Summary
この資料では、無傷の単離および精製する方法を説明します
Abstract
日和見病原体レジオネラはまた、このように重症肺炎"レジオネラ症" 1の原因となる肺胞マクロファージで複製アメーバ耐性菌です。原生動物や哺乳類の食細胞で、L.レジオネラは 、特定の複製許容コンパートメント、 " レジオネラ菌を含む液胞"（LCV）を形成するために保存されたメカニズムを採用しています。 LCVの形成は、宿主細胞に、多くの275 "エフェクター"のタンパク質を移行し、細菌ICM /ドットIV型分泌系（T4SS）が必要です。エフェクターは宿主タンパク質と同様に脂質を操作し、分泌、エンドソームやミトコンドリアの細胞内小器官2から4と 通信します。
小型商用車の形成は、還元の方法で把握することが困難であり、複雑な堅牢かつ冗長なプロセスを表します。統合的なアプローチは、パスのグローバルな分析を含む、包括的にLCVの形成を理解する必要がありますogen - 宿主因子の相互作用とそれらの時間的および空間的ダイナミクス。この目標に向けた第一歩として、無傷の商用車は、プロテオミクスとリピドミクスで精製し、分析されます。
組成や病原体を含有する液胞の形成は、液体クロマトグラフィーや質量分析に結合された2-Dゲル電気泳動を用いたプロテオーム解析により検討されています。社会的な土壌アメーバキイロタマホコリカビや哺乳類の食細胞のいずれかから単離された小胞は、 リーシュマニア 5、 リステリア菌 6 菌 7、 ロドコッカス 8、 サルモネラ 9またはレジオネラ属菌をかくまった10。彼らは、例えば電子顕微鏡は、LCVの形態、整合性と純度を分析する必要がしかし、これらの研究で用い精製プロトコルは、時間のかかる退屈な作業です。さらに、これらのプロトコルは、専用のために病原体胞の特定の機能を利用しないrichment。
ここで紹介する方法は、Dを用いることにより、これらの制限を克服ホスファチジルイノシトール4 -リン酸（PtdIns（4）P）3,11に結合することにより、蛍光LCVマーカーを生産し、細菌のエフェクタータンパク質SIDCを対象に、どのLCV膜に選択的にアンカーでdiscoideumの 。小型商用車は、古典的Histodenz密度勾配遠心分離12,13（ 図1）第二段階に続いて磁気ビーズに結合されたSIDCと二次抗体に対するアフィニティー精製一次抗体を使用して、免疫磁気分離による最初のステップで濃縮され。
D.から単離された小型商用車のプロテオーム研究discoideumのは 13前にLCVの形成に関与していない食胞、ミトコンドリア、小胞体とゴルジ体と同様に、いくつかの低分子量GTPase、関連付けられたタンパク質を含む560以上の宿主細胞タンパク質を、明らかにした。小型商用車はで濃縮および精製プロトコルは、さらに顕微鏡（免疫蛍光法、電子顕微鏡）、生化学的方法（ウエスタンブロット）およびプロテオミクスまたはlipidomicアプローチによって分析することができますここで概説した。
Protocol
1。 LCVアイソレーションの準備
- レジオネラ出ストリークは、4日間の小型商用車の分離前に5μg/ mLのクロラムフェニコール（CAM）を使用したCYE寒天プレートにグリセロールストックからDsRedタンパク質-Expressの13,14を生成します 。 37細菌をインキュベート℃に
- 1×10 のうち7種D. GFP-カルネキシンまたは75 cm 2の組織培養におけるRAW264.7マウスマクロファージを生産discoideumのは 1日前の感染をフラスコ。 D. 20μg/ mLのG418で10ミリリットルHL5培地を使用します。 23℃discoideumのとアメーバをインキュベートC、5％CO 2を RAW264.7マクロファージに対しては、10％FCS（熱不活性化）と1％グルタミンを添加した10ミリリットルRPMI 1640培地を使用して、37℃で細胞を成長させる°。感染症やサンプルごとに少なくとも3 75センチメートル2フラスコ（最小6×10 7細胞）を使用します。
- L.で一晩培養物を接種CYEプレートからレジオネラ 。 AYE培地3 mLで15 mLの試験管を取るおよび5μg/ mLのカム。 0.1のOD 600nmのを生成するために、細菌懸濁液の100μlで接種する。 21から22時間37℃でオーバーヘッド回転ホイールの一晩培養をインキュベートします。
2。 LCVの分離
- D.の媒体を変更するdiscoideumの細胞には、次の感染を妨げる抗生物質を、削除します。
