隔離された両心室ワーキングウサギ心臓のNADH蛍光イメージング

Summary

目的は、生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で孤立した心臓のミトコンドリア酸化還元状態を監視することです。両心室作業ウサギの心臓のモデルが提示されます。 NADHの​​高い時空間分解能蛍光イメージングは​​、心外膜の組織のミトコンドリア酸化還元状態を監視するために使用されます。

Abstract

ランゲンドルフ^を1つの創業以来、単離された灌流心臓は心臓の生理学^2を研究するための著名なツールのままです。しかし、それは心が生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で作業を実行するために必要な心臓の代謝の研究、に適していません。ニーリィ適切な左心室（LV）負荷および後負荷圧力^3を確立するためにランゲンドルフ法への変更を導入しました。モデルは、単離されたLVの作業心臓モデルとして知られており、LVのパフォーマンスと代謝^4-6を研究するために広く使用されています。このモデルは、しかし、適切にロードされた右心室（RV）を提供していません。デミーら 。最初はLVの作業心臓モデル^7、8の変形例として両心室モデルを報告した。彼らは、一回拍出量、心拍出量、圧力の開発が両心室の動作モード⁸に働くLVモードから変換された心の中で改善されました〜8のために大動脈出力、肺血流量、大動脈圧、心拍数を意味し、心筋のATPレベルを維持することが示されている。

このような虚血など心筋傷害の代謝効果を検討の際には、多くの場合、影響を受けた組織の位置を特定する必要があります。これはイメージングによりNADH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型^）9-11の蛍光を行うことができる、補酵素はミトコンドリアで大量に発見した。 NADH蛍光（fNADH）は、ローカルの酸素濃度¹²に近い直線的に逆の関係が表示され、ミトコンドリアの酸化還元状態¹³の尺度を提供しています。低酸素および虚血状態でのfNADHイメージングは低酸素領域^14、15を識別するためとの進行を監視するために色素フリーの方法として使用されている時間は¹⁰以上、低酸素状態。

メソッドの目的は、筋細胞代謝率を変更したり、低酸素症を誘発するか、または両者の組み合わせを作成するプロトコルの中に心室仕事心のミトコンドリア酸化還元状態を監視することです。ニュージーランド白ウサギの心臓は37℃で両心室仕事心臓システム（ヒューゴサックスElektronik社）に接続され、修正クレブス-ヘンゼライト溶液を¹⁶で灌流した大動脈、左心室、肺動脈、左＆右心房圧を記録した。電気的活動は、単相性活動電位電極を用いて測定した。画像fNADHに、水銀ランプからの光は、フィルタ（350±25 nm）と心外膜を照らすために使用されていました。放出される光はフィルタ（460±20 nm）とCCDカメラを用いて画像化した。別のペーシングレートの間に両心室仕事心の心外膜fNADHの​​変化が表示されます。心臓モデルとfNADHイメージングの組み合わせ現実的な生理的条件下の文脈の中で急性心臓の病理学を研究するための新たな価値のある実験的なツールを提供しています。

Protocol

1。研究のための設定

1. 118のNaCl、3.30のKCl、2.00のCaCl _2、1.20 MgSO _4で 、24.0のNaHCO _3、1.20 KH ₂ PO _4、25.4グルコース、2.00 NaPyruvate、アルブミン20.0 mg / Lで：修正クレブス-ヘンゼライト溶液^16（mMでの4リットルを準備します。 。）解決策は、可能な限り実験の開始近くに準備する必要があります。 pHは滅菌フィルター（22ミクロン、コーニングの細孔径）の後に7.4に調整する必要があります。溶液の浸透圧は275および295浸透圧/ kgの間でなければなりません。
2. 精製水での作業心臓システムのすべてのチューブとチャンバーを洗浄します。すべての水がシステムから削除されるまでポンプを実行します。
3. 灌流ポンプ（ランゲンドルフ灌流ポンプ、左心灌流ポンプ、右心灌流ポンプ）の各々の行：セルロースメンブレンフィルター（5μmの、アドバンテックの細孔径）を追加します。
4. 各圧力センサの2点キャリブレーション（0〜60 mmHg）を実行します。
5. 水浴をオンにします。温水循環水浴（コールパーマー）は、水ジャケット管と熱交換器を温めるために使用されます。灌流液は、別の水浴（Oaktonインスツルメンツ）にあらかじめ温めています。両方のお風呂は37℃の液温を維持するために設定されています
6. 閉ループでの灌流を循環させるポンプの電源をオンにします。灌流液は、80 kPaの少なくとも95％O ₂および5％CO ₂でガスのマイクロファイバー人工肺（hemofilters）を通過する。酸素灌流は、心臓のカニューレに入る前に37℃の温度で、それを維持するために熱交換器を通って流れる。

