Summary
Bu makale, bozulmamış izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır
Abstract
Fırsatçı patojen Legionella pneumophila ayrıca, böylece ciddi pnömoni "Lejyoner hastalığı" 1 neden alveoler makrofajlarda çoğaltır bir amip dirençli bakteri vardır. Protozoon ve memeli fagositler, L. pneumophila belirli bir, çoğaltma-müsamahakar bölmesi, "Legionella içeren vakuol" (LCV) oluşturmak için korunmuş bir mekanizma kullanır. LCV oluşumu ev sahibi hücrelerin içine kadar 275 gibi "efektör" protein translocates bakteriyel ICM / tip IV Nokta salgılama sistemi (T4SS), gerektirir. Effektörler ana proteinler gibi yağlar işlemek ve salgı, endosome ve mitokondriyal organeller 2-4 ile iletişim kurarlar.
LCVs oluşumu indirgemeci şekilde kavramak zor olan bir kompleks sağlam ve atıl işlemi temsil eder. Bütünleştirici bir yaklaşım kapsamlı yolu küresel bir analizini içeren LCV oluşumu, anlamak için gereklidirogen-konak faktörü etkileşimleri ve bunların zamansal ve mekansal dinamikleri. Bu amaca yönelik ilk adım olarak, bozulmadan LCVs saflaştırılmış ve proteomik ve lipidomics tarafından analiz edilmiştir.
Bileşimi ve patojen-içeren vakuollerin oluşumu sıvı kromatografi-kitle spektrometresi ya akuple 2-D jel elektroforezi ile analiz proteomik tarafından araştırılmıştır. Sosyal toprak amip Diktiyostelyum diskodeyum ya da memeli fagositler ya izole Vakuoller Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, Salmonella 9 veya Legionella barındırmaktaydı. 10. Onlar örneğin elektron mikroskobu LCV morfolojisi, bütünlük ve saflık analiz gerektirir Ancak, bu çalışmalarda arıtma protokolü, zaman alıcı ve sıkıcı vardır. Ayrıca, bu protokoller için en patojen vakuol belirli özellikleri istismar yokrichment.
Burada sunulan yöntemi D. istihdam ederek bu kısıtlamaların üstesinden Bir floresan LCV işaretleyici üreten discoideum ve bakteriyel efektör protein SidC, belirleyerek hangi seçici (PtdIns (4) P) 4-fosfat fosfatidilinositol için 3,11 bağlanarak LCV zarına çapalar. LCVs klasik bir Histodenz yoğunluk gradyanı santrifüjleme 12,13 (Şekil 1) tarafından, bir ikinci adımı takip SidC ve manyetik boncuklara bağlanan bir sekonder antikor, karşı afinitesi-saflaştırılmış primer antikor kullanılarak immüno-manyetik ayırma ile bir birinci adım zenginleştirilmiş .
D. izole edilen hafif ticari araç bir proteom çalışma discoideum 13 öncesi LCV oluşumu karışmış edilmemiştir fagositik kesecikler, mitokondri, ER ve Golgi, yanı sıra çok sayıda GTPases ile ilişkili proteinler de dahil olmak üzere birden fazla 560 konak hücrenin protein, ortaya çıkardı. LCVs zenginleştirilmiş ve ile saflaştırılmışprotokolü daha mikroskobu (immunfloresan, elektron mikroskobu), biyokimyasal yöntemler (Western Blot) ve proteomik veya lipidomic yaklaşımlarla analiz edilebilir burada özetlenen.
Protocol
1. LCV İzolasyon hazırlıkları
- Legionella pneumophila LCV izolasyon önce 5 mg / ml kloramfenikol (Cam) dört gün CYE Agar plaklarda gliserol stoklarından DsRed-Express 13,14 üreten dışarı Streak. 37 az bakteri inkübe ° C.
