Summary
L'objectif est de surveiller l'état redox mitochondrial de coeurs isolés dans le contexte de la précharge physiologique et les pressions postcharge. Un modèle de travail biventriculaire coeur de lapin est présenté. Haute résolution spatio-temporelle imagerie par fluorescence de NADH est utilisée pour surveiller l'état mitochondriale redox de tissu épicardique.
Abstract
Depuis sa création par Langendorff 1, le cœur isolé perfusé reste un outil privilégié pour l'étude de la physiologie cardiaque 2. Toutefois, il n'est pas bien adapté pour les études de métabolisme cardiaque, qui exigent le cœur d'accomplir un travail dans le contexte de la précharge physiologique et les pressions postcharge. Modifications introduites Neely à la technique de Langendorff pour établir appropriée ventricule gauche (VG) précharge et postcharge. 3 pressions Le modèle est connu sous le nom du modèle isolé LV coeur et de travail a été largement utilisée pour étudier la performance et le métabolisme LV 4-6. Ce modèle, cependant, ne fournit pas un ventricule correctement chargé droite (VD). Demmy et al. D'abord rapporté un modèle biventriculaire comme une modification du modèle LV coeur fonctionnant 7, 8. Ils ont constaté que le développement du volume systolique, le débit cardiaque et la pression améliorée dans les coeurs convertis à partir du mode de travail pour LV mode de fonctionnement biventriculaire 8 8.
Lorsque l'on étudie les effets métaboliques de la lésion myocardique, tels que l'ischémie, il est souvent nécessaire pour identifier l'emplacement du tissu affecté. Cela peut être fait par l'imagerie de la fluorescence du NADH (la forme réduite du nicotinamide adénine dinucléotide) 9-11, une coenzyme trouve en grandes quantités dans les mitochondries. NADH fluorescence (fNADH) affiche une relation presque linéaire inverse avec 12 la concentration en oxygène local et fournit une mesure de l'état redox mitochondrial 13. imagerie fNADH dans des conditions hypoxiques et ischémiques a été utilisé comme une méthode sans colorant pour identifier les régions hypoxiques 14, 15 et pour surveiller la progression de lades conditions hypoxiques au fil du temps 10.
L'objectif de la méthode consiste à surveiller l'état redox mitochondrial de biventriculaire coeurs de travail au cours des protocoles qui modifient la vitesse du métabolisme des myocytes ou d'induire l'hypoxie ou de créer une combinaison des deux. Coeurs de lapins blancs de Nouvelle-Zélande ont été reliés à un système de travail cardiaque biventriculaire (Hugo Sachs Elektronik) et perfusés avec mise à jour de Krebs-Henseleit solution 16 à 37 ° C. Aortique, LV, artère pulmonaire, et à gauche et à droite pressions auriculaires ont été enregistrées. L'activité électrique a été mesurée en utilisant une électrode potentiel d'action monophasique. Pour l'image fNADH, la lumière d'une lampe au mercure a été filtré (350 ± 25 nm) et servant à éclairer l'épicarde. La lumière émise a été filtré (460 ± 20 nm) et imagée à l'aide d'une caméra CCD. Changements dans le fNADH épicardique du cœur biventriculaire de travail au cours de différentes fréquences de stimulation sont présentés. La combinaison du modèle d'imagerie cardiaque et fNADHfournit un nouvel outil fort utile pour l'étude expérimentale des pathologies cardiaques aiguës dans le cadre de réalistes des conditions physiologiques.
Protocol
1. Configuration pour l'étude
- Préparer quatre litres de mise à jour de Krebs-Henseleit solution à 16 (en mm: 118 NaCl, KCl 3,30, 2,00 CaCl 2, MgSO 4 1,20, 24,0 NaHCO 3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 glucose, 2,00 NaPyruvate, et 20,0 mg / L d'albumine ). La solution doit être préparé comme fermer le début de l'expérience que possible. Le pH doit être ajusté à 7,4 après filtration stérile (taille des pores: 22 pm, Corning). Osmolalité de la solution devrait être entre 275 et 295 mOsm / kg.
- Rincez tous les tubes et les chambres du système coeur de travailler avec de l'eau purifiée. Faire fonctionner les pompes d'eau jusqu'à ce que tout a été retiré du système.