2。心臓の切除

1. 一定の圧力ランゲンドルフモードで動作するように働く心臓システムを設定することによって開始します。 50から60 mmHgの範囲内で大動脈ブロックの圧力を設定します。
2. ケタミン（44 mg / kg）及びキシラジン（10 mg / kg）の筋肉内注射でウサギを麻酔。ウサギ（50ミリグラム/ K、鎮静した後にペントバルビタールg）とヘパリン（2000 U）を静脈内後肢の内側の縁耳静脈または外側伏在静脈を介して注入されています。
3. ウサギが完全に応答しない、痛み反射の欠如によって決定されるように、胸腔が迅速に開かれている場合、心がスライスされ、大動脈をクランプされ、心臓と肺を摘出されています。この時点で肺は肺静脈を隔離を支援するために心臓に接続されたままにしてください。
4. 60mLの灌流液とヘパリンの200ユニットで満たされた注射器に接続されている直径5 mmカニューレと大動脈を分離し、カニューレを挿入。サイズがゼロ絹縫合糸でカニューレを大動脈を確保し、徐々に血の心臓をフラッシュするためのシリンジを押す。

3。両心室カニューレ

1. ワーキングハートシステムの大動脈ブロックに心を接続します。冠動脈塞栓を引き起こす可能性が大動脈を入力してから空気を防ぐことができます。大動脈BLにカニューレを添付することをお勧めです。斜めの角度で大動脈コネクタに近づいており、それが接続されている間灌流液を穏やかにカニューレにコネクターから滴下できるようにすることで、OCK。
2. 心臓が一定の圧力ランゲンドルフモードで灌流されていますが、脂肪と結合組織を除去し、次の船探します。劣ると上大静脈、奇静脈、肺動脈、肺静脈を。
3. 上大静脈を連結。ここで、右と左肺動脈に分岐のすぐ下に肺動脈を切った。
4. グループ心臓と肺と1縫合糸を使用してそれらすべてを連結の間に残りのすべての血管（肺静脈）。肺を削除します。
5. 左心耳の隅にある小さな穴をカットします。 LAは、灌流液で満たされていることを確認してください。それが挿入されながら、カニューレが完全に灌流液で満たされていることを確認しながらLAをカニューレを挿入。 LAの付属物にカニューレを縫合。
6. tにフローを提供するために、左側のポンプ（ポンプ＃2）をオンにする彼はアトリウムを残しました。 6 mmHgと調整±2 mmHgで、よ​​うに心房拡張によって決定される - 2の間に予圧圧力を設定します。
7. ランゲンドルフポンプ（ポンプ＃1）をオフにすることで、仕事中心モードに心を切り替えます。
8. 一時的に10 mmHgに大動脈圧を低下させ、その後徐々に80から100 mmHgの範囲内にそれを増加させます。これは、大動脈弁が開き、それが正常な生理的条件下で同じように機能するようになります。最終的な後負荷圧がLVの収縮に依存します。それはピークLV圧よりも約20 mmHgの小さい値に設定する必要があります。
9. LV心臓の出力は、大動脈ブロック（mL /分）を終了する灌流液の流量を測定することによって決定することができます。正常な心拍出量は、体重¹⁷と平均の100グラム2.2キロのウサギ340 mL /分当たり14.77の間と16.43 mL / minである。大動脈圧は、 図1に示す圧力信号のようになります。
10. 私を介してRAをカニューレを挿入nferior下大静脈。 RAとカニューレの両方が完全に灌流液で満たされていることを確認し、気泡の形成を防止しながら、カニューレを挿入します。静脈にカニューレを縫合。
11. 右心房への流れを提供するために右側のポンプ（ポンプ＃3）をオンにします。約3 mmHgの圧力を設定します。
12. RVは、灌流液で満たされていることを確認し、肺動脈のカニューレを挿入。それは空気の泡を防ぐために挿入されながら、カニューレが完全に灌流液で満たされていることを確認してください。肺動脈にカニューレを縫合。

