Summary
Vi beskriver den prototypiske fremgangsmåde til fremstilling mikroskop dækglas overtrukket med fluorescerende gelatine til visualisering invadopodia-medieret matrix-nedbrydning. Computational teknikker, der anvender tilgængelig software præsenteres til kvantificering de resulterende niveauer af matrix proteolyse af enlige celler i en blandet befolkning og for flercellede grupper, som udøver hele mikroskopiske felter.
Abstract
Cellular invasion i lokale væv er en proces vigtig for udvikling og homeostase. Malregulated invasion og efterfølgende cellebevægelse er karakteristisk for mange patologiske processer, herunder inflammation, cardiovaskulær sygdom og tumorcellemetastase 1. Focalized proteolytisk nedbrydning af ekstracellulær matrix (ECM) komponenter i epitel eller endotel basalmembran er et kritisk trin til at initiere cellulær invasion. I tumorceller, har omfattende in vitro-analyse fastslået, at ECM-nedbrydning opnås ved ventrale actin-rige membran protrusive strukturer betegnet invadopodia 2,3. Invadopodia form i tæt apposition til ECM, hvor de moderat ECM nedbrydning ved virkningen af matrixmetalloproteinaser (MMP'er). Evnen af tumorceller til dannelse invadopodia korrelerer direkte med evnen til at invadere til lokal stroma og vaskulære komponenter 3.
_content "> Visualisering af invadopodia-medieret ECM nedbrydning af cellerne ved fluorescensmikroskopi under anvendelse farvestof-mærkede matrixproteiner coatet på dækglas har vist sig som den mest udbredte teknik til evaluering af graden af matrix proteolyse og cellulære invasive potentiale 4,5. Her beskriver vi en version af standard metode til frembringelse af fluorescens-mærkede dækglas under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt Oregon Green-488 gelatine konjugat. Denne metode er let skaleres til hurtigt at producere et stort antal overtrukne dækglas. Vi viser nogle af de fælles mikroskopiske artefakter, som man ofte støder på under denne procedure, og hvordan disse kan undgås. Endelig beskriver vi standardiserede fremgangsmåder under anvendelse af let tilgængelige computer software for at tillade kvantificering af mærket gelatine matrixnedbrydning medieret af individuelle celler og i hele cellepopulationer. De beskrevne fremgangsmåder giver mulighed for nøjagtigt og reproducerbart overvåge invadopodiaaktivitet, og kan også tjene som en platform for at evaluere effekten af at modulere protein-ekspression eller prøvning af anti-invasive forbindelser på ekstracellulær matrixnedbrydning i enkelt-og flercellede indstillinger.Protocol
1. Fremstilling af Oregon Green 488-gelatine-overtrukne dækglas
- Udarbejde en umærket 5% (vægt / vægt) lager gelatine / saccharoseopløsning ved tilsætning af 1,25 g gelatine og 1,25 g saccharose i PBS til et endeligt volumen på 50 ml. Varm bestanden gelatineopløsningen til 37 ° C og sikre, at den fuldstændigt smeltet før anvendelse. Lagre den endelige blanding ved 4 ° C.
- Rens 13 mm i diameter # 1 dækglas ved at placere en enkelt dækglas i hver brønd på en 24-brønds plastik vævskulturplade. Der tilsættes 500 pi af 20% salpetersyre til hver brønd og inkuberes i 30 min. Aspirer salpetersyreopløsning og vask dækglas tre gange med deioniseret vand.
- Coat dækglas med 500 ml 50 ug / ml poly-L-lysin (fremstillet fra 0,1% stamopløsning og fortyndes i deioniseret vand) til hver brønd i 20 minutter ved stuetemperatur. Aspirer opløsningen og vaskes tre gange med PBS. Poly-L-lysin belægning letter jævn belægning og binding af den overliggende laBeled gelatine.
- Der tilsættes 500 pi af 0,5% glutaraldehyd (fremstillet frisk før brug) til hver brønd og inkuberes pladerne med 24 brønde på is i 15 min. Aspirer og vaskes tre gange med kold PBS. Sørg for at fjerne alle spor af PBS før gelatineovertræk. Hold pladerne på is under alle vaske indtil gelatine tilsættes.
- Rekonstituere Oregon Green 488-konjugeret gelatine pr producentens protokol og opvarme den, og det umærkede 5% gelatine / saccharoseopløsning fra (1,1) til 37 ° C. Fortynd en del Oregon Green 488 gelatine i otte dele af umærket gelatine / saccharose (dvs., 500 pi of Oregon Green 488 gelatine i 4 ml 5% gelatine blanding). Pipette 100 gl af den fortyndede 488-gelatine-blanding (holdt ved 37 ° C) på hvert dækglas under anvendelse nok gelatine til at overtrække dækglasset uden manuel spredning (hvilket kan føre til ujævn coating dækglas som vist i figur 3B). Det er vigtigt at holde den fortyndede 488-gelatine blanding ved 37 °, C under belægningsproceduren at forhindre for tidlig størkning. Fra denne skridt fremad dækglassene bør holdes i mørke så meget som muligt for at undgå potentielle fotoblegning. Andre ECM-proteiner konjugeret til forskellige fluoroforer kan anvendes i stedet for Oregon Green 488 gelatine (se Diskussion).