- Ajoutez des filtres membrane de cellulose (taille des pores: 5 um, Advantec) en ligne avec chacune des pompes de perfusion (pompe à perfusion de Langendorff, à gauche pompe à perfusion cardiaque, et à droite de la pompe de perfusion cardiaque).
- Effectuer un étalonnage en deux points (0 et 60 mmHg) pour chaque capteur de pression.
- Tourner sur les bains d'eau. Un bain d'eau chauffée circule (Cole Palmer) est utilisée pour chauffer les tubes chemises d'eau et d'échangeurs de chaleur. Perfusat est pré-chauffé dans un bain d'eau séparée (Oakton Instruments). Deux bains sont mis pour maintenir une température de solution de 37 ° C
- Activer les pompes pour faire circuler le liquide de perfusion en boucle fermée. Perfusat traverse oxygénateurs microfibre (hémofiltres) gazés avec 95% d'O 2 et 5% de CO 2 à 80 kPa. Perfusat oxygénée s'écoule ensuite à travers des échangeurs de chaleur pour le maintenir à une température de 37 ° C avant d'entrer dans la canule coeur.
2. Excision Coeur
- Commencer par le réglage du système cardiaque de travail pour fonctionner en mode de pression Langendorff constante. Régler la pression du bloc aortique dans la plage de 50 à 60 mmHg.
- Anesthésier le lapin avec une injection intramusculaire de kétamine (44 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Après le lapin est sous sédation, le pentobarbital (50 mg / Kg) et de l'héparine (2000 U) est injecté par voie intraveineuse par la veine marginale de l'oreille ou la veine saphène latérale à l'intérieur de la patte postérieure.
- Lorsque le lapin est entièrement non-réactif, tel que déterminé par une absence de douleur réflexe, la cavité thoracique est rapidement ouvert, le péricarde est tranché, l'aorte est serré, et le cœur et les poumons sont excisées. À ce stade, les poumons doivent être restée attachée au cœur d'aider à isoler les veines pulmonaires.
- Isoler et cathétériser l'aorte avec une canule diamètre de 5 mm, fixée à une seringue remplie de 60 ml perfusat et 200 unités d'héparine. Fixez l'aorte à la canule avec une suture de soie taille zéro et appuyez lentement la seringue pour vider le coeur de sang.
3. Canulation biventriculaire
- Branchez le coeur au bloc aortique du coeur du système de travail. Empêcher l'air de pénétrer dans l'aorte, ce qui peut provoquer une embolie coronaire. Il est préférable de fixer la canule à la bl aortiqueock en approchant le connecteur aortique à un angle oblique et permettant perfusat doucement goutte à goutte à partir du connecteur dans la canule tout en elle est attachée.
- Alors que le coeur est perfusé en mode de pression constante de Langendorff, retirer le tissu adipeux et conjonctif et localiser les vaisseaux suivants: inférieure et la veine cave supérieure, veine azygos, artère pulmonaire, les veines pulmonaires.
- Ligaturer la veine cave supérieure. Couper l'artère pulmonaire juste en dessous où elle se ramifie dans les artères pulmonaires droite et gauche.
- Groupe de tous les navires restants (les veines pulmonaires) entre le cœur et les poumons et ligaturer tout faire avec une suture. Retirez les poumons.
- Découpez un petit trou dans le coin de l'auricule gauche. Veiller à ce que le LA est rempli de liquide de perfusion. Cathétériser le LA tout en s'assurant que la canule est complètement rempli de liquide de perfusion pendant qu'il est inséré. Suturer la canule à l'appendice de Los Angeles.
- Mettre la pompe de gauche (pompe # 2) pour fournir un débit de til a quitté l'atrium. Régler la pression de précharge entre 2-6 mm Hg et ajuster ± 2 mm Hg, tel que déterminé par la dilatation auriculaire.
- Mettre le cœur à cœur le mode de travail en désactivant la pompe de Langendorff (pompe # 1).
