Summary
Denna artikel beskriver ett förfarande för isolering och rening av intakt
Abstract
Den opportunistiska patogener Legionella pneumophila är en amöba-resistent bakterie, som också replikerar i alveolära makrofager vilket gör att svår lunginflammation "legionärssjukan" 1. I protozoiska och däggdjur fagocyter, L. pneumophila utnyttjar en konserverad mekanism för att bilda en specifik, replikationsdefekta tillåtande fack, den "Legionella-innehållande vakuolen" (LCV). Lastfordonets bildning kräver bakteriella ICM / Dot typ IV sekretionssystem (T4SS), som translokerar så många som 275 "effektor"-proteiner i värdceller. Effektorerna manipulera värdproteiner samt lipider och kommunicera med sekretoriska, endosomala och mitokondriell organeller 2-4.
Bildningen av lätta nyttofordon representerar en komplex, robust och redundanta process, som är svår att få grepp på en reduktionistiskt sätt. En integrerad strategi behövs för att fullständigt förstå LCV bildning, inklusive en global analys av vägenogen-värd faktor interaktioner och deras temporala och spatiala dynamik. Som ett första steg mot detta mål är intakta lätta nyttofordon renas och analyseras av proteomik och lipidomics.
Kompositionen och bildning av patogen-innehållande vakuoler har undersökts av proteomikanalys användning av vätskekromatografi eller 2-D gelelektroföres kopplad till masspektrometri. Vakuoler isolerade från antingen den sociala jorden amöban Dictyostelium discoideum eller däggdjur fagocyter hyste Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, Salmonella 9 eller Legionella spp. 10. De reningsprotokoll användes i dessa studier är tidskrävande och omständlig, eftersom de kräver t.ex. elektronmikroskop för att analysera LCV morfologi, integritet och renhet. Dessutom inte utnyttjar dessa protokoll inte särdrag patogenen vakuolen För ENrichment.
Metoden som presenteras här övervinner dessa begränsningar genom att använda D. discoideum producera en fluorescerande markör lastfordonets och genom att rikta den bakteriella effektorprotein SidC, som selektivt förankra till lastfordonets membranet genom bindning till fosfatidylinositol 4-fosfat (PtdIns (4) P) 3,11. Lätta nyttofordon är anrikade i ett första steg genom immuno-magnetisk separation med användning av en affinitets-renad primär antikropp mot SidC och en sekundär antikropp kopplad till magnetiska pärlor, följt i ett andra steg genom en klassisk Histodenz densitetsgradientcentrifugering 12,13 (fig. 1) .
En proteomanalys studie av isolerade lätta nyttofordon från D. discoideum visade mer än 560 värdcellproteiner, inklusive proteiner i samband med fagocytiska blåsor, mitokondrier, ER och Golgi, liksom flera GTPases, som inte varit inblandade i LCV formation före den 13. Lätta nyttofordon berikad och renades medprotokoll som beskrivs här kan vidare analyseras med mikroskopi (immunofluorescens, elektronmikroskopi), biokemiska metoder (Western blot) och proteomik eller lipidomic metoder.
Protocol
1. Förberedelser för LCV Isolering
- Streak ut Legionella pneumophila producera DsRed-Express 13,14 från glycerol bestånd CYE agarplattor med 5 ng / ml kloramfenikol (Cam) fyra dagar innan LCV isolering. Inkubera bakterierna vid 37 ° C.
- Seed ut 1 x 10 7 D. discoideum producerar GFP-kalnexin eller RAW264.7 murina makrofager i 75 cm 2 vävnadsodlingsflaskor en dag tidigare infektion. Använda 10 ml HL5 medium med 20 pg / ml G418 för D. discoideum och inkubera amöborna vid 23 ° C. För RAW264.7 makrofager använda 10 ml RPMI 1640-medium kompletterat med 10% FCS (värmeinaktiverat) och 1% glutamin och odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2. Använd minst tre 75 cm 2 kolvar per infektion och prov (minst 6 x 10 7 celler).
- Inokulera en odling över natt med L. pneumophila från CYE plattan. Ta en 15 ml provrör med 3 ml AYE medietoch 5 pg / ml Cam. Inokulera 100 | il av en bakteriesuspension till att ge en OD 600 nm av 0,1. Inkubera över natt-kulturen på en överliggande rotation hjul vid 37 ° C under 21-22 timmar.
2. LCV Isolering
- Ändra det medium i D. discoideum-celler för att avlägsna antibiotika, som skulle interferera med följande infektion.