4。信号集録：プレッシャー、単相性活動電位、およびfNADH

1. 心室カニュレーションが完了したら、慎重に大動脈カニューレを介して大動脈への圧トランスデューサーカテーテル（ミラー）を挿入します。静かに大動脈弁を通過し、LVにそれを移動します。カテーテル先端の適切なポジショニングを確保するため、LV圧力信号を監視します。 LV圧の例が示されている図1に示します。
2. 優しく心室心外膜に対する単相性活動電位電極を押してください。適切な行動の潜在的な測定を実現するための信号を監視します。信号のわずかなモーションアーチファクトは正常です。
3. 心臓のペースに右心房に双極刺激電極を配置します。私たちのプロトコルでは、心はそれぞれ200および400 BPMに対応し、300と150ミリ秒の間にサイクル長でペースだった。
4. LV心外膜表面の温度を測定します。研究では、温度が37℃に維持する必要がある場合°C、次いで水ジャケット心腔または水没の心を通して一定温度を維持するために温めておいたsuperfusate浴で心の中心に配置します。
5. CCDカメラ（アンドールIXON DV860、128x128ピクセル）を配置し、ビューの適切なフィールドが観察されるようにレンズの焦点を合わせる。カメラは、ワークステーションに接続され、画像がアンドールSOLIS softwaを使用して、2 fpsで取得される再。
6. 前の画像の開始に水銀ランプの光をオンにします。光は励起フィルター（350±25 nmであり、クロマテクノロジー）を介して、心臓の表面を照らすために光ファイバライトガイド（堀場ジョバンイボンモデル1950-1M）に指示されています。ライトガイドを介してUV光の減衰は小さい。 UV照明にもLEDスポットライト（MightexのPLS-0365-030-S）と制御ユニット（Mightex SLC-SA04-US）から構成されるハイパワーLEDシステムを使用して提供することができます。
7. 部屋のライトをオフにして、任意の周囲の照明を最小限に抑えることができます。均一な心外膜照明を達成するために、心臓部で光導波路（またはLEDスポットライト）のフェルールを目指しています。放出されるNADH蛍光（fNADH）は、発光フィルター（460±20 nmのクロマテクノロジー）を通過してCCDカメラで撮像される。
8. イメージングソフトウェアを使用して、関心領域を選択することにより、時間の経過とともにfNADHの​​変更を監視します。地域O内の平均ピクセル強度を監視するために生きる - 更新モードを選択します。F関心。
9. 心臓は、適切な圧力を生成するために心室の動作モードで機能する必要があります。 fNADHレベルが十分な冠灌流を確認するために、心外膜面上の低く安定しなければなりません。研究ではこの時点で、特定の実験プロトコルは、仮説をテストするために実装する必要があります。
10. 調査が完了すると、システムから心臓を削除し、すべての灌流液を排出する。精製水を使用してシステムのチューブとチャンバーを洗浄します。日常のメンテナンスは、システムは定期的にMucasol溶液または必要に応じて希釈した過酸化水素溶液でリンスする必要があります。

5。 fNADH画像のオフライン処理

1. NADHのデータセットを比較する一つの方法（fNADHの（i、j、t））は実験の間には、参照画像を使用して、それぞれの蛍光画像を正規化することであるとして、以下の式に示すように、データセットの^9時から（fNADH（I、J、T _0））、 。 NADH蛍光を正規化する別の方法では、PLすることですエース実験^9、18、19前に視野内のウラニルガラスの小片。安定した基準として使用することができます信号を提供するために、UV光を照射 - ウラニルガラスは蛍光（550 nmの450）でしょう。