- Momentanément diminuer la pression aortique à 10 mm de Hg et ensuite l'augmenter lentement dans la plage de 80 à 100 mmHg. Cela permettra à la valve aortique à ouvrir et à fonctionner comme il le ferait dans des conditions normales physiologiques. La pression postcharge finale dépendra de la contractilité du ventricule gauche. Il doit être réglé à une valeur qui est d'environ 20 mmHg moins que le pic de pression LV.
- LV cardiaque de sortie peut être déterminée en mesurant le débit de perfusion aortique la sortie du bloc (ml / min). Le débit cardiaque normale est comprise entre 14,77 et 16,43 ml / min pour 100 g de poids corporel et 17 moyennes 340 ml / min pour un lapin 2.2 kg. La pression aortique devrait ressembler le signal de pression de la figure 1.
- Cathétériser la RA par l'inferior la veine cave. Faire en sorte que tous deux l'RA et la canule sont complètement remplis de perfusat et insérer la canule tout en empêchant la formation de bulles d'air. Suturer la canule de la veine.
- Mettre la pompe de droite (pompe # 3) pour fournir un débit à l'oreillette droite. Régler la pression à environ 3 mmHg.
- Assurez-vous que le RV est rempli de liquide de perfusion et de cathétériser l'artère pulmonaire. Faire en sorte que la canule est complètement rempli de liquide de perfusion pendant qu'il est inséré pour empêcher des bulles d'air. Suturer la canule à l'artère pulmonaire.
4. Acquisition du signal: Pressions, potentiels d'action monophasiques et fNADH
- Une fois canulation biventriculaire est terminée, insérez soigneusement le cathéter capteur de pression (Millar) dans l'aorte par la canule aortique. Doucement à s'y retrouver dans le passé de la valve aortique et dans le LV. Surveiller le signal de pression LV pour assurer un bon positionnement de l'extrémité du cathéter. Un exemple de la pression VG est montréà la figure 1.
- Appuyez doucement sur l'électrode potentiel d'action monophasique contre épicarde ventriculaire. Surveiller le signal pour atteindre appropriées des mesures de potentiel d'action. Artefact de mouvement légère dans le signal est normal.
- Placez une électrode de stimulation bipolaire sur l'oreillette droite à stimuler le cœur. Dans notre protocole, les cœurs ont été stimulés à la durée du cycle entre 300 et 150 ms, ce qui correspond à 200 et 400 bpm, respectivement.
- Mesurez la température de la surface épicardique LV. Si l'étude nécessite que la température soit maintenue à 37 ° C, puis positionner le cœur l'intérieur d'une cavité cardiaque à chemise d'eau ou de plonger au cœur dans un bain chaud superfusat de maintenir une température constante tout au long du coeur.
- Positionner la caméra CCD (Andor ixon DV860, 128x128 pixels) et focaliser la lentille de telle sorte qu'une zone appropriée de vue est observée. L'appareil photo est connecté à un poste de travail et les images sont acquises à 2 ips en utilisant Andor SOLIS lore.
- Allumer la lampe lampe au mercure avant le début de formation d'image. La lumière est dirigée à travers un filtre d'excitation (350 ± 25 nm, de la technologie chrominance) et dans un guide de lumière à fibres optiques (Horiba Jobin Yvon modèle 1950-1M) pour éclairer la surface du coeur. L'atténuation de la lumière UV à travers le guide de lumière est faible. Illumination UV pourrait également être fourni en utilisant un système de LED de haute puissance constitué de projecteurs à LED (Mightex PLS-0365-030-S) et une unité de contrôle (SLC-Mightex SA04-Unis).
- Éteignez la lumière ambiante et minimiser tout l'éclairage ambiant. Visez les embouts du guide de lumière (ou projecteurs à LED) au cœur d'atteindre l'illumination uniforme épicardique. Émise par fluorescence de NADH (fNADH) passe à travers un filtre d'émission (460 ± 20 nm de la technologie chrominance) et est imagée par la caméra CCD.
- Surveiller les changements au fil du temps fNADH en sélectionnant une région d'intérêt en utilisant le logiciel d'imagerie. Sélectionner vis-à jour en mode pour surveiller l'intensité moyenne des pixels dans le o régionf intérêt.