- 1 x 10 üzerinden 7 Tohum D. GFP-calnexin veya 75 cm 2 doku kültürü RAW264.7 fare makrofajları üreten discoideum bir gün önce enfeksiyon matara. 20 ug / ml G418 D. için ile 10 ml HL5 orta kullanmak 23 ° C'de discoideum ve amipler inkübe RAW264.7 makrofajlar% 10 FCS (ısıyla inaktive) ve% 1 glutamin ile desteklenmiş 10 ml RPMI 1640 ortamı, kullanımı ve 37 de hücrelerin büyümesi için ° C'de ve% 5 CO2. Enfeksiyon ve örnek başına en az üç 75 cm 2 şişe (en az 6 x 10 7 hücre) kullanın.
- L. ile bir gecede kültürü inoküle CYE plakadan pneumophila. AYE orta 3 ml ile 15 ml test tüpü alınve 5 ug / mL Cam. 0,1 bir OD 600 Nm vermek üzere, bir bakteri süspansiyonu 100 ul ile inoküle. 21-22 saat boyunca 37 ° C'de bir havai rotasyon tekerlek üzerinde gecede kültür inkübe edin.
2. LCV İzolasyon
- D. orta değiştirin discoideum hücreleri aşağıdaki enfeksiyonu müdahale ederek antibiyotik, kaldırmak için.
- Gecede kültür OD ölçün. Bakteriler 2 x 10 9 bakteri / ml karşılık ≥ 3 bir OD 600Nm, onların zirveye enfektivite ulaşmış olmalıdır.
- L. yaklaşık 500 ul ilave edilerek hücreleri enfekte 10 ml HL5 ortamı (D. discoideum) ya da 10 ml RPMI 1640 (makrofajlar) büyüyen hücreler pneumophila bir gece kültüre. Bu 50 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) karşılık gelmektedir. Daha sonra, enfeksiyon 10 dakika boyunca 500 x g hızında hücreleri üzerinde bakteri santrifüjleme ile senkronize edilmektedir. Santrifüjleme takip ederD. bir kuluçka tarafından 25 ° C ve ° C'de ve% 5 CO2, sırasıyla, 37 RAW264.7 makrofajlar azından discoideum hücreleri. 1 saat ile enfeksiyon süresi santrifüjleme adım içerir.
- Enfeksiyondan sonra orta kaldırmak ve hücre dışı bakteriler kaldırmak için bir kez hücrelerin yıkayın. D. için buz SorC tampon kullanın discoideum ve RAW264.7 makrofajlar için buz gibi soğuk PBS. Her balona proteaz inhibitörleri (Roche) ile desteklenmiş 3 mL HS tampon, ekleme ve hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri toplamak. 15 ml test tüpünde Havuzu gelen örnekleri.
- Örnek kullanımı 3 mL plastik Luer-Lock şırınga ve paslanmaz çelik topu homojenizatörlerinin homojenizasyon için. Eğer buz üzerinde çalıştığından emin olun. Başlamadan önce, herhangi bir deterjan kirlenmesini önlemek ve hava kabarcıkları kurtulmak için buz HS tampon ile temizlemek için, damıtılmış su ile topu Homojenizatör yıkayın. 8 mikron boşluk topu kullanın.
- Şırınga und içine ilk 3 ml doldurun th üzerine montee homojenizatör. Homojenizatör üzerinden ileri ve geri dokuz kez numune basın. -Homojen olmayan malzeme ile kirlenmesini önlemek için daha sonra şırınga ile değişin. Toplayın ve 15 ml test tüpünde homojenize örnek havuzundan ve mikroskopik analiz için 150 mikrolitre numune alır. Farklı bir örnek geçmeden önce demontaj ve topu Homojenizatör yıkayın.
- 4 de buz üzerinde bir karıştırma cihazı üzerinde, 30 dakika süre ile ya da bir yükü-çıkrık (10-20 rpm) üzerinden% 2 veya CS FCS ile Homojenat bloke ° C.
