Summary
Cet article décrit une méthode pour l'isolement et la purification de intacts
Abstract
Le pathogène opportuniste Legionella pneumophila est une bactérie résistante aux amibes, qui reproduit également dans les macrophages alvéolaires causant ainsi la pneumonie sévère "la maladie du légionnaire" 1. Dans les phagocytes protozoaires et les mammifères, L. pneumophila emploie un mécanisme conservé pour former un particulier, la réplication permissive compartiment, la "Legionella contenant vacuole" (LCV). La formation exige que le LCV bactérienne Icm / Dot système de sécrétion de type IV (T4SS), qui translocation jusqu'à 275 "effecteurs" protéines dans les cellules hôtes. Les effecteurs de manipuler protéines de l'hôte ainsi que des lipides et de communiquer avec sécrétoire, organites endosomes et mitochondrial 2-4.
La formation de véhicules utilitaires légers représente un processus complexe, robuste et redondant, ce qui est difficile à saisir d'une manière réductionniste. Une approche intégrative est nécessaire pour complètement comprendre la formation des LCV, y compris une analyse globale de la trajectoireles interactions de facteurs fibrinogène-hôtes et de leurs dynamiques temporelles et spatiales. Comme une première étape vers cet objectif, véhicules utilitaires intactes sont purifiés et analysés par la protéomique et la lipidomique.
La composition et la formation de micro-organismes pathogènes contenant des vacuoles a été étudié par analyse protéomique par chromatographie en phase liquide ou 2-D électrophorèse sur gel couplée à la spectrométrie de masse. Vacuoles isolées soit de la discoideum sol social amibe Dictyostelium ou phagocytes de mammifères nourrissait Leishmania 5, 6 Listeria, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 ou Salmonella Legionella spp. 10. Cependant, les protocoles de purification utilisées dans ces études sont longues et fastidieuse, car elles nécessitent par exemple la microscopie électronique pour analyser la morphologie des LCV, l'intégrité et la pureté. En outre, ces protocoles ne pas exploiter les caractéristiques spécifiques de la vacuole pathogène pour enenrichissement par.
La méthode présentée ici permet de surmonter ces limitations en utilisant D. discoideum production d'un marqueur fluorescent TR et en ciblant la protéine bactérienne SIDC effecteur, qui sélectivement ancres à la membrane par TR se lier à la phosphatidylinositol-4-phosphate (PtdIns (4) P) 3,11. VU sont enrichis dans une première étape par immuno-magnétique de séparation en utilisant un anticorps purifié par affinité primaire contre SIDC et un anticorps secondaire couplé à des billes magnétiques, suivie d'une deuxième étape d'une centrifugation en gradient de densité classique Histodenz 12,13 (fig. 1) .
Une étude du protéome de véhicules utilitaires légers isolés de D. discoideum a révélé plus de 560 protéines de la cellule hôte, y compris les protéines associées à des vésicules phagocytaires, les mitochondries, ER et appareil de Golgi, ainsi que plusieurs GTPases qui n'ont pas été impliqués dans la formation avant le 13 LCV. VU enrichi et purifié avec leprotocole décrit ici peut être encore analysés par microscopie (immunofluorescence, microscopie électronique), des méthodes biochimiques (Western blot) et des approches protéomiques ou lipodimique.
Protocol
1. Préparatifs pour l'isolement LCV
- Streak à Legionella pneumophila produire DsRed-Express 13,14 à partir de stocks de glycérol sur gélose CYE avec 5 pg / ml de chloramphenicol (Cam) quatre jours avant l'isolement LCV. Incuber les bactéries à 37 ° C.
- Semences à 1 x 10 7 D. discoideum produire GFP-calnexine ou RAW264.7 macrophages murins dans 75 cm de culture tissulaire 2 flacons une infection jour avant. Utilisez 10 ml HL5 moyenne avec 20 pg / ml G418 pour D. discoideum et incuber les amibes à 23 ° C. Pour utiliser les macrophages RAW264.7 10 ml du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FCS (inactivé par la chaleur) et de la glutamine à 1%, et la croissance des cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. Utilisez au moins trois 75 cm 2 flacons par l'infection et l'échantillon (minimum 6 x 10 7 cellules).
- Inoculer une culture de nuit avec L. pneumophila de la plaque de CYE. Prenez un tube à essai 15 ml avec 3 ml AYE moyenneset 5 pg / ml de came. Inoculer avec 100 ul d'une suspension bactérienne pour obtenir une 600nm OD de 0,1. Incuber la culture de la nuit sur une roue de rotation tête à 37 ° C pendant 21-22 h.
2. LCV isolement
- Changer le support de D. cellules discoideum pour enlever l'antibiotique, ce qui nuirait à la suite d'une infection.
