より従来の手段に比べ、この "セーフティキャッチ"の方法を用いて樹脂から定量的な放出を達成することにある。念頭に置いて、これらの要因と、それはこの方法のさらなる最適化が達成され、現在の努力がここで紹介する方法を改善するために我々のグループで進行中であることができる非常に可能性があります。
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
著者は、有益な議論は、この固相合成技術とマシューFLパーカーの初期の開発のための博士ザカリーZ.ブラウン、ジェニファーAllevaに感謝します。この作業はセファロン社でサポートされている国防脅威削減局（DOD-DTRA）（HDTRA1-09-1-0009）とホルストWitzelフェローシップ賞でサポートされています
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMBA-Am Resin | Novabiochem, EMD Millipore | 855018 | |
| MSNT | Novabiochem, EMD Millipore | 851011 | |
| NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
| DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
| Anhydrous DCM | Acros Organics | 34846 | Carcinogenic |
| 33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
| DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
| Anhydrous DMF | Acros Organics | 34843 | Flammable, Toxic |
| HOAt | GenScript | C01568 | |
| DIC | Acros Organics | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
| TIPS | Acros Organics | 21492 | Flammable, Toxic |
| Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
| NMP | Acros Organics | 36438 | Toxic |
| DMAP | Novabiochem, EMD Millipore | 851055 | Toxic |
| Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
| Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | D1281 | |
| SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
| LCMS | Agilent Technologies | 1200 Series | |
| Semi-Prep LC | Hewlett-Packard | 1100 Series | |
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7934027 | |
| Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
| Argon | Airgas | AR PP300CT |
References
- Atherton, E., Sheppard, R. C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1989).
- Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides. Biopolymers. 96, 578-585 (2010).
- Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. Shape-Programmable Macromolecules. Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).
- Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids. Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).
- Nielson, J., Lyngso, L. O. Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues. Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).
- Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports. Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).
- Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis. Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).
- Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation. Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).
- Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC. Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).
- Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Chan, W. C., White, P. D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2000).
- Vojkovsky, T. Detection of Secondary Amines on Solid-Phase. Peptide Research. 71, 236-237 (1995).