- Engelleme SidC (dilüsyon 1:3000) karşı veya LCV membran için özel olarak bağlayıcı herhangi bir diğer bakteriyel işaretleyici karşı bir yakınlık-saflaştırılmış primer antikor kullandıktan sonra. Homojenat eklemeden önce Vorteks antikor çözüm. 4 ° C'de buz üzerinde bir çalkalayıcı içinde 1 saat süreyle ya da bir yükü-çıkrık (10-20 rpm) üzerine Örnek inkübe
- Bu arada, Histodenz degrade hazırlamak. 15 ml degrade başına test tüpü ve bir örnek de üç 75 cm 2 şişeler kullanın. Köknarst, tüp% 35 Histodenz 5.75 ml ekleyin, ve ikinci, dikkatle üst üste% 10 Histodenz çözeltisi 5.75 mL ekleyin. Daha sonra dikkatli bir şekilde 1 saat boyunca aşağı doğru yatay borular yatıyordu.
- Bloke edici reaktifin ve primer antikor, 4 pelet ° C, örnek olarak 15 dakika süre ile 600 x g'de santrifüj ile Homojenizasyondan inkübasyondan sonra. Süpernatant atılır ve 1.5 mL HS tampon içinde pelletini. Taze bir 15 ml test tüpüne örnekleri aktarın ve daha sonra mikroskobik analiz için 40 ul örnek almak.
- Sekonder antikor ile pelet inkübe - MACS keçi anti-tavşan IgG mikro boncuklar (seyreltme 01:25) -, bir karıştırma cihazı üzerinde, 30 dakika süre ile 4 ° C'de Bu arada, MACS manyetik tutucu sütunlar koymak ve 0.5 mL HS tamponu ile bunları dengelemek.
- Daha sonra, sütun örnekleri uygulanır. Sonraki mikroskopik analiz için akış-150 ul toplayın. 0,5 mL HS sütunu tamponu ile üç kez yıkanır.
- T sütun çıkarınsquirting hemen 0.5 mL HS tamponu ile o mıknatıs ve eluat LCVs. Mikroskobik analizi için 20 mikrolitre numune alın. Immüno-manyetik ayırma ile saflaştırma 1. adımda başına verim bekleniyor × 10 7 D. enfekte discoideum hücreleri yaklaşık 1 × 10 6 bozulmadan hafif ticari araç, yaklaşık yedi kat flow-through 13 ile karşılaştırıldığında eluat zenginleşmiştir.
- Dikey bir konuma Histodenz degrade tüpleri geri koyun ve dikkatle üstüne eluat yükleyin. 4, 1 saat boyunca 3350 x g'de santrifüje tüpler ° C.
- Santrifüj sonra uzun bir cam Pasteur pipeti kullanarak test tüpünün altından başlayarak 1.5 mL kesirler alır. Toplamda sekiz fraksiyonlar, borunun alt her toplamak. Hayır, görünen katmanları sürekli Histodenz degrade gözlenmektedir. LCVs en yüksek verimi genelde ~ 2 oranında kesir 4 bekleniyor başına 1 × 10 5 bozulmadan LCVs × 10 7amipler 13 ödenmiyor. LCVs Az miktarda sırasıyla, kesirler 3 ve 5 de mevcuttur. Böylece, saflaştırılmış hafif ticari araç toplam verimi ~ 1 × 10 × 10 6 7 başına 6 bozulmamış LCVs enfekte olan D. discoideum hücreler 13. LCVs ve geri kazanım oda sıcaklığında (RT) yapıldı ve LCVs birkaç saat boyunca stabil görünür edilebilir.
3. Toplanan numuneler mikroskobik analizi
- Poli-L-lizin kaplı lamelleri ile bir 24-kuyucuklu düz alt doku kültürü plakası hazırlayın.
- LCV arıtma artı 24 de plaka içine her yoğunluk gradiyenti fraksiyonu 150 ul sırasında alınan her numune Pipeti. Yüksek Histodenz konsantrasyonu sulandırmak için her kuyuya 0.5 mL HS tampon ekleyin. Daha sonra, 4 azından 10 dakika süreyle 600 x g de santrifüj plakası ° C. Dikkatlice süpernatant kaldırmak ve RT 20 dk süreyle% 4 paraformaldehit (PFA) ile örnekleri düzeltmek. Tespit edildikten sonra örnekler iki kez yıkayın. BizeD. e SorC discoideum ve RAW264.7 makrofajlar için PBS.