- 一晩培養物のODを測定します。細菌は、2×10 9細菌/ mlに相当する≥3のOD 600nmで 、で、そのピークの感染に達している必要があります。
- L.の約500μlを添加して細胞を感染させる10ミリリットルHL5培地（D. discoideumの場合）または10ミリリットルRPMI 1640（マクロファージ）に増殖する細胞にpneumophilaの一晩培養。これは50の感染多重度（MOI）に対応しています。その後、感染は10分間500×gで細胞に細菌の遠心分離によって同期されます。遠心分離は続いているD.のインキュベーションにより、 25°Cと°C、5％CO 2、それぞれ37 RAW264.7マクロファージにおけるdiscoideumの細胞 。 1時間の感染時には、遠心分離工程が含まれています。
- 感染後、培地を除去し、細胞外細菌を除去するために一回細胞を洗浄する。 D.、氷冷SorCバッファを使用タマホコリカビとRAW264.7マクロファージ、氷冷PBS。各フラスコにプロテアーゼ阻害剤（Roche社）を添加した3 mLのHSバッファを追加し、セルスクレイパーを用いて細胞を収集します。 15 mLの試験管内のプールに対応するサンプルを。
- サンプルの均質化のために3 mLのプラスチック製のルアーロックシリンジとステンレス鋼ボールホモジナイザーを使用しています。あなたは氷の上で動作することを確認してください。開始する前に、任意の洗剤汚染を避けるために、気泡を取り除くために、氷冷HSバッファを使用して、それをフラッシュするために、蒸留水でボールホモジナイザーを洗浄する。 8μmのクリアランスのボールを使用しています。
- シリンジUNDに最初の3 mLを埋める日にそれをマウント電子ホモジナイザー。ホモジナイザーを前後に9回のサンプルを押してください。均質化しない物質による汚染を避けるために、その後シリンジを交換します。収集し、プール均質化したサンプルを15 mLの試験管内および顕微鏡分析のために150μlのサンプルを取る。異なるサンプルを続行する前に、ボールホモジナイザーを解体し、洗浄してください。
- 4℃で氷の上でシェーカー上で30分間またはオーバーヘッドスピニングホイール（10〜20 rpm）で2％CSやFCSでホモジネートをブロック℃、
- アフィニティー精製SIDCに対する一次抗体（希釈1:3000）またはLCV膜への排他的に結合する他の細菌のマーカーに対してを使用してブロッキングした後。ホモジネートに追加する前に、渦抗体溶液。 4℃で氷の上でシェーカー上で1時間またはオーバーヘッドスピニングホイール（10〜20回転）でサンプルをインキュベート
- その間に、Histodenz勾配を準備します。勾配あたり15 mLの試験管を使用して、一つのサンプルの3 75センチメートル2フラスコ。モミ聖、チューブに35％Histodenzの5.75 mLを加え、そして第二に、慎重の上に10パーセントHistodenz液5.75 mLを加える。その後、慎重に1時間水平にチューブを捨てる。
- ブロッキング試薬、一次抗体、4ペレット°Cの試料で15分間600×gで遠心したホモジネートのインキュベーション後に。上清を捨て、1.5 mLのHSバッファーでペレットを再懸濁します。新鮮な15 mLの試験管にサンプルを転送し、後に顕微鏡分析のために40μlのサンプルを取る。
- 二次抗体を用いてペレットをインキュベートします - MACSヤギ抗ウサギIgGマイクロビーズ（希釈1:25） - シェーカー上で30分間に4℃でその間に、MACS磁気ホルダーに列を入れて、0.5 mLのHSバッファでそれらを平衡化します。
- その後、カラムにサンプルを適用します。フロースルー、その後の顕微鏡分析のための150μlを収集します。 0.5 mLのHSバッファーでカラムを3回洗浄します。
- tから列を削除潮吹き即座0.5 mLのHSバッファを持つ彼は、磁石と溶出液商用車。顕微鏡分析のために20μlのサンプルを取る。免疫磁気分離による精製工程は、1当たりの収量が期待される×10 7感染D. discoideumの細胞約1×10 6をそのまま小型商用車、約七倍のフロースルー13と比較して溶出液中に濃縮されています。
- 垂直の位置に戻しHistodenz勾配管を入れて、慎重に上に溶出液をロードします。 4℃で1時間3350×gでチューブを遠心℃、
