Summary
Dit artikel beschrijft een werkwijze voor de isolatie en zuivering van intacte
Abstract
De opportunistische pathogeen Legionella pneumophila is een amoebe-resistente bacterie, die ook repliceert in alveolaire macrofagen waardoor voor de ernstige longontsteking "veteranenziekte" 1. In protozoa en zoogdieren fagocyten, L. pneumophila maakt gebruik van een geconserveerd mechanisme om een specifieke, replicatie-tolerante compartiment, de "Legionella-bevattende vacuole" (LCV) te vormen. LCV vorming vereist dat de bacteriële ICM / Dot type IV secretie systeem (T4SS), die maar liefst 275 "effector" eiwitten translokeert in gastheercellen. De effectoren manipuleren gastheer eiwitten en lipiden en communiceren met secretie, endosomale en mitochondriale organellen 2-4.
De vorming van een complexe bedrijfsauto, robuuste en redundante proces moeilijk te vatten in een reductionistische wijze. Een integrale aanpak is nodig om volledig te begrijpen LCV vorming, inclusief een globale analyse van het padOgen-host factor interacties en hun temporele en ruimtelijke dynamiek. Als een eerste stap op weg naar dit doel, zijn intact lichte bedrijfswagens gezuiverd en geanalyseerd met behulp van proteomics en lipidomics.
De samenstelling en de vorming van pathogeen bevattende vacuolen is onderzocht door proteoomanalyse met vloeistofchromatografie en 2-D gelelektroforese gekoppeld met massaspectrometrie. Vacuolen geïsoleerd van zowel de sociale bodem amoebe Dictyostelium discoideum of zoogdieren fagocyten koesterde Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 of Salmonella Legionella spp. 10. De zuivering protocollen gebruikt in deze studie zijn tijdrovend en moeizaam, omdat hiervoor bijvoorbeeld elektronenmicroscopie LCV morfologie integriteit en zuiverheid analyseren. Bovendien zijn deze protocollen niet gebruikmaken van specifieke kenmerken van de ziekteverwekker vacuole voor enrichment.
De hier beschreven methode overwint deze beperkingen door gebruik D. discoideum het produceren van een fluorescente marker LCV en door zich te richten de bacteriële effector eiwit SIDC, die selectief ankers om het LCV membraan door te binden aan fosfatidylinositol 4-fosfaat (PtdIns (4) P) 3,11. Bedrijfsauto zijn verrijkt in een eerste stap van immuno-magnetische scheiding met affiniteit-gezuiverde primaire antilichaam tegen SIDC en een tweede antilichaam gekoppeld met magnetische korrels, gevolgd in een tweede stap een klassieke Histodenz dichtheid gradiënt centrifugatie 12,13 (Fig. 1) .
Een proteoom studie van geïsoleerde lichte bedrijfswagens van D. discoideum bleek meer dan 560 gastheercel eiwitten, zoals eiwitten geassocieerd met fagocytaire vesicles, mitochondria, ER en Golgi, alsmede enkele GTPases, die niet in LCV vorming betrokken bij 13. Lichte bedrijfswagens verrijkt en gezuiverd met debeschreven protocol kan hier verder worden geanalyseerd met behulp van microscopie (immunofluorescentie, elektronenmicroscopie), biochemische methoden (Western blot) en proteomics of lipiden benaderingen.
Protocol
1. De voorbereidingen voor LCV Isolatie
- Streak op Legionella pneumophila de productie van DsRed-Express 13,14 uit glycerol voorraad op CYE agar platen met 5 ug / ml chlooramfenicol (Cam) vier dagen voor de LCV isolatie. Incubeer de kiemen bij 37 ° C.
- Zaad uit 1 x 10 7 D. discoideum produceren GFP-calnexin of RAW264.7 murine macrofagen in 75 cm2 weefselkweekflessen een dag voor infectie. Gebruik 10 ml HL5 medium met 20 ug / ml G418 voor D. discoideum en incubeer de amoeben bij 23 ° C. Voor RAW264.7 macrofagen gebruik 10 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FCS (hitte geïnactiveerd) en 1% glutamine en groeien de cellen bij 37 ° C en 5% CO2. Gebruik minimaal drie 75 cm 2 flessen per infectie en monster (minimaal 6 x 10 7 cellen).
- Inoculeer een nachtelijke cultuur met L. pneumophila van de CYE plaat. Neem een buis van 15 ml met 3 ml AYE mediumen 5 ug / ml Cam. Geënt met 100 ul van een bacteriële suspensie in een OD 600 nm van 0,1 oplevert. Incubeer de nacht cultuur op een overhead rotatie wiel bij 37 ° C gedurende 21-22 uur.
2. LCV Isolatie
- Verander het medium van D. discoideum cellen het antibioticum, die interfereren met de volgende infectie te verwijderen.