6。代表的な結果

両心室作業ウサギの心臓の準備の前方および基底ビューは図1に示されています。左心室圧が大動脈弁を通過し、左心室に圧力トランスデューサーカテーテル（ミラーSPR-407）をナビゲートして測定した。大動脈、肺動脈、左心室圧（LVP）は、 図1Cに示されています。拡張LVPは通常0〜10 mmHgである。最小拡張期大動脈圧は約60 mmHgである。ピーク収縮LVPは、充填圧力（予圧またはLA圧）と収縮性に依存していますと、最適に、80〜100 mmHgのでなければなりません。 図1Cに示すように最大の大動脈圧と最大LVPは密接に一致させる必要があります。

ウサギの心臓のための典型的な高速の脱分極相および再分極相と単相性活動電位（MAP）を図1Dに示されています。 図1Dに示すように、MAPは、請負中心部から比較的容易に記録することができますが、通常は拡張期の間に小さなモーションアーチファクトがあります。 MAPはペーシング中の心臓（キャプチャ）が正常に同調を確認するために有用であり、また、虚血または他の急性摂動のために地元の電気生理学的変化を測定するために使用することができます。 ECGは、暖かいsuperfusateのお風呂で心を沈めると、心臓の左と右の両側にお風呂に電極を配置して測定することができます。第三不関電極のいずれか心臓から、浴中に置かれているか、または大動脈に取り付けられています。ECGは、全体の電気的機能を評価するため、虚血の存在を明らかにするために有用であるグローバルな励起及び再分極過程に関する情報を提供していきます。

fNADHイメージングは​​、虚血や低酸素領域の時空間的進行を測定するために使用することができる心臓のミトコンドリア酸化還元状態の変化を明らかにする。この研究では、心外膜fNADHはサイクル300の長さ（CLS）、200、150ミリ秒の3つのペーシングレートの間に酸化還元状態の変化を監視するために測定した。関心領域（赤いボックスは、 図2）から平均fNADH値は、サイクルの長さが短くされているベースラインfNADHレベルが増加することを示している。速度をペーシングするときはベースラインfNADHレベルが比較的一定である洞調律（CL = 300ミリ秒）に近いです。サイクルの長さとして最短CL（150ミリ秒）で最大の増加に伴って300ミリ秒、ベースラインfNADHレベルが増加し、下に短縮されます。完全な前面の高分解能イメージングfNADH200と400でBPMを図3に示します。 200 BPMでfNADHレベルは一定で、空間的に均質であった。 400 BPM、fNADHレベルは心外膜を通じて大幅に増加した。重要な空間的な異質性がRVとLVの中隔の領域内で発生する最大の増加が観察された。

fNADH信号が収縮（モーションアーチファクト）で発振し、発振の周波数は、心拍数（ 図2）に対応しています。心室カニュレーションでは、心臓のベースは、収縮時の揺れから心臓を防ぐことができます4カニューレにより保持されます。したがって、発振振幅は任意の長い時間スケール（5-10秒）虚血あるいは低酸素状態によって引き起こされるfNADHの​​動向よりも常に少なくなります。

図1。孤立した両心室からの典型的な圧力と単相性活動電位は、RAの作業心をBBIT。左心房3; 1、大動脈、2、肺動脈、4、右心房、左心室（LV）と右心室を示し、心臓のB.前方ビュー：A.基礎4カニューレを示す心のビュー。 （RV）。C.代表圧力。上：左心室圧（実線）と大動脈圧（点線）。底部：肺動脈圧D.描写単相性活動電位。信号は、パネルCに示される圧力に揃えて配置され拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。ウサギの心臓の作業分離された両心室のfNADHイメージング。トップ：視野の漫画（左）と3つのfNADH画像が表示されます。対応するペーシング周期長（CL）は、各画像に表示されています。下部のパネルにfNADH信号の関心領域は、赤いボックスで示されます。単相性活動電位電極の先端は、関心領域の右側に見られている。心外膜は、 図5に示すように、水銀ランプとライトガイドを使用して点灯されました。唯一の関心領域を取り巻く心外膜面が点灯されたボトム：関心領域の平均fNADHトップパネルの赤いボックスで示されます。縮小周期の長さの平均fNADH増加します。