- Le cœur doit fonctionner en mode de fonctionnement biventriculaire pour générer des pressions appropriées. niveaux fNADH devrait être faible et stable sur la surface épicardique suffisante pour confirmer la perfusion coronaire. À ce stade de l'étude d'un protocole expérimental spécifique devrait être mis en œuvre pour tester une hypothèse.
- Lorsque l'étude est terminée, retirez le cœur du système et vider tous les perfusat. Rincer la tubulure du système et des chambres avec de l'eau purifiée. Pour l'entretien de routine, le système doit être périodiquement rincé avec une solution ou une solution Mucasol hydrogène dilué peroxyde, selon les besoins.
5. Off-line de traitement d'images fNADH
- Une façon de comparer des ensembles de données NADH (fNADH (i, j, t)) entre les expériences consiste à normaliser chaque image de fluorescence à l'aide d'une image de référence (fNADH (i, j, t 0)) à partir de l'ensemble de données 9, comme indiqué dans l'équation ci-dessous . Une autre façon de normaliser NADH fluorescence est de plAs un petit morceau de verre d'uranyle dans le champ de vision avant l'expérience 9, 18, 19. Verre d'uranyle va de fluorescence (450 - 550 nm) lorsqu'il est éclairé avec une lumière UV pour fournir un signal qui peut être utilisé comme une référence stable.
6. Les résultats représentatifs
Vues antérieures et de la base d'une préparation biventriculaire lapin de travail cardiaque sont présentés dans la figure 1. La pression ventriculaire gauche a été mesurée par la navigation d'un cathéter transducteur de pression (Millar SPR-407) au-delà de la valvule aortique et dans le ventricule gauche. Pressions ventriculaires aortique, artère pulmonaire, et à gauche (LVP) sont présentés dans la figure 1C. Diastolique LVP est généralement comprise entre 0 et 10 mmHg. La pression aortique diastolique minimale est d'environ 60 mmHg. Pic systolique LVP dépend de la pression de remplissage (la précharge ou de la pression LA) et de la contractilitéet, de façon optimale, doit être comprise entre 80 et 100 mmHg. La pression aortique maximal et LVP doit correspondre étroitement, comme le montre la figure 1C.
Potentiels d'action monophasiques (MAP) avec une phase de dépolarisation rapide et une phase de repolarisation qui sont typiques pour des cœurs de lapins sont présentés dans la figure 1D. Les cartes peuvent être enregistrées relativement facilement à partir d'un coeur traitance mais ont généralement un artefact de mouvement petite pendant la diastole, comme indiqué dans la figure 1D. Cartes sont utiles pour confirmer l'entraînement avec succès du cœur (la capture) au cours de la stimulation et peut également être utilisé pour mesurer les changements électrophysiologiques locales dues à une ischémie ou d'autres perturbations de courte durée. Un ECG peut également être mesurée par une immersion au coeur dans un bain de superfusat chaude et placer une électrode dans le bain sur les côtés gauche et droit du cœur. Un troisième électrode indifférente est soit placé dans le bain, à l'écart du coeur, ou est attaché à l'aorte.Un ECG fournira des informations concernant l'excitation mondiale et le processus de repolarisation, ce qui est utile pour évaluer l'ensemble de fonction électrique et pour révéler la présence d'une ischémie.
fNADH imagerie révèle des changements dans l'état redox mitochondrial du cœur, qui peuvent être utilisés pour mesurer la progression spatio-temporelle des régions ischémiques ou hypoxiques. Pour cette étude, épicardique fNADH a été mesurée pour surveiller les changements dans l'état d'oxydo-réduction au cours des trois fréquences de stimulation à la durée du cycle (CL) de 300, 200 et 150 msec. Les valeurs moyennes fNADH d'une région d'intérêt (encadré rouge, figure 2) montrent que les niveaux de référence fNADH augmenter à mesure que la durée du cycle est raccourci. Lorsque la fréquence de stimulation est proche d'un rythme sinusal (CL = 300 msec) de base fNADH niveau est relativement constant. Comme la durée du cycle est raccourci en dessous de 300 ms, base fNADH l'augmentation des niveaux, avec la plus forte augmentation dans les plus brefs CL (150 msec). Haute résolution fNADH imagerie de la surface totale antérieureà 200 et 400 bpm est illustré à la figure 3. niveaux fNADH à 200 bpm étaient constants et spatialement homogène. A 400 bpm, le niveau a considérablement augmenté tout au long fNADH l'épicarde. Importante hétérogénéité spatiale a été observée avec les plus fortes hausses se trouvant dans les régions septales de la RV et LV.
