Summary
Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento e la purificazione di intatto
Abstract
L'agente patogeno opportunistico Legionella pneumophila è un ameba-batterio resistente, che replica anche nei macrofagi alveolari causando la grave polmonite "'malattia del legionario" 1. In fagociti protozoi e mammiferi, L. pneumophila si avvale di un meccanismo conservato in modo da formare uno specifico, la replica-permissive vano, la "Legionella contenente vacuolo" (LCV). Richiede la formazione di LCV batterica Icm / Dot sistema di secrezione di tipo IV (T4SS), che trasloca ben 275 "effettrici" proteine in cellule ospiti. Gli effettori manipolare proteine di accoglimento, nonché lipidi e comunicare con secretoria, organelli endosomiali e mitocondriale 2-4.
La formazione di veicoli commerciali leggeri rappresenta un processo complesso, robusto e ridondante, che è difficile da afferrare in maniera riduzionista. Un approccio integrato è necessario per comprendere esaurientemente la formazione di LCV, compresa un'analisi globale del percorsoplasminogeno interazioni ospite-fattori e le loro dinamiche temporali e spaziali. Come primo passo verso questo obiettivo, veicoli commerciali leggeri intatte vengono purificati e analizzati dalla proteomica e lipidomica.
La composizione e la formazione di patogeno contenenti vacuoli è stata studiata mediante analisi proteomica mediante cromatografia liquida o 2-D elettroforesi su gel accoppiato a spettrometria di massa. Vacuoli isolati sia dal suolo un'ameba sociale Dictyostelium discoideum o fagociti di mammifero ospitato Leishmania 5, 6 Listeria, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 o Salmonella Legionella spp. Dieci. Tuttavia, i protocolli di purificazione impiegati in questi studi sono tempo e noiosa, in quanto richiedono ad esempio microscopia elettronica per analizzare morfologia LCV, l'integrità e purezza. Inoltre, questi protocolli non sfruttare le caratteristiche specifiche del vacuolo patogeno per l'enrichment.
Il metodo qui presentato supera queste limitazioni impiegando D. discoideum produrre un marcatore fluorescente LCV e prendendo di mira il SIDC batterica proteine effettrici, che selettivamente ancoraggio alla membrana LCV legandosi alla fosfatidilinositolo 4-fosfato (PtdIns (4) P) 3,11. LCV sono arricchite in una prima fase di immuno-separazione magnetica utilizzando un purificati per affinità anticorpo primario contro SIDC e un anticorpo secondario accoppiato a biglie magnetiche, seguita in una seconda fase dalla classica centrifugazione in gradiente di densità Histodenz 12,13 (Fig. 1) .
Uno studio del proteoma di veicoli commerciali leggeri isolati dal D. discoideum rivelato più di 560 proteine della cellula ospite, comprese le proteine associate con vescicole fagocitica, mitocondri, ER e Golgi, nonché GTPasi diversi, che non sono stati implicati nella formazione LCV prima 13. LCV arricchito e purificato con ilprotocollo descritto qui può essere ulteriormente analizzati al microscopio (immunofluorescenza, microscopia elettronica), metodi biochimici (Western Blot) e gli approcci di proteomica o lipidomic.
Protocol
1. I preparativi per isolamento LCV
- Streak out Legionella pneumophila produce DsRed-Express 13,14 dalle scorte di glicerolo su piastre di agar CYE con 5 mcg / ml di cloramfenicolo (Cam) quattro giorni prima di isolamento LCV. Incubare i batteri a 37 ° C.
- Seed out 1 x 10 7 D. discoideum produzione di GFP-calnexina o RAW264.7 macrofagi murini in 75 cm 2 coltura tissutale palloni un'infezione giorno prima. Utilizzare 10 ml HL5 media con 20 ug / mL G418 per D. discoideum e incubare le amebe a 23 ° C. Per utilizzare RAW264.7 macrofagi 10 ml mezzo RPMI 1640 integrato con 10% FCS (inattivato con il calore) e 1% glutammina, e crescere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2. Utilizzare almeno tre 75 cm 2 palloni per l'infezione e il campione (minimo 6 x 10 7 cellule).
- Inoculare una cultura notte con L. pneumophila dalla piastra CYE. Prendere una provetta da 15 ml con 3 mL AYE mediae 5 ug / mL Cam. Inoculare con 100 pl di una sospensione batterica per ottenere un OD 600nm di 0,1. Incubare la coltura durante la notte su una ruota rotazione testa a 37 ° C per 21-22 hr.
2. LCV isolamento
- Cambia il mezzo di D. discoideum cellule per rimuovere il antibiotico, che interferirebbero con la successiva infezione.