- Mesurer la DO de la culture de la nuit. Bactéries devrait avoir atteint leur infectivité pic à 600 nm une densité optique de ≥ 3, qui correspond à 2 x 10 9 bactéries par ml.
- Infecter les cellules en ajoutant environ 500 pi de la L. pneumophila culture d'une nuit aux cellules en croissance dans 10 ml HL5 moyennes (D. discoideum) ou 10 ml de RPMI 1640 (macrophages). Cela correspond à une multiplicité d'infection (MOI) de 50. Par la suite, l'infection est synchronisé par centrifugation des bactéries sur les cellules à 500 g pendant 10 min. La centrifugation est suiviepar une incubation de la D. discoideum cellules à 25 ° C et les macrophages RAW264.7 à 37 ° C et 5% de CO 2, respectivement. L'infection de temps une h comprend l'étape de centrifugation.
- Après l'infection éliminer le milieu et laver les cellules une fois pour éliminer les bactéries extracellulaires. Utiliser le tampon Sorc glacée pour D. discoideum et PBS glacé pour RAW264.7 macrophages. Ajouter 3 ml de tampon HS, complétées par des inhibiteurs de la protéase (Roche) dans chaque flacon et de recueillir les cellules en utilisant un grattoir à cellules. Piscine des échantillons correspondants dans un tube à essai de 15 ml.
- Pour homogénéisation de l'échantillon de 3 mL en plastique des seringues Luer-Lock et la bille en acier inoxydable homogénéisateur. Assurez-vous que vous travaillez sur de la glace. Avant de commencer, lavez l'homogénéisateur à billes avec de l'eau distillée, afin d'éviter toute contamination du détergent et rincez avec de la glace HS tampon froid pour se débarrasser des bulles d'air. Utilisez la boule de 8 um de dédouanement.
- Remplissez le premier 3 mL dans le und seringue de le monter sur ee homogénéisateur. Appuyez sur l'échantillon avant et en arrière neuf fois à travers l'homogénéisateur. Échanger les seringues après pour éviter toute contamination avec du matériel non-homogénéisé. Recueillir et mettre en commun l'échantillon homogénéisé dans un tube à essai de 15 ml et de prendre un échantillon de 150 microlitres par analyse microscopique. Avant de procéder à un échantillon différent démontons et laver l'homogénéisateur à billes.
- Bloquer l'homogénat avec 2% de CS ou FCS pendant 30 min sur un agitateur de la glace ou sur une roue de tête de filage (10-20 min) à 4 ° C.
- Après le blocage d'utiliser un anticorps purifiés par affinité primaire contre SIDC (dilution 1:3000) ou contre tout autre marqueur bactérienne exclusivement la liaison à la membrane LCV. Vortex la solution d'anticorps avant de l'ajouter à l'homogénat. Incuber l'échantillon pendant 1 heure sur un agitateur de la glace ou sur une roue de tête de filage (10-20 min) à 4 ° C.
- Dans le même temps, préparer le gradient Histodenz. Utilisation d'un tube à essai de 15 ml par gradient et trois 75 cm 2 flacons d'un échantillon. Sapiner, ajouter 5,75 ml de Histodenz 35% sur le tube, et le second, ajouter prudemment 5,75 ml de solution Histodenz 10% sur le dessus. Ensuite posez avec soin les tubes horizontalement pendant 1 heure.
- Après une incubation de l'homogénat avec le réactif de blocage et de l'anticorps primaire, centrifuger à 600 xg pendant 15 min à 4 ° C pour obtenir un culot de l'échantillon. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1,5 ml de tampon HS. Transférer les échantillons dans un nouveau tube de 15 ml de test et de prendre un échantillon de 40 ul pour une analyse microscopique plus tard.
- Incuber le culot avec l'anticorps secondaire - MACS de chèvre anti-IgG de lapin microbilles (dilution 1:25) - pour 30 min sur un agitateur à 4 ° C. Dans le même temps, mettre les colonnes sur le support magnétique MACS et les équilibrer avec 0,5 mL de tampon HS.
- Ensuite, appliquer les échantillons à la colonne. Recueillir 150 pi de l'écoulement continu pour l'analyse microscopique ultérieure. Laver la colonne trois fois avec 0,5 mL de tampon HS.
- Supprimez les colonnes de til l'aimant et les véhicules utilitaires légers avec éluat de 0,5 mL de tampon par HS immédiate gicler. Prenez un échantillon de 20 ul pour l'analyse microscopique. L'étape de purification par immuno-séparation magnétique est prévu de céder pour 1 × 10 7 infectées D. cellules discoideum environ 1 × 10 6 véhicules utilitaires légers, qui sont intactes environ sept fois enrichis dans l'éluat par rapport à la 13 accréditives.
