Summary
本文介绍了一个完整的隔离和净化的方法
Abstract
条件致病菌嗜肺军团菌是一种抗阿米巴的细菌，这也是在肺泡巨噬细胞，从而导致重症肺炎“退伍军人病”1复制。在原生动物和哺乳动物吞噬，L。肺采用了保守的机制，以形成特定的许可，复制，车厢，“含军团菌的空泡”（轻型商用车）。轻型商用车的形成需要ICM / DOT细菌IV型分泌系统（T4SS）“275效应”的蛋白质，其中的translocates进入宿主细胞。效应操纵宿主蛋白以及血脂和分泌，内体和线粒体的细胞器2-4沟通。
的LCVs形成一个复杂的，强大的和冗余的过程，这是很难把握，在还原的方式。一个综合性的做法需要全面了解轻型商用车的形成，包括一个全球性的路径分析ogen宿主因子的相互作用及其时空动态。为实现这一目标的第一步，完整LCVs纯化和蛋白质组学和脂类组学分析。
已被调查的蛋白质组学分析，使用液相色谱或2-D电泳质谱仪耦合的组成和形成的含病原体的空泡。 9， 沙门氏菌 ， 球菌 8，7 分枝杆菌 ， 李斯特菌 6 利什曼 5 军团菌分离的社会土壤变形虫粘菌或哺乳动物吞噬细胞空泡窝藏10。然而，在这些研究中采用的协议是净化费时和繁琐，因为他们需要如电子显微镜分析轻型商用车的形态，完整性和纯度。此外，这些协议不利用EN病原体液泡的具体特点富集。
这里介绍的方法克服了这些限制，由用人四discoideum生产轻型商用车荧光标记和针对细菌效应蛋白SIDC，选择性地结合到磷酸肌醇4 -磷酸（PtdIns（4）P）的3,11轻型商用车膜锚。第一步由SIDC和二级抗体，加上磁珠古典Histodenz密度梯度离心12,13（ 图1），其次是第二步，对主要抗体亲和纯化的免疫磁性分离富集LCVs 。
一个蛋白质孤立LCVs的研究从 D discoideum发现560多宿主细胞包括吞噬囊泡，线粒体，ER和高尔基，以及一些GTP酶，它没有被牵连13日之前在轻型商用车形成相关蛋白的蛋白质，。丰富和纯化LCVs协议概述，这里还可以进一步分析显微镜（免疫荧光法，电子显微镜），生化方法（免疫印迹）和蛋白质或lipidomic办法。
Protocol
1。轻型商用车分离的筹备工作
- 连续出嗜肺军团菌生产甘油股票CYE平板DsRed的，快13,14轻型商用车隔离之前的5微克/毫升氯霉素（CAM）四天。细菌在37°C。
- 种子出1×10 7 D。 discoideum生产GFP-calnexin或75厘米2组织培养的RAW264.7巨噬细胞瓶前一天的感染。使用10毫升20微克/毫升为四 G418的HL5中等discoideum和孵化的变形虫在23°C对于RAW264.7巨噬细胞用10毫升辅以10％FCS（热灭活）和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基，生长的细胞在37°C和5％的CO 2。使用至少有三个75厘米2％感染和样本瓶（至少6×10 7细胞）。
- 接种过夜培养与研究肺从CYE板。以埃中等3毫升15毫升试管凸轮5微克/毫升。 100的产量为0.1 OD 600nm的细菌悬浮液接种。在37°C孵育架空旋转轮上过夜培养21-22小时。
2。轻型商用车的分离
- 改变四中等discoideum细胞清除以下感染的抗生素，这会干扰。
- 测量外径过夜培养。细菌已达到其峰值传染性≥3 OD 600nm的 ，这相当于2×10 9菌/毫升。
- 感染细胞，加入约500μL的研究肺过夜培养增长10毫升HL5介质（ 四discoideum）或10毫升的RPMI 1640（巨噬细胞）的细胞。这相当于一个感染复数（MOI），50。随后，500×G同步感染到细菌细胞的离心10分钟。离心后由孵化了D.在25°C和RAW264.7巨噬细胞在37°C和5％CO 2，分别discoideum细胞。感染1小时的时间，包括离心步骤。
- 感染后取出介质和洗一次删除外的细菌细胞。使用D.冰冷的SORC缓冲区discoideum和冰冷的RAW264.7巨噬细胞的PBS。加入3毫升HS缓冲区，辅以蛋白酶抑制剂（罗氏）每个烧瓶，用细胞刮刀收集细胞。相应的样品池在15毫升的试管。
- 样品用3毫升塑料露儿锁注射器和不锈钢球均质同质化。确保您在冰工作。在开始之前，用蒸馏水洗球均质，以避免任何洗涤剂污染和冲洗冰冷协缓冲区得到消除气泡。使用8微米的间隙球。