Le signal fNADH oscille avec la contraction (artefact de mouvement) et la fréquence d'oscillation correspond à la fréquence cardiaque (figure 2). En canulation biventriculaire, la base du cœur est détenu par 4 canules, ce qui contribue à empêcher le cœur de balancer pendant la contraction. Par conséquent, l'amplitude d'oscillation est toujours inférieure à n'importe quelle échelle de temps plus (5-10 sec) les tendances dans fNADH qui sont causées par une ischémie ou l'hypoxie.
Figure 1. Pressions typiques et des potentiels d'action monophasiques à partir d'un travail isolé biventriculaire racoeur bbit. A. Vue basale du cœur montrant les canules de quatre: 1, aortique, 2, artère pulmonaire; 3, de l'oreillette gauche, et 4, de l'oreillette droite B. Vue antérieure du cœur montrant le ventricule gauche (VG) et le ventricule droit. (RV) pressions représentatives. C.. Top: la pression ventriculaire gauche (trait plein) et la pression aortique (ligne pointillée). En bas: la pression artérielle pulmonaire. D. potentiels représentatifs d'action monophasiques. Le signal est aligné avec les pressions indiquées dans le panneau C. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. imagerie fNADH d'un actif isolé biventriculaire coeur de lapin. Haut: Une bande dessinée du champ de vue (à gauche) et trois images fNADH sont présentés. La longueur de stimulation correspondant cycle (CL) est indiqué sur chaque image.La région d'intérêt pour le signal fNADH dans le panneau inférieur est indiquée par la boîte de rouge. La pointe de l'électrode de potentiel d'action monophasique est vu à droite de la région d'intérêt. L'épicarde a été allumé à l'aide de la lampe au mercure et guide de lumière, comme le montre la Figure 5. Seule la surface épicardique entourant la région d'intérêt a été illuminé Bas:. FNADH moyen pour la région d'intérêt indiqué par la boîte rouge dans le panneau supérieur. Moyenne des augmentations fNADH avec une longueur de cycle réduit.
Figure 3. images fNADH de toute la surface antérieure d'un actif isolé biventriculaire coeur de lapin. Le cœur était au rythme de la RA à 200 bpm et 400 bpm. fNADH a été imagé (2 ips, 128x128 pixels à une résolution de 0,4 mm) tout en éclairant l'épicarde toute antérieure au moyen de deux LED de puissance élevée (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).
Discussion
Le cœur isolé perfusé de Langendorff reste un outil privilégié pour l'étude de la physiologie cardiaque 2. Il est particulièrement utile dans les études d'arythmies cardiaques, en particulier ceux qui utilisent l'imagerie de fluorescence de 20 potentiel transmembranaire. Un avantage est que l'épicarde ensemble du cœur isolé peut être observé 21, 22. Un autre avantage est que, contrairement au sang, perfusion avec une solution tampon cristalloïde clair n'interfère pas avec les signaux de fluorescence. Une limitation est que la technique de Langendorff n'est pas bien adapté pour les études de métabolisme cardiaque, qui nécessitent souvent le cœur d'accomplir un travail dans le contexte de la précharge physiologique et les pressions postcharge.