図3。ウサギの心臓の作業分離された心室の完全な前面のfNADH画像。心臓は200拍、400拍で、RAからのペースだった。 2つの高電力のLED（Mightex PLS-0365-030-S、365nmの4％を使用して、全体の前心外膜を照らしながらfNADH（2コマ、0.4ミリメートルの解像度で128×128ピクセル）画像化したIntensity、50 mW（最大））。

Discussion

孤立したランゲンドルフ灌流心臓は心臓の生理学^2を研究するための著名なツールのままです。それは、特に不整脈、膜電位²⁰の蛍光イメージングを使用するものの研究に特に有用である。利点は、単離された心臓の心外膜全体が^{21日、22日を}観察することができることである。もう一つの利点は、血液とは対照的に、明確な晶質緩衝液による灌流が蛍光信号と干渉しないということです。制限は、ランゲンドルフ技術が頻繁に心臓が生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で作業を実行するために必要な心臓の代謝の研究、に適していないということです。

代謝研究のために孤立した心の準備、適切な左心室（LV）負荷および後負荷圧力^3を確立するために、ランゲンドルフ技術にニーリィ導入された変更の妥当性を高めるために。モデルは、単離されたLVの作業心臓モデルとして知られており、LVのパフォーマンスと代謝^4-6を研究するために広く使用されています。 LVの作業心臓モデルは、機能評価のためのランゲンドルフモデル​​よりも優れている、まだそれは正しくロー​​ドされ、右心室（RV）を提供していません。デミーら 。最初はLVの作業心臓モデル^7、8の変形例として心室モデル（LV＆RV）を報告しました。彼らは、一回拍出量、心拍出量、圧力の開発が両心室の動作モード⁸にLVモードでの作業から変換された心の中で改善されました。正しくロー​​ドRVはまた、隔壁全体に異常な圧力勾配を減少させることにより中隔機能を向上させます。両心室の心の作 ​​業は、最大3時間^〜8のために大動脈出力、肺血流量、平均大動脈圧、肺動脈圧、心拍数や心筋ATPを意味し、クレアチンリン酸レベルを維持することが示されている。両心室仕事心臓の研究は、一般的に心のFRを使用しこのようなラットやウサギなどの小動物OM、心拍出量と灌流液の必要量は大型動物の心のそれよりもはるかに少ないためです。しかし、両心室仕事心臓の研究は、ブタ、イヌ、さらには人間の^{23日、24日}から心を用いて実施されています。

両心室の動作モードで分離された心臓の代謝需要がランゲンドルフ灌流のそれよりかなり高くなっています。それは灌流溶液は両心室の心機能をサポートするのに十分な酸素や代謝基質を提供することが重要です。このようなクレブス-ヘンゼライト^16、17、25またはタイロード^26、27などの標準的な晶質緩衝液は、5.6 mg / Lで同じ高さの酸素溶解性を有するこれらのソリューションはcarbogen（95％O ₂および5％CO ₂ガスのブレンド）をガス処刑し、適切な代謝基質（グルコース、デキストロース、および/ ​​またはピルビン酸ナトリウム）が含まれている場合、それらは標準で打つ心室仕事の心に適していますら洞レート（ウサギのために約180 BPM）。

速いリズムの代謝需要が増加し、標準灌流液中の溶存酸素量が十分に高い率で縮小している両心室仕事心臓をサポートするのに十分ではないかもしれません。赤血球または全血との混合を含む晶質緩衝液は、十分な酸素の可用性を確保するために働く心の準備に使用されている。これまでの研究では、クレブス-ヘンゼライト溶液に赤血球を追加すると厳格なペーシング·プロトコルの間に働く心機能を改善し、また心室細動¹⁶の発生率を減少させることが示されている。全血の赤血球またはその混合物を使用することの制限は、ヘモグロビンが蛍光イメージング¹³に使用されている光の波長と干渉です。アルブミンのような他の基質は、また、心臓の生存を延長し、浮腫^28を削減するソリューションを潅流液に添加することができる。