- 填充到第3毫升注射器UND安装在THé均质。按样品来回通过均质九倍。交换后的注射器，以避免与非均质材料的污染。收集和池均质样品15 mL试管微观分析，并采取了150μL样品。在不同的样本出发之前，拆除和洗球均质。
- 阻止振动筛上的冰30分钟或架空纺车（10-20转）匀浆2％CS或FCS在4°C。
- 阻断后使用对SIDC（1:3000稀释）或反对任何其他细菌指标完全结合轻型商用车膜亲和纯化抗体。涡抗体溶液，然后再将其添加到匀浆。样品在4°C孵育1小时上冰筛上或架空纺车（10-20转）
- 在此期间，准备Histodenz梯度。使用每梯度15毫升的试管和3个75厘米2瓶的一个样本。冷杉ST，加入5.75毫升的35％Histodenz管，第二，小心加入5.75毫升10％Histodenz解决方案之上。事后仔细铺设管水平为1小时。
- 阻断试剂和抗体，在600×g下离心15分钟，在4°C至颗粒样品匀浆后孵化。弃上清，悬浮颗粒在1.5毫升HS缓冲区。转移到一个新的15毫升试管样品和微观分析40μL样品后。
- 孵化与二次抗体沉淀 - 磁珠山羊抗兔IgG微珠（1:25稀释） - 振动筛为30分钟，在4°C在此期间，在Mac上的磁持有的列和0.5毫升协缓冲区平衡。
- 随后，适用于样品列。通过收集流量为150μL，在随后的微观分析。用0.5毫升HS缓冲液洗列的三倍。
- 从T中删除列他的磁铁和洗脱液LCVs直接喷射0.5毫升协缓冲区。微观分析，以20μL样品。免疫磁分离纯化步骤，预计产量每1×10 7感染D。 discoideum细胞约1×10 6的完整LCVs，其中约七倍在洗脱液浓缩与流过13。
- 提出的Histodenz梯度管，垂直位置，谨慎地装载在上面的洗脱液。 1小时离心管3350×G在4°C。
- 离心后，取1.5毫升的分数，从试管底部开始使用长玻璃巴斯德吸管。共收集8个组分，每个从试管底部。观察不可见的层在连续Histodenz的梯度。产量最高的LCVs通常〜2的比例预计在分数4×10 5个完整的LCVs每1×10 7染病变形虫13。未成年人数量LCVs也存在组分3和5，分别。因此，纯化LCVs的整体产量是1×10 6×10 7 6％不变LCVs感染D。 discoideum细胞13。在室温（RT），可以进行恢复LCVs和的LCVs出现了几个小时的稳定。
3。采集的微观分析
- 准备与聚-L-赖氨酸涂层盖玻片的24孔平底培养板。
- 吸取轻型商用车净化加150微升到24孔板的每一个密度梯度分数在采取每一个样本。每孔加入0.5毫升HS缓冲区冲淡高Histodenz浓度。此后，离心10分钟600×G板在4°C。小心取出上清液，并修复与4％多聚甲醛在室温为20分钟（PFA）的样品。固定后洗两次样本。我们为四 éSORC discoideum和PBS RAW264.7巨噬细胞。
- GFP-calnexin装入样品，表示D。 discoideum，在轻型商用车上直接使用如Vectashield玻璃幻灯片隔离，采取不同的步骤。
- 样品孵育RAW264.7巨噬细胞，采取不同的步骤，在轻型商用车隔离，封闭液在室温为10分钟（1％BSA的PBS中）。使用反SIDC抗体，染色LCVs在湿室（亲和纯化兔抗SIDC;封闭液1:1000）在室温孵育1小时。随后，洗样品，用PBS三次。孵化与二次抗体（如抗兔Cy5的;封闭液1:200）为30分钟，在室温下湿暗室。最后，洗样品用PBS三次，并安装上使用如Vectashield玻璃的幻灯片。
- 形态，完整性和分离GFP-calnexin LCVs的数量表达D。 DIScoideum或从RAW264.7巨噬细胞分析，荧光显微镜，配备足够的过滤器。
4。代表结果
可通过免疫亲和分离和密度梯度离心的质量和产量的轻型商用车净化后用荧光显微镜（ 图1）。 D.轻型商用车隔离期间收集样品的概述discoideu米或巨噬细胞（ 图2）所示。 L 的匀浆肺感染的巨噬细胞显示完整LCVs，但也有大量细胞碎片和细胞外细菌。制粒样品后，图像的类似的匀浆，有时有点密集。由于完整LCVs要坚持列，流过主要包含外的细菌和细胞碎片。列样品洗脱后，洗脱液中包含大量完整LCVs。在我们的手中，轻型商用车purificati上似乎是更有效地为D。 discoideum比为巨噬细胞。 在 D discoideum的病原体空泡出现全才和的孤立LCVs产量是与巨噬细胞（ 图3）相比，高出10倍以上。在完整的巨噬细胞与不同的抗体染色的低消费量国家还出现更多的不规则形状。