- Mäta OD-värdet för odling över natten. Bakterier bör ha nått sin topp smittsamhet vid ett OD 600 nm på ≥ 3, vilket motsvarar 2 x 10 9 bakterier / ml.
- Infektera cellerna genom tillsats av approximativt 500 | il av L. pneumophila övernattskultur av de celler som växer i 10 ml HL5 medium (D. discoideum) eller 10 ml RPMI 1640 (makrofager). Detta motsvarar en multiplicitet av infektion (MOI) av 50. Därefter infektion synkroniserad genom centrifugering av bakterierna på cellerna vid 500 x g under 10 minuter. Centrifugering följtgenom en inkubation av D. discoideum-celler vid 25 ° C och de RAW264.7 makrofager vid 37 ° C och 5% CO2, respektive. Infektionen tid av 1 timme innefattar centrifugeringssteget.
- Efter infektion avlägsna mediet och tvätta cellerna en gång för att avlägsna extracellulära bakterier. Använd iskall sorc buffert för D. discoideum och iskall PBS för RAW264.7 makrofager. Tillsätt 3 ml HS-buffert, som kompletterats med proteas inhibitorer (Roche) till varje kolv och samla upp cellerna genom användning av en cellskrapa. Pool motsvarande sampel i en 15 ml provrör.
- För homogenisering av 3 prov bruk ml plast Luer-lock-sprutor och kula av rostfritt stål homogenisator. Se till att du arbetar på is. Före start, tvätta kulan homogenisator med destillerat vatten, för att undvika kontaminering detergent och skölj den med iskall HS-buffert för att bli av luftbubblor. Använd 8 ball um clearance.
- Fyll första 3 ml i sprutan und montera den på the-homogenisator. Tryck på provet fram och tillbaka nio gånger genom homogenisatorn. Byta sprutor efteråt för att undvika kontaminering med icke-homogeniserade materialet. Samla in och sammanställa homogeniserade provet i en 15 ml provrör och ta en 150 ^ prov för mikroskopisk analys. Innan en annan prov demontera och tvätta bollen homogenisatorn.
- Blockera homogenatet med 2% CS-eller FCS under 30 min på en skakapparat på is eller vid en överliggande-spinnhjulet (10-20 rpm) vid 4 ° C.
- Efter blockering använda en affinitets-renad primär antikropp mot SidC (spädning 1:3000) eller mot någon annan bakteriell markör uteslutande bindning till lastfordonets membranet. Vortex antikroppen lösningen innan du lägger den till homogenatet. Inkubera provet under 1 h på en skakapparat på is eller vid en överliggande-spinnhjulet (10-20 rpm) vid 4 ° C.
- Under tiden förbereder Histodenz gradienten. Använda en 15 ml provrör per gradient och tre 75 cm 2 kolvar med ett prov. Granm, tillsätt 5,75 ml av 35% Histodenz till röret, och den andra, tillsätt försiktigt 5,75 ml av 10% Histodenz lösning ovanpå. Därefter noggrant lägga rören ner horisontellt under 1 timme.
- Efter inkubation av homogenatet med den blockerande reagens och den primära antikroppen, centrifugera vid 600 x g under 15 min vid 4 ° C för att pelletera provet. Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1,5 ml HS-buffert. Överföra proven till en färsk 15 ml provrör och ta en 40 | il prov för mikroskopisk analys senare.
- Inkubera pelleten med den sekundära antikroppen - MACS get anti-kanin IgG mikro-pärlor (spädning 1:25) - under 30 min på en skakanordning vid 4 ° C. Under tiden satte kolumnerna på MACS magnetiska hållaren och jämvikt dem med 0,5 ml HS buffert.
- Därefter gäller proverna till kolumnen. Samla 150 | il av genomflödet för efterföljande mikroskopisk analys. Tvätta kolonnen tre gånger med 0,5 ml HS-buffert.
- Ta bort kolumnerna från than magnet och eluat de lätta nyttofordon med 0,5 ml HS buffert genom omedelbar spruta. Ta en 20 ^ prov för mikroskopisk analys. Reningen steg immuno-magnetisk separation förväntas ge per 1 x 10 7 smittade D. discoideum-celler ungefär 1 x 10 6 intakta lätta nyttofordon, som ungefär är sjufaldiga anrikade i eluatet jämfört med genomströmmande 13.
- Sätt Histodenz gradient rören tillbaka till ett vertikalt läge och noggrant ladda eluatet ovanpå. Centrifugera rören vid 3350 x g under 1 h vid 4 ° C.
