Summary
Bir HMBA reçineden Yarılma Prosedürü: "emniyet yakalamak" kullanılarak, bir fonksiyonlandırılmış bis-peptit trimerininkinden verimli bir katı-faz peptid sentezi açıklanmaktadır.
Abstract
1962 yılında, RB Merrifield verimli bir peptid sentezi için yeni bir yol olarak katı-faz peptid sentezi ile ilk yayınlanmış prosedürü. Bu teknik, hızlı zaman ve emek hem de çözüm fazlı önceki üzerinden avantajlı olduğunu kanıtladı. Sağlam bir destek niteliği ile ilgili Gelişmeler, koruyucu gruplar istihdam ve son beş yılda istihdam kaplin yöntemleri yalnızca Merrifield orijinal sistemin yararlılığı artmaktadır. Günümüzde, bir Boc-bazlı koruyucu ve baz / nükleofil yarılabilir reçine strateji veya Fmoc-bazlı koruma ve asidik reçine yarılabilir stratejisinin kullanımı, en yaygın olarak 1 peptit sentezi için kullanılır, RC Sheppard öncülük.
Merrifield en katı destek stratejisi esinlenerek, biz burada açıklanan fonksiyonlandırılmış bis-peptidler 2, montaj için bir Boc / tert-bütil katı-faz sentezi bir strateji geliştirdik. T karşılaştırıldığında, katı-faz sentezi ile kullanılmako çözelti faz yöntemleri Merrifield 1 tarafından tarif edildiği gibi zaman ve hem de çalışma avantajlı olarak, yalnızca değil ama aynı zamanda bis-peptid kütüphaneleri sentezinde daha kolay bir şekilde sağlar. Burada göstermektedir ki sentezi iki adımlı bir diketopiperazine oluşumu ile reçineden bis-peptit fonksiyonlandırılmış serbest bırakmak için mekanizması "emniyet yakalamak" kullanan bir son bölünme aşaması içerir.
Bis-peptidler tipi ve stereokimyasal monomer birimlerinden ve her bir monomer arasındaki bağlantı ile kontrol edilen bir tahmin edilebilir ve designable şekilde, işlevselliği konumlandırmak için mümkün olan bis-amino asit, katı, spiro-merdiven oligomerler vardır. Her bir bis-amino asit, iki amino asit (bir α-amin ile bir karboksilik asit) 3,4 içeren bir stereokimyasal olarak saf, siklik iskelesi olup. Laboratuvarımız şu kataliz, protein-protein etkileşimleri ve n de dahil olmak üzere, geniş bir alan üzerinde çeşitli işlevsel bir bis-peptidlerin potansiyeli soruşturmaanomaterials.
Protocol
1. Kurulum
- Katı faz sentezi için reaksiyon kurulum Şekil 1 'de gösterildiği gibi, vakum altında kapalı bir filtreleme şişesine polipropilen hortumu aracılığıyla bağlı olan bir polipropilen filtre kartuş veya cam reaktör olup. Reaksiyon, bir manyetik karıştırma çubuğu ile veya reaktör ile azot gazı ile karıştırılabilir.
- Bu reaksiyon kabına inert bir atmosfer altında bulunan imkan verir ve ambalajlarında gelen reaktiflerin çıkarılmasını sağlar gibi bir kurutma tüpü ve yağ bubbler ile donatılmış bir silindir Argon bağlanmış bir gaz manifoldu ayrıca tavsiye edilir.
- Tüm işlemler bir çeker ocak ve uygun kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü ve nitril eldiven) gereklidir yapılmaktadır.
2. Reçine üstüne Bis-Peptid İlk Yükleme
- 8 ml reaksiyon kabı içerisine HMBA-AM Reçine (0.88 mmol / g yükleme, 100 mmol) 114 mg tartılır ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Th tepe başlıken az 5 dakika argon ile bir lastik septum ve tahliye borusu ile e gemi.