- D. ifade GFP-calnexin gelen örnekleri monte doğrudan örneğin Vectashield kullanılarak cam-slaytlar üzerinde LCV izolasyonu sırasında farklı adımlar alınan discoideum.
- Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile bloke çözeltisi (% 1 PBS içinde BSA) ile birlikte, LCV izolasyonu sırasında farklı aşamalarda alınan RAW264.7 makrofajlar, gelen numune inkübe. (; Tampon engelleme 1:1000 afiniteyle saflaştırılmış tavşan anti-SidC) LCVs leke ve RT de ıslak bir odasında 1s inkübe bir anti-SidC primer antikor kullanın. Daha sonra, PBS ile numuneler üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında bir ıslak ve karanlık odaya 30 dakika süre ile, bir sekonder antikor (çözeltisi engelleme 1:200, örneğin anti-tavşan Cy5) ile inkübe edilir. Son olarak, PBS ile numuneler üç kez yıkayın ve örneğin Vectashield kullanılarak cam-slaytlar monte ederek.
- GFP-calnexin izole LCVs Morfolojisi, bütünlüğü ve miktarı ifade D. discoideum ya RAW264.7 makrofajlar yeterli bir filtre ile donatılmış bir floresans mikroskobu ile analiz edilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Immüno-afinite ayırma ve yoğunluk gradiyenti santrifüj LCV arınma kalite ve verim floresan mikroskobu (Şekil 1) takip edilebilir. Örnekleri arasında bir bakış D. gelen LCV izolasyonu sırasında toplanan discoideu m ya da makrofaj (Şekil 2) gösterilmektedir. L. Homojenat pneumophila-enfekte fagositler sağlam LCVs gösterir, aynı zamanda hücre artıkları ve bakterilerin hücre dışı bir sürü. Örnek peletleme sonra, görüntü, bazen, bir miktar daha yoğun Homojenat benzer. Bozulmamış LCVs sütun sopa gerektiğinden, flow-through çoğunlukla ekstraselüler bakteri ve hücre artıkları bulunur. Sütunundan Örnek elüt sonra, eluat, büyük miktarlarda bozulmadan LCVs içerir. Bizim ellerde, LCV purificati D. için daha etkili olduğu görülmektedir makrofajlar için daha discoideum. D. discoideum patojen vakuol yuvarlak görünür ve izole LCVs verimi makrofajlar (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında 10 kat daha fazladır. Bozulmamış makrofajlar farklı antikorları ile boyanan LVCs de daha düzensiz şekilli görünür.
LCV izolasyon Şekil 1. Şematik bakış. LCV membran münhasıran yerelleştirme, bakteriyel efektör protein SidC karşı bir yakınlık-saflaştırılmış antikor kullanarak immüno-manyetik ayırma ile LCVs A) İzolasyon. İkincil MACS mikro boncuk-coupled antikor ve bir mıknatıs hücre yıkıntıları arasından LCVs izole etmek için kullanılır. B) immüno-manyetik ayırma LCVs sonra daha da Histodenz yoğunluk gradyanı santrifüjleme vasıtasıyla saflandırılırlar. LCVs fraksiyonu 4 zenginleşmiştir.
upload/4118/4118fig2.jpg "/>
Şekil 2. Örnekleri LCV arıtma toplanmıştır. Homojenat, pelet, Görüntüler flow-through ve D eluat discoideum veya makrofajların tasvir edilmektedir. L. örnekleri göstermek pneumophila D. DsRed-Express (kırmızı) üreten GFP sinyali-calnexin (yeşil, üst panel) veya bir anti-SidC antikoru (siyan, alt panelini) ile boyanmış makrofajlarda üreten discoideum. Barlar, 10 mikron.