- Misurare la densità ottica della cultura durante la notte. I batteri dovrebbe aver raggiunto la loro infettività picco a uno OD 600nm di ≥ 3, che corrisponde a 2 x 10 9 batteri / ml.
- Infettare le cellule aggiungendo circa 500 pl di L. pneumophila coltura durante la notte per le cellule crescono in 10 ml HL5 mezzo (D. discoideum) o 10 ml RPMI 1640 (macrofagi). Questo corrisponde ad una molteplicità di infezione (MOI) di 50. Successivamente, l'infezione è sincronizzato mediante centrifugazione dei batteri sulle celle a 500 g per 10 min. Centrifugazione è seguitada un'incubazione del D. discoideum cellule a 25 ° C ed i macrofagi RAW264.7 a 37 ° C e 5% CO 2, rispettivamente. Il tempo di infezione di 1 ora comprende la fase di centrifugazione.
- Dopo infezione rimuovere il terreno e lavare le cellule una volta per rimuovere i batteri extracellulari. Utilizzare tampone ghiacciato SORC per D. discoideum e gelide PBS per RAW264.7 macrofagi. Aggiungere 3 mL HS buffer, integrato con inibitori della proteasi (Roche) ad ogni pallone e raccogliere le cellule utilizzando un raschietto cellulare. Pool i relativi campioni in una provetta da 15 ml.
- Per la omogeneizzazione delle utilizzare campioni 3 ml di plastica siringhe Luer-Lock e la sfera in acciaio inox Omogeneizzatore. Assicurarsi che si lavora su ghiaccio. Prima di iniziare, lavare l'omogeneizzatore palla con acqua distillata, per evitare qualsiasi contaminazione detergente e sciacquare con tampone ghiacciata HS per sbarazzarsi di bolle d'aria. Utilizzare l'8 ball gioco micron.
- Riempire i primi 3 ml in siringa und montarlo su maggioe omogeneizzatore. Premere il campione avanti e indietro nove volte attraverso l'omogeneizzatore. Scambiarsi le siringhe in seguito per evitare la contaminazione con materiale non omogeneizzato. Raccogliere e mettere in comune il campione omogeneizzato in una provetta da 15 ml e prendere un campione di 150 microlitri per l'analisi microscopica. Prima di procedere con un campione diverso smontare e lavare il omogeneizzatore palla.
- Bloccare l'omogeneizzato con 2% FCS o CS per 30 minuti su un agitatore su ghiaccio o su un overhead filatura ruota (10-20 rpm) a 4 ° C.
- Dopo aver bloccato utilizzare un purificate per affinità anticorpo primario contro il SIDC (diluizione 1:3000) o contro qualsiasi altro marcatore batterica esclusivamente legame alla membrana LCV. Vortex la soluzione di anticorpi prima di aggiungerlo alla omogeneizzato. Incubare il campione per 1 h su un agitatore su ghiaccio o su un overhead filatura ruota (10-20 rpm) a 4 ° C.
- Nel frattempo, preparare il gradiente Histodenz. Utilizzare una provetta da 15 ml per pendenza e tre fiasche 75 cm 2 di un campione. Abetest, aggiungere 5,75 ml di 35% Histodenz al tubo, e la seconda, accuratamente aggiungere 5,75 ml di soluzione al 10% Histodenz sopra. Poi adagiare i tubi in orizzontale verso il basso per 1 ora.
- Dopo incubazione della omogenato con il reagente di bloccaggio e l'anticorpo primario, centrifugare a 600 g per 15 min a 4 ° C per il campione pellet. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1,5 mL di tampone HS. Trasferire i campioni in una nuova Provetta da 15 ml e prendere un campione di 40 microlitri per l'analisi microscopica in seguito.
- Incubare il pellet con l'anticorpo secondario - MACS capra anti-IgG di coniglio micro perline (diluizione 1:25) - per 30 minuti su un agitatore a 4 ° C. Nel frattempo, mettere le colonne MACS sul supporto magnetico ed equilibrare con 0,5 mL di tampone HS.
- Successivamente, i campioni applicare alla colonna. Raccogliere 150 pl del flusso passante per la successiva analisi microscopica. Lavare la colonna tre volte con 0,5 mL di tampone HS.
- Rimuovere le colonne da tegli magnete e eluato i veicoli commerciali leggeri con 0,5 mL di tampone HS di immediata squirting. Prendete un campione di 20 microlitri per l'analisi microscopica. La fase di purificazione per immuno-separazione magnetica si prevede di cedere per 1 × 10 7 infettato D. cellule discoideum circa 1 × 10 6 LCV intatte, che sono circa sette volte arricchiti nell'eluato rispetto al flusso passante 13.