- 遠心分離後の長いガラスパスツールピペットを用いて試験管の底から始めて1.5 mLの画分を取る。完全に8分画、チューブの底からそれぞれを収集します。目に見える層が連続Histodenz勾配で観察されていません。小型商用車の最高収率は通常、〜2の割合で分4で期待されているあたり1×10 5をそのまま小型商用車×10 7でアメーバ13ロード·レギュレーション小型商用車のマイナー量は、それぞれの画分3と5にも存在しています。したがって、精製された小型商用車の全体的な収率は〜1×10 6×10 7あたり6無傷の小型商用車が感染しているD. discoideumの細胞 13。小型商用車の回収は、室温（RT）で行い、小型商用車は数時間安定して見えることができます。
3。収集されたサンプルの顕微鏡分析
- ポリ-L-リジンコートしたカバースリップを24ウェル平底組織培養プレートを準備します。
- 24ウェルプレートにすべてのLCVの精製時に採取したサンプルに加え、それぞれの密度勾配分画の150μlをピペット。高Histodenz濃度を希釈するために各ウェルに0.5mLのHSバッファを追加します。その後、4℃で10分間600×gでプレートを遠心分離℃に慎重に上清を除去し、室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）でサンプルを修正します。固定後のサンプルを2回洗浄する。私達D.の電子SorC RAW264.7マクロファージdiscoideumのとPBS。
- D.を発現している GFP-カルネキシンからのサンプルをマウントします。直接、例えばVectashieldを用いたガラススライド上にLCVの分離、中に別の手順で撮影discoideumの 、。
- RTで10分間ブロッキング溶液（1％PBSにBSA）で、LCVの分離中に別の手順で撮影したRAW264.7マクロファージから、サンプルをインキュベートします。 （;をブロッキングバッファーで1:1000アフィニティー精製ウサギ抗SIDC）商用車を染色し、室温で湿潤チャンバー内で1時間インキュベートし、抗SIDC一次抗体を使用しています。その後、PBSでサンプルを3回洗浄。室温でウェットと暗室で30分間、二次抗体（ブロッキング溶液で1:200例えば抗ウサギCy5）ででインキュベートします。最後に、PBSでサンプルを3回洗浄し、例えばVectashieldを用いたガラススライド上にマウントします。
- GFP-カルネキシンから分離された小型商用車の形態、整合性と量が発現しているD. DIScoideumまたはRAW264.7マクロファージからは、適切なフィルタを搭載した蛍光顕微鏡で分析されています。
4。代表的な結果
免疫親和性分離と密度勾配遠心分離によりLCV浄化の品質と収率は、蛍光顕微鏡（ 図1）を続けることができます。サンプルの概要は、DからLCVの分離中に収集さdiscoideu mまたはマクロファージ（ 図2）が表示されます。 L.のホモジネートレジオネラ感染貪食細胞の破片や細胞外細菌の多くもそのまま小型商用車を示していますが、。サンプルをペレット化した後、画像は時々、ビット密度の高いホモジネートに似ています。無傷の小型商用車が列に固執する必要があるため、フロースルーは、主に細胞外細菌や細胞の破片を含んでいます。カラムからサンプルを溶出後、溶出液が大量にそのまま商用車が含まれています。私たちの手の中に、LCV purificatiには 、Dのためのより効果的であると思われるマクロファージよりdiscoideumの 。 D.でdiscoideumの病原体胞が丸く表示され、孤立した小型商用車の収率はマクロファージ（ 図3）と比べて10倍以上高くなっています。無傷のマクロファージでは、異なる抗体で染色されるLVCは、より不規則な形が表示されます。
LCVの分離図1回路図の概要。 LCV膜に排他的にローカライズし、細菌のエフェクタータンパク質SIDCに対するアフィニティー精製抗体を用いた免疫磁気分離により、小型商用車のA）の単離。二次MACSマイクロビーズ結合抗体と磁石は、細胞破片から小型商用車を分離するために使用されています。 B）免疫磁気分離LCVをした後、さらにHistodenz密度勾配遠心により精製される。小型商用車は、画分4に濃縮されています。
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図2。LCVの精製中に収集したサンプル。ホモジネート、ペレット、D.からのフロースルーと溶出液からの画像タマホコリカビやマクロファージが描かれている。サンプルはLを示すD.でDsRedを·エクスプレス（赤）を製造するレジオネラ GFP-カルネキシン信号を生成するdiscoideumの （緑、上部のパネル）又は抗SIDC抗体（シアン、下部パネル）で染色したマクロファージインチバー、10μmである。