- Placer les tubes de gradient Histodenz revenir à une position verticale et soigneuse au chargement de l'éluat sur le dessus. Centrifuger les tubes à 3350 × g pendant 1 h à 4 ° C.
- Après centrifugation prendre fractions de 1,5 mL à partir du bas du tube à essai en utilisant une longue pipette Pasteur en verre. Recueillir total huit fractions, chacune de la partie inférieure du tube. Pas de calques visibles sont observées dans le gradient continu Histodenz. Le rendement le plus élevé de véhicules utilitaires est généralement prévu dans la fraction 4 à un ratio de ~ 2 × 10 5 véhicules utilitaires intactes par 1 × 10 7 àinfectés amibes 13. Des quantités mineures de véhicules utilitaires sont également présents dans les fractions 3 et 5, respectivement. Ainsi, le rendement global de véhicules utilitaires légers purifiés est d'environ 1 × 10 6 véhicules utilitaires intactes par 6 × 10 7 infectées D. cellules discoideum 13. La récupération de véhicules utilitaires peuvent être réalisées à température ambiante (RT), et les véhicules utilitaires semblent stables pendant plusieurs heures.
3. Analyse microscopique des échantillons prélevés
- Préparer un 24 bien à fond plat plaque de culture tissulaire avec de la poly-L-lysine lamelles recouvertes.
- Introduire à la pipette à chaque échantillon prélevé lors de la purification et 150 LCV ul de chaque fraction de gradient de densité dans la plaque de 24 puits. Ajouter 0,5 mL de tampon HS à chaque puits pour diluer la concentration élevée Histodenz. Ensuite, centrifuger la plaque à 600 × g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez délicatement le surnageant et fixer les échantillons avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant 20 min à température ambiante. Après fixation laver les échantillons à deux reprises. Nouse Sorc pour D. discoideum et PBS pour RAW264.7 macrophages.
- Montez les échantillons provenant de la GFP-calnexine exprimant D. discoideum, prises à différentes étapes lors de l'isolement LCV, directement sur verre diapositives à l'aide Vectashield par exemple.
- Incuber les échantillons à partir des macrophages, des prises RAW264.7 à différentes étapes lors de l'isolement LCV, avec une solution de blocage (1% de BSA dans du PBS) pendant 10 min à température ambiante. Utilisez un anticorps anti-SIDC primaire pour colorer les véhicules utilitaires et incuber pendant 1h dans une chambre humide à température ambiante (purifiée par affinité de lapin anti-SIDC; 1:1000 dans le tampon de blocage). Par la suite, se laver les échantillons trois fois avec du PBS. Incuber avec un anticorps secondaire (par exemple anti-lapin Cy5; 1:200 dans une solution de blocage) pendant 30 min dans une chambre humide et sombre à la température ambiante. Enfin, se laver les échantillons trois fois avec du PBS et les monter sur des diapositives à l'aide de verre par exemple Vectashield.
- Morphologie, l'intégrité et la quantité des véhicules utilitaires légers isolés à partir de la GFP-calnexine exprimer D. DIScoideum ou de macrophages RAW264.7 sont analysés par un microscope à fluorescence équipé des filtres adéquats.
4. Les résultats représentatifs
La qualité et le rendement de la purification par immuno-TR affinité de séparation et de centrifugation en gradient de densité peut être suivie par microscopie de fluorescence (fig. 1). Un aperçu des échantillons prélevés au cours de l'isolement LCV de D. discoideu m ou des macrophages est montré (Fig. 2). L'homogénat de L. pneumophila-infectés par le phagocytes montre VU intactes, mais aussi beaucoup de débris cellulaires et les bactéries extracellulaires. Après la granulation de l'échantillon, l'image est similaire à l'homogénat, parfois un peu plus dense. Depuis VU intactes devrait s'en tenir à la colonne, le flux continu contient principalement des bactéries extracellulaires et les débris cellulaires. Après élution de l'échantillon de la colonne, l'éluat contient VU intactes en grandes quantités. Dans nos mains, le LCV Purificati sur qui semble être plus efficace pour D. discoideum que pour les macrophages. Dans D. discoideum les vacuoles des agents pathogènes apparaissent plus rond et le rendement des véhicules utilitaires isolées de plus de 10 fois plus élevé comparativement à macrophages (Fig. 3). Dans les macrophages intactes PFV colorées avec des anticorps différents semblent également plus de forme irrégulière.
Figure 1. Vue d'ensemble schématique de l'isolement LCV. A) L'isolement des véhicules utilitaires par immuno-séparation magnétique en utilisant un anticorps purifiés par affinité contre le SIDC protéine effectrice bactérienne, la localisation exclusivement à la membrane LCV. Un MACS secondaire micro-billes couplé anticorps et un aimant sont utilisés pour isoler véhicules utilitaires à partir des débris cellulaires. B) Après véhicules utilitaires de séparation immuno-magnétique sont en outre purifié par centrifugation Histodenz gradient de densité. VU sont enrichis dans la fraction 4.