Şekil 3. D. gelen LCVs Saflaştırılmış discoideum veya makrofajların. Örnekleri L. Histodenz yoğunluk gradiyenti santrifüj sonrasında fraksiyonu 4 göstermek pneumophila (A) D. DsRed-Express (kırmızı) üreten GFP sinyali-calnexin (yeşil) üreten discoideum veya (B) bir anti-SidC antikoru (siyan) ile boyanmış makrofajlarda. Barlar, 10 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha önce yayınlanmış yöntem tersine, bu protokolü iki aşamada, birinci bir immüno-manyetik bir yaklaşım tarafından LCVs ayrılması, ve ikinci olarak, yoğunluk gradyanı santrifüjle LCVs ile saflaştırma dayanmaktadır. LCV izolasyon kolayca floresan ile işaretlenmiş bakteri ve GFP üreten hücreleri veya antikor boyama da kullanılan floresan mikroskobu ile takip edilebilir. Burada açıklanan protokol yüksek saflıkta ile LCVs zenginleşmesine neden basit, düz ileri yöntemdir. Önemli olarak, homojenleştirme tampon içinde proteaz inhibitörü RAW264.7 makrofajlar için gerekli olan, fakat D. discoideum 13 için isteğe bağlı edilir.
Prensip olarak, iletişim kuralı ayırma aşamasına tabi ki, belirli bir, seçici olarak lokalize işaretleyici mevcut olduğu sürece, diğer patojenlerin veya ev sahibi hücreleri için kabul edilebilir. İdeal olarak, belirgin işareti, bakteriyel kökenli vakuol membran taşınan birnd seçici var yerelleştirilmesi. Diğer ev sahibi hücre bölmeleri olan patojen vakuol eş-saflaştırma istenmeyen bir konakçı hücreye işaretleyici olasılıkla sonuçlar hedefleme.
Patojen vakuol ayırt edici bir belirteç tespit edildiğinde, uygun bir poliklonal veya monoklonal antikor tutulması gerektiğini belirtmektedir. FCS dışındaki reaktiflerin daha uygun olabilir engelleme gibi her primer antikor için konsantrasyon ve engelleme reaktif, optimize edilmelidir (örneğin BSA, de-lipidlenmiş süt, piyasada mevcut diğer engelleme reaktifleri).
Başka kritik nokta patojenin enfektivite olduğunu. Enfeksiyon için kullanılan bakteri bunların en enfeksiyon aşamasında olmalıdır. L. pneumophila, örneğin sıvı kültür post-exponential/early durağan faz büyüme yetiştirilen gerekir. Bu koşullar altında, bakteriler, (~ 2 x 0,5 mikron) morfolojik üniforma olarak CYE agar yetişen bakteriler karşı çıkıyorlar. Dahası, antibiotimuhtemelen hücre kültür aracı maddesi içinde kullanılan CS bakteriler için düşük enfektivite ve zarar vermemek için bir enfeksiyon önce kaldırılması gerekir. Uptake verimi üzerinde olumsuz bir etkisi önlemek için, fagositlerin enfeksiyon zamanda (fazla değildir) yaklaşık% 80 arasında bir konfluent ulaşmıştır olmalıdır. Son olarak, 1 saat bir kuluçka dönemi L. için standart bir enfeksiyon zaman olmasına rağmen, pneumophila, hafif ticari araç ve oldukça homojen ve sağlam nüfusu veren, diğer zaman noktaları LCV oluşumu 13 proteomik veya biyokimyasal çalışmalar için seçilebilir.
Yukarıdaki yöntem, belirli bir patojen-konakçı hücreye çifti için kurulduktan sonra, D. içeren bakteri mutant soylar ve / veya farklı ev sahibi hücreleri, test etmek de mümkündür discoideum iptal mutantlarının tanımlanır. Genel olarak, bu protokol ile saflaştırılmış patojen vakuol biz, mikroskop (floresan ve elektron mikroskobu), biyokimyasal testleri (Western Blot) dahil olmak üzere farklı yöntemlerle analiz edilebilirproteomik ve lipidomics olarak ll. İkinci yöntem için, proteomik / lipidomics analiz tampon koşulları, örnek miktarları ve patojen vakuol saflaştırılmış sonraki işlemlerde sorumlu kişi ile koordine etmek önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Laboratuarımızda Araştırma Max von Pettenkofer Enstitüsü, Ludwig-Maximilians Üniversitesi Münih, Alman Araştırma Topluluğu (DFG, HI 1511/3-1) ve Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Tıbbi Enfeksiyon Genomics" inisiyatifi tarafından desteklenmiştir ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