Pour élever la pertinence des préparations cardiaques isolés pour les études métaboliques, Neely a introduit des modifications à la technique de Langendorff pour établir appropriée ventricule gauche (VG) précharge et postcharge 3 pressions.Le modèle est connu sous le nom du modèle isolé LV coeur et de travail a été largement utilisée pour étudier la performance et le métabolisme LV 4-6. Le modèle LV coeur de travail est supérieur au modèle de Langendorff pour les évaluations fonctionnelles, mais il ne fournit pas un ventricule correctement chargé droite (VD). Demmy et al. D'abord rapporté un modèle biventriculaire (LV & RV) comme une modification du modèle LV coeur fonctionnant 7, 8. Ils ont constaté que le développement du volume systolique, le débit cardiaque et la pression améliorée dans les coeurs convertis à partir du mode de travail pour LV mode de fonctionnement biventriculaire 8. Un RV correctement chargé améliore également la fonction du septum en diminuant les gradients de pression anormales à travers le septum. Biventriculaire coeurs de travail ont été montré pour maintenir la production de l'aorte, du débit pulmonaire, la pression aortique moyenne, la pression moyenne pulmonaire, la fréquence cardiaque et l'infarctus du ATP, et les niveaux de phosphate de créatine pour un maximum de 3 heures 8. Biventriculaire études cardiaques de travail utilisent généralement les cœurs franimaux om petits, comme les rats et les lapins, car le débit cardiaque et le volume requis de liquide de perfusion sont beaucoup moins que pour les cœurs des grands animaux. Cependant, les études cardiaques biventriculaire de travail ont été menées en utilisant les cœurs de porcs, chiens, et même les êtres humains 23, 24.
La demande métabolique des cœurs isolés en mode de travail biventriculaire est considérablement plus élevé que celui de la perfusion de Langendorff. Il est important que la solution perfusat fournir assez d'oxygène et de substrat métabolique pour soutenir la fonction cardiaque biventriculaire. Standard solutions tampons cristalloïdes, comme de Krebs-Henseleit 16, 17, 25 ou 26 Tyrodes, 27, ont des solubilités oxygène aussi élevée que 5,6 mg / L. Lorsque ces solutions sont gazés avec du carbogène (un mélange de gaz de 95% d'O 2 et 5% de CO 2) et contiennent de substrat approprié métabolique (glucose, dextrose, et / ou de pyruvate de sodium), elles sont appropriées pour biventriculaire cœur battant de travail à la normeal taux de sinus (environ 180 bpm pour un lapin).
Augmentation de la demande métaboliques pour des rythmes rapides et la quantité d'oxygène dissous dans perfusats standards pourrait ne pas suffire à soutenir pleinement un cœur biventriculaire de travail qui se contracte à des taux élevés. Solutions tampons contenant des érythrocytes cristalloïdes ou mixtes avec du sang total ont été utilisés dans les préparations de coeurs de travail pour assurer la disponibilité adéquate d'oxygène. Des études antérieures ont montré que l'ajout d'érythrocytes à une solution de Krebs-Henseleit amélioration de la fonction cardiaque de travail au cours des protocoles de stimulation rigoureuses et également réduit l'incidence de 16 fibrillation ventriculaire. Une limitation de l'utilisation de globules rouges ou des mélanges de sang total, c'est que l'hémoglobine interfère avec des longueurs d'onde de lumière qui sont utilisés pour l'imagerie de fluorescence 13. D'autres substrats, tels que l'albumine, peuvent également être ajoutés à perfusat des solutions pour prolonger la viabilité du cœur et réduire l'œdème 28.
Lors de l'imagerie de fluorescence de l'intensité de la lumière d'excitation doit être élevée et la distribution de la lumière doit être uniforme. Atteindre un éclairage uniforme n'est pas toujours facile en raison de la courbure de la surface épicardique. Dans nos études, nous avons l'image fNADH en filtrant la lumière (350 ± 25 nm) à partir d'une lampe à mercure. Un guide de fibre optique bifurquée la lumière est utilisée pour diriger la lumière UV sur la surface épicardique. Un éclairage uniforme peut être obtenue par un positionnement approprié des deux viroles de sortie. UV sources lumineuses à LED pourrait également être utilisé, comme nous l'avons démontré dans la figure 3. Sources lumineuses à DEL sont relativement peu coûteux afin de multiples sources pourraient être incorporées dans un système d'imagerie. Les LED peuvent aussi être allumée et éteinte à des taux élevés de synchroniser la lumière d'excitation à l'acquisition de l'image.
Photoblanchiment de NADH doit être minimisée 29 en réduisant le temps d'illumination tissu. Cela peut être fait par l'éclairage du vélo sur et en dehors à l'aide d'un électronobturateur IC et une lampe ou d'un système d'éclairage à LED et un contrôleur. Si l'éclairage est synchronisé avec le cycle cardiaque, puis l'acquisition d'images fNADH pourrait se limiter à la diastole, ce qui réduirait la présence de mouvement dans les signaux de fluorescence. L'éclairage et l'acquisition Trigging image en utilisant un signal de pression, tels que la pression LV, serait une façon de le faire.