図3 DからLCVを精製したタマホコリカビやマクロファージ。サンプルは、LのHistodenz密度勾配遠心分離後、画分4を表示（A）D.でDsRedを·エクスプレス（赤）を製造するレジオネラdiscoideumのは抗SIDC抗体（シアン）で染色したマクロファージではGFP-カルネキシン信号（緑）または（B）を生成します。バー、10μmである。
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Discussion
以前に公開された方法とは対照的に、このプロトコルは、2つのステップは、最初の免疫磁気アプローチによる小型商用車の分離、そして第二に、密度勾配遠心分離により小型商用車の精製に基づいています。 LCVの分離が容易に蛍光標識した細菌やGFP産生細胞または抗体染色のいずれかが使用されている蛍光顕微鏡、続くことができます。ここで説明するプロトコルは、高純度の小型商用車の濃縮、その結果、単純なストレートフォワード方式です。重要なのは、均質化緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤は、RAW264.7マクロファージために必要ですが、D. discoideumのは 13のオプションです。
原理的には、プロトコルが分離工程のために必要とされる、特定の、選択的にローカライズするマーカーが存在する限り、他の病原体または宿主細胞のために採用することができます。理想的には、異なるマーカーは、細菌由来の液胞の膜に輸送されるndは選択的にそこにローカライズ。他の宿主細胞の区画を持つ病原体胞の共精製不要で、宿主細胞のマーカー可能性が高い結果をターゲットに。
病原体胞の特徴的なマーカーが同定されれば、適切なポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、発生する必要があります。すべての一次抗体のための濃度とブロッキング試薬は、FCS以外の試薬（例えばBSA、脱脂質化ミルク、他の市販のブロッキング試薬）がより適切かもしれないブロッキングとして、最適化する必要があります。
もう一つの重要なポイントは、病原体の感染である。感染症に使用される細菌は、最も感染の段階でなければなりません。L.レジオネラ 、例えば、液体培養でpost-exponential/early定常増殖期に成長する必要があります。これらの条件下で、細菌はまたCYE寒天プレート上に成長させた細菌とは対照的に、（〜2×0.5μm）の形態学的に均一である。さらに、antibiotiおそらく細胞培養培地で使用されているCSは細菌に低い感染性と害を避けるために、感染前に削除する必要があります。取り込み効率にマイナスの影響を避けるために、食細胞は、感染時の約80％（超えない）のコンフルエントに達している必要があります。最後に、1時間の潜伏期間はL.ための標準的な感染の時間ですが、 レジオネラは 、小型商用車のむしろ均質かつ堅牢な人口をもたらし、他の時間ポイントはLCVの形成13プロテオミクス的または生化学的研究のために選択することができます。
上記の方法が与えられた病原体の宿主細胞のペアのために確立されると、それが細菌の変異株および/ または Dを含む様々な宿主細胞を、テストすることも可能です。 discoideumのは、欠失変異体を定義しました。一般に、このプロトコルを使用して精製された病原体の液胞は、我々のように、顕微鏡（蛍光および電子顕微鏡）、生化学的アッセイ（ウエスタンブロット）を含むさまざまな方法によって分析することができますプロテオミクスとリピドミクスとしてLL。後者の方法の場合は、プロテオミクス/リピドミクス解析バッファー条件、サンプル量と病原体胞の精製下流の処理の担当者と調整することをお勧めします。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
私たちのラボでの研究は、マックス·フォン·ペッテンコーファー研究所、ルートヴィヒ·マクシミリアン大学、ミュンヘン、ドイツ研究協会（DFG、HI 1511/3-1）とBundesministeriumエリーゼBildungウントForschung（BMBF） "医療感染ゲノム"イニシアティブによってサポートされていました（ 0315834C）。
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
