Summary
HMBA 수지에서 절단 절차를 "안전 잡는 '활용하는 작용 비스 - 펩티드 trimer의 효율적인 고체 상 펩타이드 합성이 설명되어 있습니다.
Abstract
1962 년, RB Merrifield 효율적으로 펩티드를 합성하는 새로운 경로로 고체 상 펩타이드 합성을 사용하여 첫 번째 절차를 발간했습니다. 이 기술은 빠른 시간과 노동 모두에서 자사의 솔루션 상 전임자 이상의 유리임이 밝혀졌다. 고체 지원의 성격에 관한 개선, 보호 그룹은 고용과 지난 50 년 동안 고용 커플링 방법은 Merrifield의 원래 시스템의 유용성을 증가하고있다. 오늘날 Boc 기반 보호 및베이스 / nucleophile cleavable 수지 전략이나 Fmoc 기반 보호 및 산성 cleavable 수지 전략의 사용은 가장 일반적으로 펩티드 1의 합성에 사용되며, RC 셰퍼드에 의해 개척.
Merrifield의 탄탄한 지원 전략에 의해 영감을, 우리는 여기에서 설명하는 작용 비스 - 펩티드 2의 조립 Boc / tert-부틸 고체 상 합성 전략을 개발했습니다. t에 비해 고체 상 합성에의 이용O 용액 상 방법론은 Merrifield 1 설명된대로 시간과 노동을 모두에만 유리한 것이 아니라, 또한 비스 - 펩타이드 라이브러리의 합성에 매우 쉽게이 있습니다. 우리가 여기서 발휘하는 합성은 두 단계로 diketopiperazine 형성에 의한 수지의 비스 - 펩타이드 작용을 공개하는 메커니즘을 "안전 잡는 '사용하는 최종 절단 단계를 포함합니다.
비스 - 펩티드는 종류와 입체 monomeric 단위의 각각의 단량체 사이의 연결에 의해 제어 예측하고 designable 방법으로 기능을 배치할 수있는 비스 - 아미노산의 강성, spiro-래더 oligomers입니다. 각 비스 - 아미노산 두 개의 아미노산 (α-아민과 카르복실산) 3,4를 포함 stereochemically 순수한 주기적 발판이다. 저희 연구실은 현재 촉매 작용, 단백질 - 단백질 상호 작용과 N을 포함하여 분야의 다양한 기능에 걸쳐 비스 - 펩티드의 가능성을 조사하고 있습니다anomaterials.
Protocol
1. 설치
- 고체 상 합성을위한 반응이 설정은 그림 1과 같이 진공 하에서 밀폐된 여과 플라스크에 폴리 프로필렌 튜브를 통해 연결되어있는 폴리 프로필렌 필터 카트리지 또는 유리 반응기입니다. 반응은 자기 볶음 표시줄이나 반응을 통해 질소를 품어하여 혼합 수 있습니다.
- 그것이 반응 용기는 불활성 분위기 하에서 억제시킬 수 있으며 밀폐 용기에서 시약의 제거를 허용로 건조 튜브 및 석유 버블러 갖춘 아르곤 실린더에 연결된 가스 매니폴드도 권장합니다.
- 모든 작업은 연기 후드 및 적절한 개인 보호 장비 (안전 안경, 실험 복과 nitrile 장갑) 필요로 진행됩니다.
2. 수지에 비스 - 펩타이드 첫째로드
- 8 ML 반응 용기에 HMBA-AM 수지 (0.88 mmol / G 로딩, 100 μmol)의 114 MG를 저울질하고 자기 저어 막대를 추가합니다. 회의 최상위를 쏠적어도 5 분 동안 아르곤과 고무 심장과 퍼지 튜브와 전자 들어왔습니다.
- 한편, 그림 3 (586.63 g / 몰, 2eq)와 1 59.2 밀리그램의 화합물 1 117.3 밀리그램의 무게를 - (mesitylene-2-sulfonyl)-3-니트로-1 ,2,4-triazole (MSNT, 296.0 15 ML 일회용 원심 튜브로 G / 몰, 2eq) 2 ML 무수 dichloromethane (DCM)에서 해산. 완전히 녹아까지 솔루션과 믹스에 1-methylimidazole (NMI, 80.81 ML / 몰, 3eq) 24 μL를 추가합니다.
- 주사기를 통해 반응 혈관에 활성화된 솔루션을 전송하고 아르곤 하룻밤 (~ 10 시간) 아래로 휘몰아 수 있습니다.