- Meet de OD van de nacht cultuur. Bacteriën moeten hebben bereikt piek infectiviteit in een OD 600 nm ≥ 3, hetgeen overeenkomt met 2 x 10 9 bacteriën / ml.
- Infecteren van de cellen door toevoeging van ongeveer 500 pi van de L. pneumophila 's nachts cultuur aan de cellen groeien in 10 ml HL5 medium (D. discoideum) of 10 ml RPMI 1640 (macrofagen). Dit correspondeert met een multipliciteit van infectie (MOI) 50. Vervolgens wordt de infectie gesynchroniseerd door centrifugeren van de bacteriën op de cellen bij 500 g gedurende 10 minuten. Centrifugeren gevolgddoor een incubatie van het D. discoideum cellen bij 25 ° C en RAW264.7 macrofagen bij 37 ° C en 5% CO2, respectievelijk. De infectie van 1 uur onder de centrifugatiestap.
- Na de infectie te verwijderen op de middellange en een keer wassen van de cellen aan de extracellulaire bacteriën te verwijderen. Gebruik ijskoude Int buffer voor D. discoideum en ijskoude PBS voor RAW264.7 macrofagen. Voeg 3 ml HS buffer, aangevuld met proteaseremmers (Roche) aan elke kolf en het verzamelen van de cellen met behulp van een cel schraper. Pool de overeenkomstige monsters in een 15 ml centrifugebuis.
- Voor homogenisering van het monster gebruik 3 ml kunststof Luer-Lock spuiten en de roestvrij stalen kogel homogenisator. Zorg ervoor dat u werkt op het ijs. Voordat u begint, was de bal homogenisator met gedestilleerd water, om geen schoonmaakmiddel besmetting wordt voorkomen en het met ijskoud HS buffer om zich te ontdoen van luchtbellen te spoelen. Gebruik de 8 micrometer speling bal.
- Vul de eerste 3 ml in de spuit und monteren op the homogenisator. Op het monster en weer negen keer door de homogenisator. Daarna wisselen de spuiten om besmetting met niet-gehomogeniseerde materiaal te voorkomen. Verzamel en bundelen de gehomogeniseerde monster in een buis van 15 ml en neem een 150 ul monster voor microscopische analyse. Alvorens over te gaan met een andere steekproef uit elkaar en was de bal homogenisator.
- Blok het homogenaat met 2% CS of FCS 30 minuten op een schudapparaat op ijs of op een overhead-draaiende wiel (10-20 rpm) bij 4 ° C.
- Na blokkering gebruik affiniteit-gezuiverde primaire antilichaam tegen SIDC (verdunning 1:3000) of tegen een andere bacteriële marker uitsluitend binding aan de membraan LCV. Vortex het antilichaam oplossing voordat u deze aan het homogene mengsel. Incubeer het monster gedurende 1 uur op een schudinrichting op ijs of op een overhead-draaiende wiel (10-20 rpm) bij 4 ° C.
- In de tussentijd bereiden de Histodenz verloop. Gebruik een buis van 15 ml per helling en de drie 75 cm 2 flessen van een monster. Sparst toevoegen 5,75 ml 35% Histodenz de buis en tweede wordt voorzichtig 5,75 ml 10% Histodenz oplossing op. Daarna zorgvuldig de buizen horizontaal neer gedurende 1 uur.
- Na incubatie van het homogenaat de blokkerend reagens en het primaire antilichaam, centrifuge 600 x g gedurende 15 min bij 4 ° C tot pellet het monster. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1,5 ml HS buffer. Breng de monsters een nieuwe 15 ml buis en neemt 40 ßl monster voor microscopische analyse later.
- Incubeer de pellet met het secundaire antilichaam - MACS geit anti-konijn IgG microbolletjes (verdunning 1:25) - 30 min op een schudder bij 4 ° C. In de tussentijd zet de kolommen op het MACS magnetische houder en evenwicht komen ze met 0,5 ml HS buffer.
- Vervolgens toepassen monsters aan de kolom. Verzamelen 150 pi van de doorstroming voor verdere microscopische analyse. Was de kolom driemaal met 0,5 ml HS buffer.
- Verwijder de kolommen tHij magneet en eluaat van de lichte bedrijfswagens met 0,5 ml HS buffer door onmiddellijke spuiten. Neem een 20 ui monster voor microscopische analyse. De zuivering stap voor immuno-magnetische scheiding wordt verwacht dat de opbrengst per 1 × 10 7 besmet D. discoideum cellen ongeveer 1 x 10 6 intact bedrijfsauto die ongeveer zevenvoudig zijn in het eluaat verrijkt vergeleken met de doorstroom 13.