Dans nos études, nous avons observé que les changements dans fNADH par unité de temps peut être plus de 5X plus élevé à 400 bpm qu'à 200 bpm. Cela indique que les rythmes rapides d'élever l'état redox du cœur. Que ce soit ou non cela est causé par une hypoxie ou de l'incapacité des myocytes pour oxyder le NADH en NAD + assez rapidement pour éviter l'accumulation de NADH est toujours une question sans réponse.
La performance d'une préparation coeur travaille biventriculaire est subordonnée à plusieurs facteurs. L'un des plus important est de définir à l'pressions de précharge et la postcharge à imiter le physiologiqueconditions qui sont sous enquête. En particulier, la postcharge VG (pression aortique) doit être ajustée pour représenter la pression systémique. Si elle est trop élevée, le LV ne sera pas en mesure de surmonter la pression, ce qui entraîne une régurgitation. Pression qui est trop faible nuira perfusion coronaire. La pression de précharge VG (la pression auriculaire gauche) devrait également être ajusté pour fournir un volume télédiastolique qui est approprié pour le protocole expérimental.
fNADH imagerie des tissus vivants est un mode avéré de l'imagerie de fluorescence 13. Son application sur le tissu cardiaque a été illustré par Barlow et Chance quand ils ont signalé des élévations frappants de fNADH dans le tissu régional ischémique après ligature d'un vaisseau coronaire 14. Leurs images ont été enregistrées fNADH sur le film en utilisant une caméra oscilloscope Fairchild et la photographie au flash UV. Coremans et al. élargi sur ce concept en utilisant le rapport NADH réflectance de fluorescence / UV de mesuree l'état métabolique de l'épicarde des cœurs de rat Langendorff perfusés de sang 30. Un videofluorimeter a été utilisé pour l'imagerie et de données a été enregistré à l'aide d'un enregistreur vidéo. Plus tard, Scholz et al. utilisé un tableau spectrographe et photodiode pour mesurer fNADH moyenne à partir d'une grande partie de la LV. Cette approche réduit les effets de épicardiques hétérogénéités de fluorescence et les variations locales de la circulation tout en révélant macroscopiques liés au travail des variations de fNADH 31. Cette approche est semblable à des niveaux de calcul fNADH moyenne pour une région d'intérêt sur toutes les images d'un ensemble de données d'imagerie fNADH, comme illustré dans la figure 2. Comme nous l'avons présenté dans cet article, la technologie d'aujourd'hui permet à grande vitesse des caméras CCD et projecteurs à commande numérique UV haute puissance. Ces technologies permettent la dynamique spatiotemporelle des fNADH et le métabolisme cardiaque à étudier de nombreuses perspectives nouvelles. Le coût relativement faible de l'optique et la source lumineuse rend fNADH l'image d'un accessoire utile pour les classiques systèmes de cartographie cardiaque optiques. 9, 32
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (R01-HL095828 à MW Kay).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911-500G | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C77-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-7506 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S-233 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | 423-316 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968-500G | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G |
References
- Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart]. Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 Forthcoming.
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).
- Feng, H. Z., Jin, J. P. Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).
- Clemens, M. G., Forrester, T. Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia. J. Physiol. 312, 143-158 (1981).
- Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res. Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).
- Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart. J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).
- Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).
- Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).
- Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations. Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).
- High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. 30th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, , 1-4 (2008).
- Chance, B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).
- Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).
- Barlow, C. H., Chance, B. Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography. Science. 193, 909-910 (1976).
- Mayevsky, A., Chance, B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).
- Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).
- Ôta, K., Peaker, M. Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output. Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).
- Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).
- Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH. Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ. Res. 95, 21-33 (2004).
- Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).
- Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J. Biomed. Opt. 12, 044019 (2007).
- Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. Isolated four-chamber working swine heart model. Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).
- Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. In vitro studies of human hearts. Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).
- Schenkman, K. A. Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).
- Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).
- Khatib, S. Y., Boyett, M. R. Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes. Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).
- Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).
- Combs, C. A., Balaban, R. S. Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP). Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).
- Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. (Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart. Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).
- Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts. Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).
- Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism. Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).