- Bu arada, Şekil 3 (586,63 g / mol, 2 eşdeğer) ve 1 59.2 mg bileşik 1 ile 117,3 mg ağırlığında - (mezitilen-2-sülfonil)-3-nitro-1 ,2,4-triazol (MSNT, 296.0 Bir 15 mL atılabilir santrifüj tüpüne g / mol, 2 eşdeğer) ve 2 ml susuz diklorometan (DCM) içinde çözülür. Eritilip solüsyon ve karışımına 1-metilimidazol (NMI, 80,81 mL / mol, 3 eşdeğer) 24 uL ekleyin.
- Şırınga yoluyla reaksiyon kabına aktarılması çözeltisi aktive edilmiş ve gece boyunca argon (~ 10 saat) karıştırılmasına izin verir.
- Septum çıkarın ve reaksiyon karışımı süzün. DCM (5x) ve dimetilformamit (DMF) (5x) ile reçine yıkanır. Reçine yükleme derecesini değerlendirmek için bölüm 10.1 açıklanan "metil kırmızısı testi" yapın. Reçine metil kırmızısı testi sırasında kırmızı kalırsa daha sonra 2.2 ve 2.3 tekrarlanması gereken adımlar. Olumsuz bir metil kırmızısı testi göstergesidir sarı bir renk, tercih edilir;Ancak, kalan hidroksil grupları sonraki adım, biraz daha pozitif sonuç (açık turuncu renkli reçine) kapağı kapatılmış olacak beri kabul edilebilir.
3. Kapatma İlk Bis-Peptid ve Simultane Reçine deproteksiyonu
- Reaksiyon kabına DCM 1 mL sonra 30 saniye (köpürme meydana) içinde damla damla asetik asit içinde 1 mL% 33 hidrojen bromür ilave ve 15 dakika için karıştırılmaya izin verir. DCM (5x) ile reçine boşaltın ve yıkayın sonra bir kez daha işleyecek tekrarlayın.
- DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. N, bir% 5 v / v çözeltisi, DMF içinde bir N-diizopropiletilamin (DIPEA) daha sonra DCM (5x) ve tekrar DMF (5x) ile yıkama ile iki kez yıkanarak reçine nötralize. "Metil kırmızısı testi" ve bölüm 10.1 ve 10.2 tartışılan "kloranil testi" yapın. Sonuçlar kloranil test için metil testi kırmızı ve pozitif negatif olmalıdır.
4. Kavrama Boc / tBu-Korumalı Fonksiyonlu Bis-AmiHiçbir Asit
- Susuz DCM ile üç kez yıkanarak reçine içeren reaksiyon teknesine bir inert atmosfer reintroduce daha sonra bir septum ve argon hattı takın. Temizlemek ve susuz DCM 1-2 ml ekleyerek ve argon hattı bubbler yükselmeye başlayıncaya kadar sonra geminin boşaltılması 30 saniye boyunca heyecan vererek gemi yıkayın. En az bir kez daha yapın.
- Bir alev kurutulmuş test DMF: bis-amino asit (3eq.) ve 2:1 DCM 2 mL, 1-hidroksi-7-azabenzotriazole (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) ile fonksiyonelleştirilmiş 245 mg 0.15 M çözeltisi hazırlayın argon atmosferi altında bir tüp. Diisopropilkarbodiimide 47 uL (DIC, 156.6 ml / mol, 3eq.) ekleyin ve 90 dakika daha çırpın.
- Reçineye 666 uL susuz DMF içinde 35 uL DIPEA (174,19 mL / mol, 2 eşdeğer) ekleyin ve 5 dakika için karıştırılmıştır izin verir.
- Şırınga yoluyla reaksiyon kabına pre-aktive bis-amino asit çözeltisi aktarılır ve gece boyunca karışmaya izin verir.
- Reaksiyon karışımı akmasını ve susuz DCM ile iki kez yıkayıp altında iken argon.