- Zet de Histodenz gradiënt buizen terug naar een verticale positie en zorgvuldig te laden het eluaat op de top. Centrifugeer de buizen 3350 g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Na centrifugeren 1,5 ml fracties vanaf de bodem van de reageerbuis met een glazen Pasteur pipet. In totaal acht verzamelen fracties elk van de bodem van de buis. Geen zichtbare lagen worden waargenomen in de continue Histodenz gradiënt. De hoogste opbrengst bedrijfsauto wordt meestal verwacht fractie 4 bij een verhouding van 2 x 10 ~ 5 intact bedrijfsauto per 1 x 10 7fected amoeben 13. Kleine hoeveelheden bedrijfsauto ook in fracties 3 respectievelijk 5. Aldus de totale opbrengst van gezuiverd bedrijfsauto is ~ 1 x 10 6 intact bedrijfsauto per 6 x 10 7 geïnfecteerd D. discoideum cellen 13. Het herstel van bedrijfsauto kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT), en de bedrijfsauto gelijkmatig enkele uren.
3. Microscopische analyse van de verzamelde monsters
- Bereid een 24-well vlakke bodem weefselkweek plaat met poly-L-lysine beklede dekglaasjes.
- Pipetteer elke monster in het LCV zuivering en 150 ul van elke fractie in dichtheidsgradiënt 24-wells plaat. 0,5 ml buffer HS in elk putje om de hoge Histodenz concentratie te verdunnen. Daarna wordt gecentrifugeerd plaat 600 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en zet de monsters met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij KT. Na fixatie was de monsters twee keer. Onse Int voor D. discoideum en PBS RAW264.7 macrofagen.
- Monteer de monsters van GFP-calnexin uiten D. discoideum, genomen op verschillende stappen tijdens het LCV isolatie, direct op glas-dia's met behulp van bijvoorbeeld Vectashield.
- Incubeer de monsters van RAW264.7 macrofagen, genomen op verschillende stappen tijdens LCV isolatie met blokkeeroplossing (1% BSA in PBS) gedurende 10 min bij KT. Gebruik een anti-SIDC primaire antilichaam aan de lichte bedrijfswagens vlekken en voor 1 uur incuberen in een vochtige kamer bij RT (affiniteit-gezuiverd konijn anti-SIDC; 1:1000 in het blokkeren van buffer). Vervolgens wassen monsters drie keer met PBS. Incuberen met een secundair antilichaam (bijv. anti-konijn Cy5, 1:200 in blokkeeroplossing) gedurende 30 min in een vochtige en donkere kamer bij KT. Tot slot, was de monsters drie keer met PBS en monteer ze op glas-dia's met behulp van bijvoorbeeld Vectashield.
- Morfologie, integriteit en hoeveelheid van de lichte bedrijfsvoertuigen geïsoleerd van GFP-calnexin uiten D. discoideum of RAW264.7 macrofagen worden geanalyseerd door een fluorescentiemicroscoop met de passende filters.
4. Representatieve resultaten
De kwaliteit en opbrengst van het LCV zuivering van immuno-affiniteit scheiding en dichtheid gradiënt centrifugatie kunnen worden gevolgd door fluorescentiemicroscopie (Fig. 1). Een overzicht van de monsters verzameld in het LCV isolatie van D. discoideu m of macrofagen wordt (Fig. 2). Het homogenaat van L. pneumophila geïnfecteerde fagocyten toont intact lichte bedrijfswagens, maar ook veel celresten en extracellulaire bacteriën. Na het pelleteren het monster, het beeld is vergelijkbaar met de homogenaat, soms een beetje dichter. Sinds intact lichte bedrijfswagens moet vasthouden aan de kolom, de flow-through bevat voornamelijk extracellulaire bacteriën en celresten. Na het elueren van het monster uit de kolom, het eluaat bevat intact lichte bedrijfswagens in grote hoeveelheden. In onze handen, de LCV purificati op lijkt meer effectief D. discoideum dan macrofagen. In D. discoideum de ziekteverwekker vacuolen verschijnen ronder en de opbrengst van geïsoleerde lichte bedrijfswagens is meer dan 10 keer hoger in vergelijking met macrofagen (afb. 3). In intacte macrofagen LVCs gekleurd met verschillende antilichamen verschijnen ook meer een onregelmatige vorm.