- 심장을 제거하고 반응 혼합물을 드레인. DCM (5 배)와 dimethylformamide (DMF) (5 배)와 수지 씻으십시오. 수지로드의 정도를 평가하기 위해 섹션 10.1에서 설명한 "메틸 레드 시험"을 수행합니다. 수지는 메틸 레드 시험 중에 빨간색으로 남아있다면 2.2와 2.3가 반복되어야 단계. 부정적인 메틸 레드 시험 나타내는 노란 색깔, 선호이다;그러나, 모든 남아있는 수산기 그룹이 다음 단계로, 약간 긍정적인 결과 (밝은 오렌지색 수지 색상)에 공을되기 때문이다 허용있을 수 있습니다.
3. 상한 먼저 비스 - 펩타이드와 동시 수지의 Deprotection
- 반응 용기에 DCM 1 ML 추가 다음 삼십초 (기포 발생) 이상 아세트산 dropwise에 1 ML 33 % 브롬화 수소 (HBr)를 추가하고 15 분 동안 저어 수 있습니다. DCM (5 배)와 수지를 분출과 씻고 나서 다시 한 번 과정을 반복합니다.
- DCM (5 배) 후 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오. N의 5 % V / V 솔루션, DMF의 N-diisopropylethylamine (DIPEA) 후 DCM (5 배)하고 다시 DMF (5 배)로 씻어로 두 번 세척하여 수지를 무력화. "메틸 레드 시험"과 섹션 10.1 10.2에 나와 "chloranil 검사"를 수행합니다. 결과 chloranil 시험 메틸 시험 빨간색과 긍정을위한 부정이어야합니다.
4. 커플링 Boc / tBu 방지 작용 비스 - 아미더 산성 없음
- 무수 DCM로 세 번 세척하여 수지가 들어있는 반응 용기에 불활성 분위기를 다시 소개 그러면 심장과 아르곤 라인을 첨부합니다. 정화 및 무수 DCM에서 한두 ML를 추가하고 아르곤 라인 버블러가 상승하기 시작 때까지 선박 배수 30 초 동안 저어 놓아 혈관을 씻는다. 최소 한번 더이 작업을 수행합니다.
- 불꽃 건조 시험에서 DMF : 비스 - 아미노산 (3eq)와 2시 1분 DCM 2 ML 1 - 히드록시-7-azabenzotriazole (HOAt, 136.11 g / 몰, 18eq)의 245 밀리그램을 기능화 0.15 M의 용액을 준비한다 아르곤 분위기 하에서 튜브. diisopropylcarbodiimide 47 μL (DIC, 156.6 ML / 몰, 3eq)을 추가하고 90 분간 저어.
- 수지에 666 μL 무수 DMF 35 μL DIPEA를 (174.19 ML / 몰, 2eq) 추가 5 분 동안 저어 수 있습니다.
- 주사기를 통해 반응 용기에 미리 활성화된 비스 - 아미노산 솔루션을 전송하고 하룻밤 휘몰아 수 있습니다.
- 반응 혼합물을 분출과 무수 DCM로 두 번 씻어 하의 아르곤.
- diketopiperazine의 폐쇄를 홍보하려면 1시 1분 DCM의 4 ML에 HOAt (136.11 g / 몰, 10eq) 및 DIC (156.6 ML / 몰, 10eq)의 0.25 M 용액 추가 DMF하고 아르곤 아래로 휘몰아 수 1 시간 정도.
- 심장을 제거하고 반응 혼합물을 드레인. DCM (5 배)와 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오. 원하는 경우 섹션 10.2에서 논의된 "chloranil 테스트"를 수행합니다.
5. Boc / tBu 방지 작용 비스 - 아미노산의 Deprotection
- 반응 용기에 triisopropylsilane (도움말 참조)하고 1 시간 정도 저어 수 : 95:5 trifluororacetic 산 (TFA)의 솔루션이 ML을 추가합니다. 배수하고 다시 한 번 과정을 반복 DCM (5 배)로 약 30 초 동안 수지 씻는다.
- DCM (5 배) 후 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오. 그리고 DCM (5 배)하고 다시 DMF를 (5 배) 씻어 DMF에 DIPEA의 5 % V / V 솔루션으로 두 번 세척하여 수지를 무력화. 원하는 경우 섹션 10.2에서 논의된 "chloranil 테스트"를 수행합니다.
7. 비스 - 펩타이드의 Prolidine 엔드 Functionalizing
- 성장 비스 - 펩타이드의 prolidine 엔드는 diketopiperazine를 통해 독립적으로 또는 함께 acylated 수 있습니다. 또한이 부분이 무료로 아미노산을 affording, 후자를 죽습 수있는 보호 남아있을 수 있습니다. 원하는 경우, 커플링 효율을 평가하기 위해 섹션 10.2에 나와 "chloranil 테스트"를 수행합니다.