- Mettere i tubi gradiente Histodenz indietro in una posizione verticale e accuratamente caricare l'eluato sopra. Centrifugare le provette a 3350 × g per 1 ora a 4 ° C.
- Dopo centrifugazione prendere 1,5 mL frazioni a partire dal fondo della provetta mediante un lungo vetro pipetta Pasteur. Complessivamente raccogliere frazioni otto, ciascuno dal fondo del tubo. Non sono stati osservati livelli visibili nella pendenza costante Histodenz. La massima resa di questi veicoli è tipicamente previsto nella frazione 4 ad un rapporto di circa 2 x 10 5 LCV intatte per 1 × 10 7 ininfetto amebe 13. Minori quantità di veicoli commerciali leggeri sono presenti anche in frazioni 3 e 5, rispettivamente. Pertanto, la resa complessiva di LCV purificate è ~ 1 × 10 6 LCV intatte per 6 × 10 7 infettato D. cellule discoideum 13. Il recupero di veicoli commerciali può essere eseguita a temperatura ambiente (RT), e le LCV appaiono stabile per molte ore.
3. L'analisi microscopica dei campioni raccolti
- Preparare un 24 pozzetti a fondo piatto piastra di coltura dei tessuti con coprioggetto rivestiti di poli-L-lisina.
- Pipettare ogni campione prelevato durante la purificazione LCV più 150 pl di ciascuna frazione gradiente di densità nella piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 0,5 ml di tampone HS ad ogni pozzetto per diluire la concentrazione Histodenz. Successivamente, centrifugare la piastra a 600 g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere con cautela il surnatante e fissare i campioni con 4% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a RT. Dopo fissazione lavare i campioni due volte. Noie SORC per D. discoideum e PBS per RAW264.7 macrofagi.
- Montare i campioni di GFP-calnexina esprimono D. discoideum, prese a diverse fasi durante l'isolamento LCV, direttamente sul vetro diapositive utilizzando Vectashield ad es.
- Incubare i campioni da RAW264.7 macrofagi, fatte a passi differenti durante l'isolamento LCV, con una soluzione bloccante (1% BSA in PBS) per 10 minuti a RT. Utilizzare un anticorpo anti-SIDC primaria a macchiare i veicoli commerciali e incubare per 1 ora in una camera umida a temperatura ambiente (purificato per affinità di coniglio anti-SIDC; 1:1000 in tampone di bloccaggio). Successivamente, lavare i campioni tre volte con PBS. Incubare con un anticorpo secondario (per esempio anti-coniglio Cy5, 1:200 in soluzione bloccante) per 30 minuti in una camera umida e buio, a RT. Infine, lavare i campioni tre volte con PBS e li montano sul vetro diapositive utilizzando Vectashield ad es.
- Morfologia, l'integrità e la quantità dei veicoli commerciali leggeri isolati da GFP-calnexina esprimere D. DIScoideum o da RAW264.7 macrofagi vengono analizzati mediante un microscopio a fluorescenza equipaggiato con i filtri adeguati.
4. Risultati rappresentativi
La qualità e la resa di purificazione LCV mediante immuno-affinità separazione e centrifugazione in gradiente di densità può essere seguito mediante microscopia a fluorescenza (Fig. 1). Una panoramica dei campioni raccolti durante l'isolamento LCV dal D. discoideu m o macrofagi viene mostrato (Fig. 2). L'omogenato di L. pneumophila con infezione da fagociti mostra intatte veicoli commerciali leggeri, ma anche un sacco di detriti cellulari e batteri extracellulari. Dopo pellet il campione, l'immagine è simile al omogenato, a volte un po 'più densa. Poiché LCV intatte dovrebbe aderire alla colonna, il flusso attraverso lo contiene batteri extracellulari ed i detriti cellulari. Dopo eluizione del campione dalla colonna, l'eluato contiene LCV intatte in grandi quantità. Nelle nostre mani, la LCV purificati sulla sembra essere più efficace per D. discoideum che per macrofagi. In D. discoideum i vacuoli patogeno appaiono più rotondo e la resa dei veicoli commerciali leggeri isolati più di 10 volte superiore rispetto ai macrofagi (Fig. 3). In macrofagi intatti LVCs colorati con anticorpi diversi appaiono anche più di forma irregolare.
Figura 1. Schema di isolamento LCV. A) Isolamento di veicoli commerciali leggeri da immuno-separazione magnetica utilizzando un anticorpo purificato per affinità contro il SIDC batterica proteine effettrici, la localizzazione esclusivamente alla membrana LCV. Un secondo MACS micro perline accoppiato anticorpo e un magnete vengono utilizzati per isolare i veicoli commerciali da detriti cellulari. B) Dopo immuno-magnetiche veicoli commerciali leggeri di separazione sono ulteriormente purificati mediante centrifugazione in gradiente di densità Histodenz. Veicoli commerciali leggeri sono arricchiti in un'aliquota del 4.