- Diketopiperazine kapanması teşvik etmek için, 1:1 DCM bir 4 mL HOAt (136,11 g / mol, 10eq) ve DIC (156.6 mL / mol, 10eq) ve bir 0.25 M solüsyon ilave: DMF ve argon altında karıştırılır izin 1 saat karıştırıldı.
- Septum çıkarın ve reaksiyon karışımı süzün. DCM (5x) ve DMF (5x) ile reçine yıkanır. Eğer istenirse, bölüm 10.2 tartışılan "kloranil test" gerçekleştirin.
5.. Boc / tBu-Korumalı Fonksiyonlu Bis-Amino Asit deproteksiyonu
- Reaksiyon kabına triisopropylsilane (TIPS) ve 1 saat için karıştırılmaya izin: 95:5 trifluororacetic asit (TFA) solüsyonu 2 ml ilave edilir. Suyunu süzün ve daha sonra bir kez daha işlemi yineleyin DCM (5x) ile yaklaşık 30 saniye reçine yıkayın.
- DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. Daha sonra DCM (5x) ve tekrar DMF (5x) yıkayıp DMF içinde DIPEA bir% 5 v / v çözeltisi ile iki kez yıkanarak reçine nötralize. Eğer istenirse, bölüm 10.2 tartışılan "kloranil test" gerçekleştirin.
7. Bis-Peptid Prolidine End göstermeye çalışıyor
- Büyüyen bir bis-peptid prolidine ucu bir diketopiperazine aracılığıyla tek tek veya birlikte asilatlanabilir. Ayrıca, bu amaçla serbest amino asit affording, ikinci parçalanabilen edilecek olan, korunan bırakılabilir. İsterseniz, kaplin verimliliğini değerlendirmek için bölüm 10.2 tartışılan "kloranil test" gerçekleştirin.
8. Bis-Peptid Kuvaterner sonu Fmoc ve Açilleme deproteksiyonu
- 20 dakika boyunca DMF içinde% 20 piperidin bir 2mL solüsyonu ilave edilir ve reaksiyon karıştırılır. DMF (5x) ile reçine boşaltın ve yıkayın sonra bir kez daha işlemi tekrarlayın.
- DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır.
- 114 mg 2 ile N-metilpirrolidon 2 mL (NMP) amino asit (3eq.) bir 0.15 M solüsyon hazırlanır - (7-aza-1 H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3- (HATU, 380.2 g / mol, 3 eşdeğer) ve 104.5 uL DIPEA (174,19 mL / mol, 6EQ) ve iyice karıştırın. Reaksiyon kabına ekleyin ve 6 saat boyunca karıştırılır izin verir.
- DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır.
9. Reçine gelen Amino Asit ile Cleave Bound reçineden Boc grubu çıkarın
- Reaksiyon kabına DCM çözeltisi ve 30 dakika için karıştırılmaya izin: a 1:01 TFA 2 ml ilave edilir. DCM (5x) ile reçine boşaltın ve yıkayın sonra bir kez daha işleyecek tekrarlayın.
- Sonra DCM (5x) DMF (5x) ile 30 saniye reçine yıkayın ve süzün.
- Susuz DMF içinde% 10 DIPEA bir çözelti 2 mL ekleyin ve 24-48 saat için karıştırılmaya izin verir.
- Önceden tartılmış yuvarlak dipli bir balona Reaksiyon karışımı Collect. LC-MS, bir şişe içinde THF içinde 450 uL Bu çözeltinin 30 uL transferi ve analiz için teslim. DMF ilave alikotları ile reçine yıkanır ve yuvarlak dipli bir balona toplamak ve sonra solvent vakumda kaldırın.
10. Bis-Peptid saflaştırılması
- HPLC flakon yerleştirmeye dimetil sülfoksit (100-250 uL) ve transfer bir asgari tutarda bis-peptid ham eritin. Yarı-prepitive HPLC sistemi (Hewlett Packard 1100 Serisi) ile otosampler'li içine Yeri insert bir Xterra Hazırlık MS C18 5 mikron 7.8x150 mm sütun ve 100 uL enjeksiyon loop ile donatılmıştır.