8. 비스 - 펩타이드의 제사기 엔드 Fmoc 및 Acylation의 Deprotection
- 20 분 동안 DMF의 20 % 피페리딘의 2mL 솔루션이 추가되고 반응이 혼합됩니다. DMF (5 배)와 수지를 분출과 씻고 나서 다시 한 번 과정을 반복합니다.
- DCM (5 배) 후 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오.
- MG 2 114과 N-methylpyrrolidone 2 ML (NMP)에 아미노산 (3eq)의 0.15 M 용액을 준비한다 - (7 아자 1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU, 380.2 g / 몰, 3eq)와 104.5 μL DIPEA (174.19 ML / 몰, 6eq)와 잘 섞는다. 반응 용기에 넣고 6 시간 동안 저어 수 있습니다.
- DCM (5 배) 후 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오.
9. 수지에서 아미노산과 다니엘를 묶고있는 수지에서 Boc 그룹 제거
- 반응 용기에 DCM 솔루션과 30 분간 볶음 수 : 1:1 TFA 2 ML을 추가합니다. DCM (5 배)와 수지를 분출과 씻고 나서 다시 한 번 과정을 반복합니다.
- 그리고 DCM (5 배) DMF (5 배)와 30 초 수지를 씻어 및 드레인.
- 무수 DMF의 10 % DIPEA의 솔루션이 ML을 추가하고 24~48시간 저어 수 있습니다.
- 미리 무게 둥근 바닥 플라스크에 반응 혼합물을 수집합니다. LC-MS의 약병에 THF의 450 μL에이 용액의 30 μL를 전송 및 분석을 위해 제출합니다. DMF의 추가 aliquots으로 수지를 씻어하고 둥근 바닥 플라스크에 수집 후 vacuo에서 용매 제거합니다.
10. 비스 - 펩타이드의 정제
- HPLC의 유리병에 삽입 디메틸 sulfoxide (100-250 μL) 및 전송의 최소 금액 비스 - 펩타이드 원유를 해산. 세미 prepitive HPLC 시스템 (휴렛 패커드 1100 시리즈)의 autosampler에 장소 인서트는 엑스 테라를 몰았어 초등학교 MS C18 5 μm의 7.8x150 밀리미터 칼럼과 100 μL 주입 루프가 장착되어.
- 274 NM에서 모니터링을하면서 삼십분 동안 0.1 % 개미의 산성과 함께 물에 5~95%의 acetonitrile의 그라디언트 프로그램을 사용하여 샘플의 여러 50 μL 주입을 수행합니다. 미리 무게 일회용 원심 튜브에 제품 피크를 수집하고 lyophilizer를 사용하여 건조 동결.주의는 일반적으로 관찰되고 분석 LCMS에 비해 피크 유지 시간에 약간의 변화로 처음 실행으로 연결됩니다.
11. 평가 방법
- 메틸 레드 테스트 7: 일회용 피펫을 통해 건조 수지 ~ 1 밀리그램을 제거 4 ML 반응 용기에 린스. 500 μL 무수 DCM에 20 밀리그램 메틸 레드, 50 μL N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), 5 MG 4-dimethylaminopyridine (DMAP)의 솔루션을 추가하고 5-10 분 동안 저어 수 있습니다. 분출과 여과물가 무색 될 때까지 DCM와 수지를 씻는다. 긍정적인 징후가 주황색이나 빨간색이 남아있는 수지 비즈입니다.
- CHLORANIL TEST를 12 : 전송 ~ 일회용 피펫을 통해 작은 유리병에 건조 수지 1 밀리그램. 0.8 밀리미터 DMF 용액에서 chloranil 및 DMF 용액에 2 % 아세트 알데히드 모두 3 방울을 추가하고 5-10분 동안 실내 온도에 앉아 보자. 긍정적인 징후가 보라색 / 청색 터닝 수지 비즈입니다.
- 활성 트랩 테스트 : 합성하는 동안 활성 화합물은 액체 크로마 토그래피 - 질량 분석법 (LC-MS) pyrrolidine 50 μL를 포함 유리병에 활성 솔루션의 소량 (5-10 μL)를 전송하여 평가 할 수 있습니다. 몇 초 동안 손으로 믹스 (soluti에 tetrahydrofuran (THF)의 450 μL로 희석와 LC-MS 분석에 제출 후) 노란색 수있게됩니다.
- 분석 LC-MS : 최종 제품 및 활성 중간체는 워터스 엑스 테라를 몰았어 MS C18 3.5 μm의이 장착된 HP 1200 시리즈 LC-MS 시스템을 사용하여 평가받을 수있는 4.6 mm X 150mm 칼럼과 물에 5-95%의 acetonitrile의 기울기 시스템 삼십분 이상 0.1 % 개미의 산성으로.