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Les échantillons Figure 2. Recueillies lors de la purification LCV. Images de homogénat, granulés, en écoulement continu et éluat de D. discoideum ou les macrophages sont représentés. Les échantillons montrent L. pneumophila produire DsRed-Express (en rouge) dans D. discoideum produire GFP-calnexine signal (vert, panneau supérieur) ou dans les macrophages colorées avec un anticorps anti-SIDC (cyan, panneau inférieur). Bars, 10 um.
Figure 3. Purifiée véhicules utilitaires à partir de D. discoideum ou les macrophages. Les échantillons montrent fraction correspondant à 4 après centrifugation Histodenz gradient de densité de L. pneumophila produire DsRed-Express (en rouge) dans (A) D. discoideum produire GFP-calnexine signal (vert) ou (B) dans les macrophages colorées avec un anticorps anti-SIDC (cyan). Bars, 10 um.
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Discussion
Contrairement aux méthodes déjà publiées, ce protocole est basé sur deux étapes, d'abord la séparation des véhicules utilitaires par une approche immuno-magnétique, et la seconde, la purification de véhicules utilitaires par centrifugation en gradient de densité. L'isolement LCV peut être facilement suivie par microscopie à fluorescence, soit quand les bactéries marquées par fluorescence et GFP-cellules productrices ou coloration anticorps est utilisé. Le protocole décrit ici est un simple, straight-forward méthode, qui se traduit par l'enrichissement de véhicules utilitaires légers avec une grande pureté. Surtout, l'inhibiteur de la protéase dans le tampon d'homogénéisation est nécessaire pour RAW264.7 macrophages, mais facultatif pour les D. discoideum 13.
En principe, le protocole peut être adoptée pour d'autres agents pathogènes ou des cellules hôtes, aussi longtemps que spécifique, un marqueur de manière sélective la localisation est présent, ce qui est nécessaire pour l'étape de séparation. Idéalement, le marqueur distincte est d'origine bactérienne, transportés à la membrane de la vacuole, unee sélectivement localiser il. Cibler un des résultats de la cellule hôte de marqueurs susceptibles de l'indésirable co-purification de la vacuole pathogène avec d'autres compartiments de la cellule hôte.
Une fois un marqueur distinctif de la vacuole pathogène est identifié, un anticorps monoclonal ou polyclonal approprié doit être soulevée. Pour chaque anticorps primaire de la concentration et le réactif de blocage doit être optimisé, comme le blocage des réactifs autres que FCS pourrait être plus approprié (par exemple, BSA, de-lipidée lait, d'autres réactifs disponibles dans le commerce de blocage).
Un autre point critique est l'infectiosité de l'agent pathogène. Les bactéries utilisées pour l'infection doivent être dans leur stade le plus infectieux. L. pneumophila, par exemple, a besoin d'être cultivées à la phase de croissance stationnaire post-exponential/early en culture liquide. Dans ces conditions, les bactéries sont aussi morphologiquement uniforme (~ 2 x 0,5 um), par opposition à des bactéries cultivées sur gélose CYE. En outre, antibiotics éventuellement utilisé dans le milieu de culture cellulaire doit être enlevé avant d'une infection pour éviter l'infectiosité faible et mal à la bactérie. Pour éviter un effet négatif sur l'efficacité d'absorption, les phagocytes devrait avoir atteint un confluence d'environ 80% (pas plus) au moment de l'infection. Enfin, même si une période d'incubation de 1 h est le temps d'infection standard pour L. pneumophila, ce qui donne une population assez homogène et solide de véhicules utilitaires, d'autres moments peuvent être choisis pour les études protéomiques ou biochimiques sur la formation LCV 13.
Une fois que la méthode ci-dessus est établi pour une paire de cellules pathogène-hôte donné, il est également possible de tester les souches bactériennes mutantes et / ou des cellules hôtes différentes, y compris D. discoideum défini mutants de délétion. En général, les vacuoles des agents pathogènes purifiés avec ce protocole peut être analysé par différentes méthodes, y compris la microscopie (microscopie par fluorescence et électronique), des dosages biochimiques (Western blot), comme nous l'avonsll en protéomique et la lipidomique. Pour les dernières méthodes, il est conseillé de se coordonner avec la personne en charge de la protéomique ou d'analyse lipidomique les conditions de tampon, les montants des échantillons et de traitement en aval de vacuoles purifiées pathogènes.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Recherche dans notre laboratoire a été soutenu par l'Institut Max von Pettenkofer, Ludwig-Maximilians-Universität de Munich, de la recherche allemande (DFG, HI 1511/3-1) et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) «Génomique des infections médicales" initiative ( 0315834C).
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