蛍光イメージングの間に励起光の強度が高くなければならず、光の分布は均一でなければなりません。均一な照明を実現するには、常に心外膜面の曲率に起因する簡単ではありません。水銀ランプからの光（350±25 nm）をフィルタリングすることにより、我々の研究で、我々のイメージfNADH。分岐光ファイバライトガイドは、心外膜の表面にUV光を導くために使用されます。均一な照明は、適切なポジショニングつの出力のフェルールによって達成することができる。 UVは、我々は、 図3に示されているように光源も、使用することができるLEDが点灯します。 LEDの源は、比較的安価であるため、複数の情報源は、イメージングシステムに組み込まれる可能性があります。 LEDは、画像取得と励起光を同期させるために高いレートでオンとオフを循環することができます。

NADHの光退色は組織照明の時間を短縮することで²⁹最小限に抑える必要があります。これは上の照明を入れ直すことによって、電子を使用してオフに行うことができますICシャッターとランプやLED照明システムとコントローラである。照明が心周期と同期されている場合は、fNADH画像取得は、蛍光シグナルにおけるモーションアーチファクトを減らすことがその、拡張期に限定することができます。そのようなLV圧として圧力信号を使用してTrigging照明及び画像取得は、これを行うための一つの方法だろう。

我々の研究では、単位時間当たりfNADHの​​変化が200 BPMで400以上のBPMの5倍以上高くなることがありますことを観察した。これは、高速リズムは心臓のレドックス状態を高めることを示しています。これは、低酸素またはNADにNADHを酸化する筋の無力によって引き起こされているかどうか+ NADHの​​蓄積を避けるために十分な速さは、まだ未解決の問題です。

両心室仕事心の準備のパフォーマンスは、複数の要因によって決まります。最も重要なものの1つは生理を模倣するために適切な負荷および後負荷圧力を設定することです。調査中である条件。特に、左室後負荷（大動脈圧）は、全身の圧力を表すように調整する必要があります。それが高すぎる場合、LVは、逆流、その結果、圧力を克服することはできません。低すぎると圧力が悪影響を冠灌流に影響を与えます。 LVプリロード圧（左心房圧）も、実験プロトコルに適した拡張末期容積を提供するように調整する必要があります。

生体組織のfNADHイメージングは、蛍光イメージング¹³の確立されたモードです。彼らは冠血管¹⁴のライゲーション後、地域的に虚血組織内fNADHの顕著な上昇を報告した心臓組織への応用は、バーロウとチャンスによって示されました。そのfNADH画像はフェアチャイルド·オシロスコープのカメラとUVフラッシュ撮影を使用してフィルムに記録された。 Coremans ら 。 measurにNADH UV /蛍光反射率を使用して、この概念に基づいて拡大電子ランゲンドルフ血液灌流ラット心臓³⁰の心外膜の代謝状態。 videofluorimeterは、イメージングに使用され、データはビデオレコーダーを用いて記録した。その後、ショルツら 。 LVの大面積からの平均fNADHを測定する分光器とフォトダイオードアレイを使用していました。 fNADH ³¹巨視的な仕事に関連する変動を明らかにしながら、このアプローチは、心外膜の蛍光不均一性と循環の局所変動の影響を減少させた。 図2に示すように、このアプローチは、fNADH画像データセットのすべてのフレームにわたって関心領域のためのコンピューティングの平均fNADHレベルに似ています。我々はこの記事で紹介してきたように、今日の技術は、高速CCDカメラとデジタル制御ハイパワーUVスポットライトを提供します。これらの技術は、fNADHと心臓代謝の時空間ダイナミクスは多くの新たな視点から検討することができます。光学系と光源の比較的低コストはfになりますNADHイメージング、従来の心臓の光マッピングシステムのための有用な付属品^9、32

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S-3014
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-500G
CaCl2	Fisher Scientific	C77-500
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-7506
NaHCO3	Fisher Scientific	S-233
KH2PO4	Fisher Scientific	423-316
Glucose	Sigma-Aldrich	158968-500G
NaPyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25G
Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G