12. 대표 결과
두 원유의 예 (그림 4)와 정화는 (그림 5) LCMS의 흔적이 제공됩니다. 약 10 %의 정제 수율은 위에서 설명한 방법을 사용하여 예상된다.
그림 1. 고상 합성에 대한 실험 설정의 다이어그램.
그림 2.비스 - 아미노산 / BIS-펩티드의 관련 명명법.
그림 3. 전체 합성 제도. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
그림 4A. 274 NM에서 조잡 제품의 HPLC 추적.
그림 4B. 조잡 제품 피크의 MS 스펙트럼.
그림 5A. 274 NM에서 제품을 죄를 씻고의 HPLC 추적.
정화 Produc의 그림 5B. MS 스펙트럼t 피크.
Discussion
본 발표 합성 방식은 일반적인 고체 상 펩타이드 합성 기술을 사용하여 비스 - 아미노산 빌딩 블록에서 작용 비스 - 펩티드의 합성에 대한 방법을 제공합니다. 트랜스-4-hydroxyproline 3에서 이러한 "Pro4"빌딩 블록의 단량체 합성은 높은 확장성이며 성공적으로 600 mmol (234 G) 규모 (게시되지 않은)에서 hydantoin 단계로 완료되었음을 알려드립니다. 단량체가 손에있다되면 고체 상 기술을 사용하여 반응 직장 업과 중간 purifications에 대한 필요성을 제거하여 현재 솔루션 상 방법론 4보다 비스 - 펩타이드 합성의 더 빠른 방법을 제공합니다.
고체 상 합성의 주요 과제는 더 중간체가 고립되지부터 해결 합성 진보와 문제를 진단하고 있습니다. 이것은 식별 비롯하여 많은 colorimetric 시험의 개발에 앞서있다면 무료로 아민 (카이저 시험 10) 또는 무료 하이드yls (메틸 레드 시험 7) 수지에 노출됩니다. 불행히도, 일반적으로 사용되는 카이저 시험 10 제사기 탄소에 연결된 보조 아민 또는 아민의 거의 독점적인 사용으로 인한 우리의 고체 상 합성에서 일반적으로 적용되지 않습니다. HMBA 수지에 대한 평가를위한 다른 옵션은 히드 라진 11, VIS / UV 1,11에 의해 모니터링 정량 Fmoc 절단으로 nucleophile를 사용하고 포집 및 수신 활성 화합물을 분석하는 테스트 cleavages을 포함합니다.
고체 상 합성의 또 다른 간과할 문제는 운영자가 필요한 합성 단계의 반복적인 성격이다. 이것은 마음과 함께 모든 수동 고체 상 펩타이드 합성을 수행할 때, 저자는 강력하게 스프레드 시트 또는 체크리스트의 사용을 권장합니다.
흔히 α-아미노산에 비해 고체 상 합성을위한 비스 - 펩티드를 사용하는 difficultly은 steric 힌을로 인해 더 어려워 커플링의 가능성을 포함drance, 온 - 수지 diketopiperazine의 폐쇄에 대한 필요성, 그리고 동시 deprotections (Boc / tBu; Cbz / tBu). 또 다른 difficultly 더 전통적인 방법에 비해이 "안전 캐치"방법을 사용하여 수지의 양적 자료를 달성에있다. 염두에두고 이러한 요소의 경우는,이 방법의 더 최적화가 달성하고 현재의 노력이 여기에 제시된 방법을 개선하기 위해 그룹에서 진행 될 수있는 것은 아주 가능하다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 유용한 토론이 고체 상 합성 기술과 매튜 플로리다 파커의 초기 개발을 위해 박사 Z, 재커리 브라운과 제니퍼 Alleva 감사드립니다. 이 작품은 Cephalon, 주식 회사에서 지원하는 국방 위협 감소 기관 (국방부-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009)와 호르스트 Witzel 원정대 수상에 의해 지원됩니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMBA-Am Resin | Novabiochem, EMD Millipore | 855018 | |
| MSNT | Novabiochem, EMD Millipore | 851011 | |
| NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
| DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
| Anhydrous DCM | Acros Organics | 34846 | Carcinogenic |
| 33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
| DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
| Anhydrous DMF | Acros Organics | 34843 | Flammable, Toxic |
| HOAt | GenScript | C01568 | |
| DIC | Acros Organics | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
| TIPS | Acros Organics | 21492 | Flammable, Toxic |
| Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
| NMP | Acros Organics | 36438 | Toxic |
| DMAP | Novabiochem, EMD Millipore | 851055 | Toxic |
| Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
| Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | D1281 | |
| SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
| LCMS | Agilent Technologies | 1200 Series | |
| Semi-Prep LC | Hewlett-Packard | 1100 Series | |
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7934027 | |
| Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
| Argon | Airgas | AR PP300CT |
References
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