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I campioni Figura 2. Raccolte durante la purificazione LCV. Immagini da omogenato, pellet, a flusso continuo e eluato da D. discoideum o macrofagi sono raffigurate. I campioni mostrano L. pneumophila produce DsRed-Express (rosso) in D. discoideum produzione di GFP-calnexina segnale (verde, pannello superiore) o in macrofagi colorato con un anticorpo anti-SIDC (ciano, pannello inferiore). Bar, 10 pm.
Figura 3. Purificato veicoli commerciali leggeri da D. discoideum o macrofagi. I campioni mostrano un'aliquota del 4, dopo centrifugazione in gradiente di densità Histodenz di L. pneumophila produce DsRed-Express (rosso) (A) D. discoideum produzione di GFP-calnexina segnale (verde) o (B) in macrofagi colorato con un anticorpo anti-SIDC (ciano). Bar, 10 pm.
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Discussion
In contrasto con i metodi pubblicati in precedenza, questo protocollo si basa su due fasi, prima la separazione dei veicoli commerciali leggeri da parte di un approccio immuno-magnetico, e la seconda, la purificazione dei veicoli commerciali leggeri di centrifugazione in gradiente di densità. L'isolamento LCV può essere facilmente seguita da microscopia a fluorescenza, quando sia i batteri fluorescente GFP e cellule produttrici di anticorpi o di colorazione viene utilizzato. Il protocollo qui descritto è un semplice, straight-forward metodo, che comporta l'arricchimento di LCV con elevata purezza. È importante, l'inibitore di proteasi nel tampone di omogeneizzazione è necessaria per RAW264.7 macrofagi, ma facoltativo per discoideum D. 13.
In linea di principio, il protocollo può essere adottata per altri patogeni o cellule ospiti, finché uno specifico, marcatore selettivo localizzazione è presente, che è necessario per la fase di separazione. Idealmente, il marcatore distinto è di origine batterica, trasportato alla membrana vacuolo, unond selettivamente localizzazione lì. Targeting un risultato probabili marcatori delle cellule ospite indesiderato nella co-purificazione del vacuolo patogeno con altri comparti della cellula ospite.
Una volta che un marcatore distintivo del vacuolo patogeno è identificato, un anticorpo policlonale o monoclonale adatto deve essere sollevata. Per ogni anticorpo primario e la concentrazione del reagente bloccante deve essere ottimizzata, come blocco reagenti diversi FCS potrebbe essere più appropriata (ad es BSA, de-lipidated latte, altri reagenti commercialmente disponibili di blocco).
Un altro punto critico è l'infettività del patogeno. I batteri usati per l'infezione dovrebbe essere nella loro fase più infettivo. L. pneumophila, ad esempio, deve essere prodotti nella fase di crescita stazionaria post-exponential/early in coltura liquida. In queste condizioni, i batteri sono morfologicamente uniforme (~ 2 x 0,5 micron), a differenza di batteri cresciuti su piastre di agar CYE. Inoltre, antibiotics eventualmente utilizzato nel mezzo di coltura cellulare deve essere rimosso prima di un'infezione per evitare infettività basso e danno ai batteri. Per evitare un effetto negativo sull'efficienza assorbimento, i fagociti dovrebbe aver raggiunto una confluenza di circa il 80% (non più) al momento dell'infezione. Infine, sebbene un periodo di incubazione di 1 ora è il tempo infezione standard per L. pneumophila, producendo una popolazione piuttosto omogenea e robusta di veicoli commerciali leggeri, altri punti temporali possono essere scelti per studi di proteomica o biochimici sulla formazione LCV 13.
Una volta che il metodo di cui sopra viene stabilito per un dato patogeno-cellula ospite coppia, è anche possibile testare batteriche ceppi mutanti e / o cellule ospiti differenti, compreso D. discoideum definito mutanti di delezione. In generale, vacuoli patogeni purificati con questo protocollo può essere analizzati con metodi diversi, tra cui microscopia (microscopia a fluorescenza e elettronica), saggi biochimici (Western blot), come abbiamoll come proteomica e lipidomica. Per questi ultimi metodi, si consiglia di coordinarsi con il responsabile delle proteomica / analisi lipidomica le condizioni del tampone, gli importi dei campioni e l'elaborazione a valle del purificata vacuoli patogeni.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
La ricerca nel nostro laboratorio è stato sostenuto dalla Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians University di Monaco di Baviera, il tedesco Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) iniziativa "Infezione Medical Genomics" ( 0315834C).
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