- Efter centrifugering ta 1,5 ml fraktioner start från botten av provröret med användning av en lång Pasteurpipett av glas. Helt samla åtta fraktioner, som vardera från botten av röret. Inga synliga lager observeras i den kontinuerliga Histodenz gradienten. Den högsta avkastningen av lätta nyttofordon vanligen förväntas i fraktion 4 vid ett förhållande av ca 2 × 10 5 intakta lätta nyttofordon per 1 × 10 7 ikas amöbor 13. Mindre mängder av lätta nyttofordon är också närvarande i fraktionerna 3 och 5, respektive. Sålunda är det totala utbytet av renade lätta nyttofordon ~ 1 x 10 6 intakta lätta nyttofordon per 6 x 10 7 infekterades D. discoideum-celler 13. Återvinning av lätta nyttofordon kan utföras vid rumstemperatur (RT), och de lätta nyttofordon visas stabil i flera timmar.
3. Mikroskopisk analys av de uppsamlade proven
- Framställ en 24-brunnars flatbottnad platta vävnadskultur med poly-L-lysin-belagda täckglas.
- Pipettera varje prov taget vid lastfordonets rening plus 150 | il av varje densitetsgradient fraktion i en 24-brunnsplatta. Tillsätt 0,5 ml HS-buffert till varje brunn för att späda den höga Histodenz koncentration. Efteråt, centrifugera plattan vid 600 x g under 10 min vid 4 ° C. Försiktigt avlägsna supernatanten och fixera proverna med 4% paraformaldehyd (PFA) under 20 min vid RT. Efter fixering tvättas proven två gånger. Osse Sorc för D. discoideum och PBS under RAW264.7 makrofager.
- Montera proverna från GFP-kalnexin uttrycker D. discoideum, tagna vid olika steg under LCV isolering direkt på glas-bilder med hjälp av t.ex. Vectashield.
- Inkubera proverna från RAW264.7 makrofager, tagna vid olika steg under lastfordonets isolering, med blockeringslösning (1% BSA i PBS) under 10 min vid rumstemperatur. Använda en anti-SidC primära antikroppen för att färga de lätta nyttofordon och inkubera under 1 h i en våt kammare vid RT (affinitetsrenat kanin-anti-SidC; 1:1000 i blockerande buffert). Därefter tvättas proverna tre gånger med PBS. Inkubera med en sekundär antikropp (t.ex. anti-kanin Cy5; 1:200 i blockeringslösning) i 30 min i en våt-och mörk kammare vid RT. Slutligen, tvätta proverna tre gånger med PBS och montera dem på glas-bilder med hjälp av t.ex. Vectashield.
- Morfologi, integritet och mängden av de lätta nyttofordon som isolerats från GFP-kalnexin uttrycker D. DIScoideum eller från RAW264.7 makrofager analyseras genom ett fluorescensmikroskop utrustat med lämpliga filter.
4. Representativa resultat
Kvaliteten och utbytet av lastfordonets rening genom immuno-affinitets-separation och densitetsgradientcentrifugering kan följas genom fluorescensmikroskopi (Fig. 1). En översikt av prover som samlats in under lastfordonets isoleringen från D. discoideu m eller makrofager har visat (fig. 2). Homogenatet av L. pneumophila-infekterade fagocyter visar intakta lätta nyttofordon, men också en hel del av celldebris och extracellulära bakterier. Efter pelletering provet är bilden liknar homogenatet, ibland lite tätare. Eftersom intakta lätta nyttofordon bör hålla sig till den kolumnen innehåller genomströmning främst extracellulära bakterier och celler skräp. Efter eluering av provet från kolonnen innehåller eluat intakta lätta nyttofordon i stora mängder. I våra händer, LCV purificati den verkar vara mer effektiva för D. discoideum än för makrofager. I D. discoideum av patogener vakuoler något rundare och utbytet av isolerade lätta nyttofordon är mer än 10 gånger högre jämfört med makrofager (Fig. 3). I intakta makrofager LVCs färgats med olika antikroppar verkar också mer oregelbundet formade.