图1。原理概述轻型商用车隔离。一）分离LCVs使用对细菌效应蛋白SIDC亲和纯化抗体，完全本地化的轻型商用车膜免疫磁性分离。用于分离细胞碎片LCVs次要磁珠微珠耦合抗体和磁铁。 b）在免疫磁分离LCVs的是由Histodenz密度梯度离心进一步纯化。 LCVs丰富的分数4。
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图2。样品收集在轻型商用车净化。从匀浆，沉淀，图片流过， 从 D洗脱液discoideum或巨噬细胞被描绘。该样本显示L。肺产生在 D DsRed的表达（红色） discoideum生产绿色荧光，calnexin信号（绿色，上游面板）或抗的SIDC抗体（青色，下部面板）染色的巨噬细胞。酒吧，10微米。
图3。纯化从 D LCVs discoideum或巨噬细胞。 研究 Histodenz密度梯度离心后的样品显示分数4 肺 （一）D生产DsRed的表达（红色） discoideum生产绿色荧光，calnexin信号（绿色）或（B）与抗的SIDC抗体（青色）染色的巨噬细胞。酒吧，10微米。
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Discussion
在此前公布的方法相比，该协议是基于两个步骤，首先通过免疫磁性分离的LCVs，和第二，通过密度梯度离心LCVs净化。轻型商用车的隔离，可以很容易地后，荧光显微镜，要么荧光标记的细菌和细胞产生的细胞或抗体染色时使用。这里描述的协议是一个简单的，直接的方法，该方法在高纯度浓缩铀的LCVs结果。重要的是，在同质化缓冲区的蛋白酶抑制剂是必需的RAW264.7巨噬细胞，但D. discoideum 13可选。
在协议的原则，可以采取其他病原体或宿主细胞，只要一个具体的，有选择性的定位标记是存在的，这是需要分离步骤。理想的情况下，细菌来源的明显标志是，运送到液泡膜，ND选择性本地化。针对宿主细胞标记可能导致意外的病原体与宿主细胞车厢液泡共同净化。
，一旦病原体液泡的鲜明标志是确定的，一个合适的多克隆或单克隆抗体，还有待提高。对于每一个主要抗体的浓度和阻断剂应优化，为阻止FCS的其他试剂可能是更合适的（如牛血清白蛋白，去脂化奶，其他市售阻断试剂）。
另一个关键点是病原体的传染性。细菌感染应该在研究他们大多数的感染阶段。例如， 肺 ，需要生长在液体培养post-exponential/early平稳增长阶段。在这些条件下，细菌形态均匀（〜2×0.5微米），反对CYE平板上生长的细菌。此外，antibioti在细胞培养液中可能使用的CS必须拆除之前，以避免低传染性和危害性的细菌感染。吞噬细胞吸收效率，以避免负面影响，应在感染时已经达到了约80％汇合（不超过）。最后，虽然1小时的潜伏期是标准的感染时间为 L 肺 ，产生的LCVs的而同质性和强大的人口，其他的时间点，可以选择轻型商用车形成13的蛋白质或生化研究。
一旦上述方法对于一个给定的病原体宿主细胞对建立的，它也有可能测试细菌突变株和/或不同的宿主细胞，包括D。 discoideum定义的缺失突变体。在一般情况下，纯化与本议定书的病原体空泡可以通过不同的方法，包括显微镜（荧光和电子显微镜），生化检测（Western印迹）分析，因为我们蛋白质组学和脂类组学的LL。对于后者的方法，最好是在蛋白质组学/脂类组学分析的缓冲条件，样品量和下游加工，纯化病原空泡负责人协调。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
在我们的实验室研究是由马克斯·冯·Pettenkofer研究所，慕尼黑路德维希 - 马克西米利安大学德国研究基金会（DFG，您好1511/3-1）的Bundesministerium献给教化和Forschung（BMBF）的“医疗感染基因组学”的倡议（ 0315834C）。
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