- 274 nm'de izlerken 30 dakika içinde% 0.1 formik asit ile su içinde% 5-95 asetonitril gradyan programı kullanılarak örnek 50 uL birden fazla enjeksiyon gerçekleştirmek. Önceden tartılmış tek santrifüj tüpündeki ürünü pik toplayın ve bir lyophilizer kullanılarak kuru dondurma. Dikkat tipik olarak görülür analitik LCMS göre pik tutma süresi hafif bir kayma olarak ilk çalıştırma ile alınmalıdır.
11. Değerlendirme Yöntemleri
- METİL KIRMIZI TEST 7: Pipet ile kuru reçine ~ 1 mg çıkarın ve 4 mL reaksiyon kabı içerisine durulayın. 500 uL susuz DCM içerisinde 20 mg metil kırmızı, 50 uL N, N'-diizopropilkarbodiimid (DIC), ve 5 mg 4-dimetilaminopiridin (DMAP) içindeki bir çözeltisine ilave edip 5-10 dakika için karıştırılmaya izin verir. Boşaltın ve süzüntü renksiz hale gelinceye kadar DCM ile reçine yıkayın. Pozitif göstergesi turuncu veya kırmızı kalan reçine boncuk olduğunu.
- Kloranil TEST 12: Transfer ~ pipet aracılığıyla küçük bir şişeye kuru reçine 1 mg. Bir 0,8 mM DMF çözelti içinde kloranil ve DMF solüsyonu içinde% 2 asetaldehit hem 3 damla ekleme ve 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. Pozitif göstergesi mor / mavi dönüm reçine boncuk olduğunu.
- AKTİVASYON TRAP TEST: sentezi sırasında aktive bileşikler, bir sıvı kromatografi-kitle spektrometresi (LC-MS) pirolidin 50 uL ihtiva eden bir şişeye aktive çözeltisi küçük bir miktarda (5-10 uL) aktararak değerlendirilebilir. Birkaç saniye için elle karıştırın (solutiüzerine tetrahidrofuran (THF) 450 uL ile sulandırmak ve LC-MS analiz için teslim sonra) sarı olmalıdır.
- Analitik LC-MS: nihai ürün ve aktive edilmiş ara ürünler, bir Waters Xterra MS C18 3,5 um ile donatılmış bir HP 1200 serisi LC-MS sistemi kullanılarak değerlendirilebilir 4.6 mm x 150 mm sütun ve su içinde% 5-95 asetonitril oluşan bir gradyan sistemi 30 dakika içinde% 0.1 formik asit ile.
12. Temsilcisi Sonuçlar
Bir hem ham örnek (Şekil 4) ve saflaştırılmış (Şekil 5) LCMS izleri sağlanmaktadır. Yaklaşık% 10 verim saflaştırılmış yukarıda açıklanan yöntemler kullanılarak tahmin edilmektedir.
Şekil 1. Katı Faz Sentezi için deneysel Set-Up diyagramı.
Şekil 2.Bis-Amino Asitler / Bis-Peptitler ilgili isimlendirme.
Şekil 3. Genel Sentez şeması. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4a. 274 nm'de Ham Ürün HPLC Trace.
Şekil 4b. Ham Ürün Peak MS Spektrumu.
Şekil 5a. 274 nm'de Ürün Saflaştırılan HPLC Trace.
Saf Product Şekil 5b. MS Spektrumut Tepe.
Discussion
Burada sunulan sentetik bir yaklaşım sık katı-faz peptid sentezi yöntemleri kullanılarak bis-amino asit inşa edici bloklar fonksiyonlandırılmış bis-peptid sentezi için bir yöntem sağlar. Trans-4-hidroksiprolin 3 bu "Pro4" yapı taşlarından monomer sentezi yüksek ölçeklenebilir ve başarılı bir 600 mg (234 gr) ölçeği (yayımlanmamış) de hidantoin aşaması tamamlanmıştır. Monomerler yandan yerleştirildikten sonra, katı-faz tekniklerin kullanımı reaksiyon work-up ve ara saflaştırılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, mevcut çözelti faz yöntemleri 4 den bis-peptid sentezi daha hızlı bir yöntem sağlar.