Figur 1. Schematisk översikt av LCV isolering. A) Isolering av lätta nyttofordon genom immuno-magnetisk separation med användning av en affinitets-renad antikropp mot det bakteriella effektorprotein SidC, lokalisera endast lastfordonets membranet. En sekundär MACS mikro vulst-kopplad antikropp och en magnet används för att isolera lätta nyttofordon från celldebris. B) Efter immuno-magnetiska separationsförfaranden lätta nyttofordon renas ytterligare genom Histodenz densitetsgradientcentrifugering. Lätta nyttofordon är anrikade i fraktion 4.
upload/4118/4118fig2.jpg "/>
Figur 2. Prover som samlats in under LCV rening. Bilder från homogenat, pellet genomströmning och eluatet från D. discoideum eller makrofager avbildas. Proverna visar L. pneumophila producerar DsRed-Express (röd) i D. discoideum framställning GFP-kalnexin signalen (grön, övre panelen) eller i makrofager färgades med en anti-SidC antikropp (cyan, lägre panelen). Staplar, 10 | im.
Figur 3. Renat lätta nyttofordon från D. discoideum eller makrofager. Uppvisar proverna fraktion 4 efter Histodenz densitetsgradientcentrifugering av L. pneumophila producerar DsRed-Express (röd) i (A) D. discoideum framställning GFP-kalnexin signalen (grön) eller (B) i makrofager färgades med en anti-SidC antikropp (cyan). Staplar, 10 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I motsats till tidigare publicerade metoder, är detta protokoll baserat på två steg, först genom en uppdelning av lätta nyttofordon med en immuno-magnetiska tillvägagångssättet, och den andra, rening av lätta nyttofordon genom densitetsgradientcentrifugering. Lastfordonets isolering kan enkelt följas genom fluorescensmikroskopi, när antingen fluorescensmärkta bakterier och GFP-producerande celler eller antikroppsfärgning används. Det protokoll som beskrivits här är en enkel, okomplicerad metod, som resulterar i anrikning av lätta nyttofordon med hög renhet. Viktigare är proteasinhibitom i homogeniseringsbufferten erfordras för RAW264.7 makrofager, men valfritt för D. discoideum 13.
I princip kan protokollet antas för andra patogener eller värdceller, så länge som en specifik, selektivt lokalisera markör är närvarande, som behövs för separationen steget. Idealt är distinkt markör av bakteriellt ursprung, transporteras till vakuolen membranet, ennd lokalisera selektivt där. Målsökande en värdcell markörgener som kan resulterar i den oönskade samrening av patogenen vakuolen med andra fack värdcellsystemen.
Gång en distinkt markering av patogenen vakuolen identifieras, har en lämplig polyklonal eller monoklonal antikropp som skall höjas. För varje primär antikropp koncentrationen och blockeringsreagens bör optimeras, eftersom blockera andra reagens än FCS kan vara mer lämpligt (t.ex. BSA och de-lipiderade mjölk, andra kommersiellt tillgängliga blockeringsreagens).
En annan kritisk punkt är infektiviteten av patogenen. De bakterier som används för infektion bör vara i deras mest smittsamt skede. L. pneumophila, t.ex., måste odlas på post-exponential/early stationära tillväxtfasen i flytande kultur. Under dessa betingelser är bakterierna också morfologiskt likformig (~ 2 x 0,5 ^ m) i motsats till bakterier som odlats på CYE-agar-plattor. Vidare antibiotics eventuellt används i cellodlingsmediet måste avlägsnas före en infektion för att undvika lågt smittsamhet och skada på bakterier. För att undvika en negativ effekt på upptaget effektivitetsskäl bör de fagocyterna ha nått en sammanflytning på cirka 80% (inte mer) vid tidpunkten för infektion. Slutligen, även om en inkubationstid på 1 timme är standarden infektion tid för L. pneumophila, vilket ger en ganska homogen och robust befolkning lätta nyttofordon, kan andra tidpunkter kan väljas för proteomik eller biokemiska studier på LCV formation 13.
När ovanstående metod är etablerad för en given patogen-värd cellpar är det också möjligt att testa bakteriella muterade stammar och / eller olika värdceller, inklusive D. discoideum definieras deletionsmutanter. I allmänhet kan patogen vakuoler renade med detta protokoll analyseras genom olika metoder, inklusive mikroskopi (fluorescens-och elektronmikroskopi), biokemiska analyser (Western blöt), som vill såsom proteomik och lipidomics. För de senare metoderna, är det lämpligt att samordna med den person som ansvarar för proteomics / lipidomics analys buffertfonderna villkor, belopp prov och vidarebehandling av renat patogener vakuoler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Forskning i vårt labb stöddes av Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians Universitetet München, tyska Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) och Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medical Infektion Genomics" initiativ ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