Figuur 1. Schematisch overzicht van LCV isolatie. A) Isolatie van lichte bedrijfsvoertuigen door immuno-magnetische scheiding met behulp van een affiniteit-gezuiverd antilichaam tegen de bacteriële effector eiwit SIDC, het lokaliseren van uitsluitend aan de LCV membraan. Een secundaire MACS micro kraal gekoppelde antilichaam en een magneet worden gebruikt voor het isoleren van lichte bedrijfswagens celresten. B) Na immuno-magnetische scheiding bedrijfsauto verder gezuiverd door Histodenz dichtheid gradiënt centrifugatie. Lichte bedrijfswagens zijn verrijkt in fractie 4.
upload/4118/4118fig2.jpg "/>
Figuur 2. Monsters die afgenomen worden tijdens de LCV zuivering. Beelden uit de homogenaat, pellet, doorstroom en eluaat van D. discoideum of macrofagen zijn afgebeeld. De monsters tonen L. pneumophila produceren DsRed-Express (rood) in D. discoideum produceren GFP-calnexin signaal (groen, bovenste paneel) of macrofagen gekleurd met een anti-SIDC antilichaam (cyaan, onderste paneel). Bars, 10 pm.
Figuur 3. Gezuiverd lichte bedrijfswagens van D. discoideum of macrofagen. De monsters vertonen fractie 4 na Histodenz dichtheid gradiënt centrifugatie L. pneumophila produceren DsRed-Express (rood) in (A) D. discoideum produceren GFP-calnexin signaal (groen) of (B) in macrofagen gekleurd met een anti-SIDC antilichaam (cyaan). Bars, 10 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In tegenstelling tot eerder gepubliceerde werkwijzen wordt dit protocol op twee stappen, eerst de scheiding van bedrijfsauto door een immuno-magnetische benadering, en anderzijds de zuivering van bedrijfsauto door dichtheid gradiënt centrifugatie. De LCV isolatie kan worden gevolgd door fluorescentiemicroscopie bij een fluorescent gelabelde bacteriën en GFP-cellen of antilichamen kleuring gebruikt. Het protocol beschreven is een eenvoudige ongecompliceerde methode waardoor de verrijking van bedrijfsauto met een hoge zuiverheid. Belangrijk is de proteaseremmer in het homogeniseren buffer nodig RAW264.7 macrofagen, maar optioneel voor D. discoideum 13.
In principe kan het protocol die op andere pathogenen of gastheercellen, zolang specifieke selectief lokaliseren marker aanwezig is, die nodig is voor de scheidingstrap. Idealiter de verschillende marker van bacteriële oorsprong, getransporteerd naar de vacuole membraan, eennd selectief lokaliseren daar. Gericht op een gastheercel marker te verwachten resultaten in de ongewenste co-zuivering van de ziekteverwekker vacuole met andere gastheercel compartimenten.
Zodra een kenmerkende marker van het pathogeen vacuole geïdentificeerd een geschikte polyklonaal of monoklonaal antilichaam te worden verhoogd. Voor elke primair antilichaam concentratie en de blokkerend reagens moet worden geoptimaliseerd en blokkeert reagentia dan FCS kan beter (bijv. BSA, de-lipidated melk andere commercieel verkrijgbare reagentia blokkeren).
Een ander kritisch punt is de besmettelijkheid van de ziekteverwekker. De bacterie gebruikt voor infectie dienen te worden in hun meest besmettelijke fase. L. pneumophila, bijvoorbeeld moet worden gekweekt de post-exponential/early stationaire groeifase in vloeibare kweek. Onder deze omstandigheden zijn de bacteriën ook morfologisch uniform (~ 2 x 0,5 urn), in tegenstelling tot bacteriën gekweekt op CYE agarplaten. Bovendien antibiotics eventueel in het celkweekmedium moet worden verwijderd voordat infectie laag infectiviteit en schade aan de bacteriën te vermijden. Een negatief effect op de opname efficiency te voorkomen moet de fagocyten hebben bereikt confluentie van ongeveer 80% (ten) op het tijdstip van infectie. En hoewel een incubatietijd van 1 uur is de standaard infectie tijd L. pneumophila, waardoor een vrij homogeen en robuust bevolking van lichte bedrijfsvoertuigen, kunnen andere tijdstippen worden gekozen voor proteomics of biochemische studies over LCV vorming van 13.
Wanneer de bovenstaande werkwijze is opgesteld voor een bepaalde pathogenen gastheercel paar is het ook mogelijk om te testen bacteriële mutante stammen en / of verschillende gastheercellen, zoals D. discoideum gedefinieerd deletiemutanten. In het algemeen kan pathogeen vacuoles gezuiverd met dit protocol worden geanalyseerd door verschillende methoden, zoals microscopie (fluorescentie en elektronenmicroscoop), biochemische analyses (Western blot), zoals well als proteomics en lipidomics. Voor deze laatste methoden, is het raadzaam om te coördineren met de persoon die verantwoordelijk is voor het proteomics / lipidomics de analyse van de buffer voorwaarden, monster bedragen en de verdere verwerking van gezuiverd pathogeen vacuolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Onderzoek in ons laboratorium werd ondersteund door het Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians Universiteit van München, het Duitse Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medische Infection Genomics"-initiatief ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