Katı faz sentezinde primer zorluğun, ara izole edilir yana çözme sentetik ilerleme ve problem teşhis edilir. Bu tanımlamak için de dahil olmak üzere pek çok kolorimetrik testlerin gelişmesine yol açmıştır halinde serbest aminlerin (Kaiser Testi 10) ya da serbest hydroxYLS (Metil Red Testi 7) reçine maruz kalmaktadır. Ne yazık ki, yaygın olarak kullanılan Kaiser Testi 10, bir kuaterner karbona bağlı sekonder aminler ya aminlerin hemen özel kullanımına bağlı olarak bizim katı-faz sentezi genel olarak uygulanabilir değildir. HMBA reçine değerlendirmesi için diğer seçenekler gibi hidrazin 11, UV / Vis 1,11 ile takip kantitatif Fmoc bölünme gibi bir nükleofil kullanarak ve yakalama ve gelen aktif bileşikler analiz testi bölünmelere içerir.
Katı-faz sentezi dahilinde bir başka sorun, göz ardı operatör tarafından istenen sentetik adımlardan tekrarlanan olmasıdır. Bu zihin ile herhangi bir manuel katı-faz peptid sentezi gerçekleştirirken, yazarlar güçlü bir elektronik tablo veya kontrol listesi kullanmanızı öneririz.
Ortak bir α-amino asit ile karşılaştırıldığında bir katı-faz sentezi için bis-peptidler kullanarak zor sterik hin nedeniyle daha zor kavramaları için potansiyel içerirdrance, on-reçine diketopiperazine kapatma ihtiyacı ve aynı anda deprotections (Boc / tBu; Cbz / tBu). Başka daha zor geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu "emniyet mandalı" yöntemi ile reçineden sayısal yayın elde yatmaktadır. Akılda bu faktörler ile, bu yöntemin daha optimizasyonu sağlanır ve mevcut çabaları burada sunulan yöntemi geliştirmek için grubumuzda sürmektedir edilebilir olması çok mümkündür.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, yararlı tartışmalar için bu katı faz sentezi tekniği ve Matthew FL Parker ilk geliştirme Dr Zachary Z. Brown ve Jennifer Alleva teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Cephalon, Inc tarafından desteklenen Savunma Tehdit Azaltma Dairesi (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) ve Horst Witzel Burs Ödülü tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMBA-Am Resin | Novabiochem, EMD Millipore | 855018 | |
| MSNT | Novabiochem, EMD Millipore | 851011 | |
| NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
| DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
| Anhydrous DCM | Acros Organics | 34846 | Carcinogenic |
| 33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
| DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
| Anhydrous DMF | Acros Organics | 34843 | Flammable, Toxic |
| HOAt | GenScript | C01568 | |
| DIC | Acros Organics | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
| TIPS | Acros Organics | 21492 | Flammable, Toxic |
| Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
| NMP | Acros Organics | 36438 | Toxic |
| DMAP | Novabiochem, EMD Millipore | 851055 | Toxic |
| Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
| Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | D1281 | |
| SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
| LCMS | Agilent Technologies | 1200 Series | |
| Semi-Prep LC | Hewlett-Packard | 1100 Series | |
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7934027 | |
| Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
| Argon | Airgas | AR PP300CT |
References
- Atherton, E., Sheppard, R. C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1989).
- Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides. Biopolymers. 96, 578-585 (2010).
- Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. Shape-Programmable Macromolecules. Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).
- Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids. Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).
- Nielson, J., Lyngso, L. O. Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues. Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).
- Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports. Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).
- Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis. Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).
- Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation. Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).
- Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC. Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).
- Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Chan, W. C., White, P. D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2000).
- Vojkovsky, T. Detection of Secondary Amines on Solid-Phase. Peptide Research. 71, 236-237 (1995).