- Når alle dækglas er belagt med en enkelt plade, holde 24-brønds plade i en vinkel, og fjerne overskydende gelatine fra hver brønd ved vakuum aspiration. Inkuber overtrukne dækglas i mørke i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vaskes dækglassene tre gange med PBS, hvorefter der tilsættes 500 pi af frisk fremstillet 5 mg / ml natriumborhydrid (NaBH4) i 15 minutter ved stuetemperatur for at reducere og inaktivere resterende glutaraldehyd. Natriumborhydrid er brusende, og små bobler vil være indlysende for og omkring hvert dækglas.
- Fjern NaBH4 opløsning ved vakuumaspiration med en hurtig fejende bevægelse omkring ydersiden af hver brønd. Pas på ikke at afhente nogen flydende dækglas, der blev frigjort fra bunden af vævsdyrkningsplade under NaBH 4-behandling. Fritliggende dækglas, der flyder til toppen, kan forsigtigt skubbes tilbage ned til godt bunden, men man skal være opmærksom på at undgå at beskadige protein belægning. Vask hver brønd tre gange med PBS og derefter inkuberes dækglas i 70% ethanol i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Anvendelse af steril teknik dækglasset-holdige plader overføres til en type IIA / B cellekultur laminar strømningshætte og skyl dækglas tre gange med sterilt PBS. På dette tidspunkt dækglas kan opbevares i PBS beskyttet mod lys ved 4 ° C i mindst to måneder.
- Overførsel dækglas skal anvendes til nedbrydning assays til en tom brønd i en ny 24-brønds plade ved omhyggelig fjernelse under anvendelse af en steril nål og pincet. Ækvilibrere dækglas i 1-24 timer med komplette medier er egnede til den specifikke celletype, der analyseres. Der skal udvises forsigtighed for ikkeat vende dækglasset eller ridse gelatineovertræk (se figur 3B).
2. Plettering og behandling af celler på Oregon Green 488-gelatine-overtrukne dækglas til Assay ECM Degradation
- Seed 3-5x10 4 celler over på et dækglas i hver brønd i 24-brønds plade.
- Gennemføre et tidsforløb undersøgelse for at bestemme optimale tidspunkter for invadopodia nedbrydningsaktivitet for den bestemte cellelinje / type af interesse. Mest invasive celler kræver en tid mellem 4-24 h for nedbrydning at blive synlige, selv om dette interval kan variere bredt og skal bestemmes empirisk. At synkronisere invadopodia aktivitet, kan cellerne behandles med MMP-inhibitorer (fx GM 6001) i en ønsket tidsperiode, og derefter vaske inhibitoren at tillade invadopodia aktivitet til at fortsætte (f.eks 6 se).
- Skyl dækglas tre gange med PBS, derefter fastsætte celler med 500 pi 10% pufret formalin phosphate i 15 minutter. Skylles tre gange med PBS og permeabilisere i 4 minutter med 0,4% Triton X-100 i PBS. Skylles tre gange med PBS for at fjerne Triton X-100.
- Label celler under anvendelse af en standardprotokol for immunfluorescensfarvning (se 7 for eksempel) ved co-mærkning celler med fluorescerende konjugeret phalloidin at visualisere actinfilamenter (F-actin) og for en kendt markørprotein, der lokaliseres til invadopodia (f. eks cortactin 5, TKS5 8 eller N-WASP 9). Husk at undgå anvendelse af 488-mærkede sekundære antistoffer eller GFP-mærkede proteiner, hvis anvendelse Oregon Green 488 eller FITC-mærket gelatine for at undgå interferens.
- Mount farvede dækglas over på objektglas ved forsigtigt at vende dækglasset og placere den på en dråbe af forlænge Gold antiblegemiddel eller lignende reagens.
- For at vurdere matrixnedbrydning, billed-celler i passende kanaler ved hjælp af en konventionel fluorescerende eller konfokal mikroskop. Gelatine nedbrydningvisualiseres som mørkere områder på dækglasset på grund af proteolytisk fjernelse af det fluorescerende gelatine (figur 4A). Mærkning af celler til actin og en invadopodia markørprotein tillader bekræftelse af invadopodia på steder med matrixnedbrydning i flettede billeder (figur 4A).
- Nedbrydningsaktivitet kan også monitoreres i realtid ved levende celler med fluorescens-mærkede rekombinante proteiner til at spore invadopodia dannelse og matrixnedbrydning 5,10,11.
3. Kvantificering af Fluorescerende Gelatine Nedbrydning ved måling Normalized matrixnedbrydning
Denne analyse tilvejebringer det normaliserede område matrixnedbrydning forhold til arealet af cellerne eller antallet af celler. Det er nyttigt til at analysere hele mikroskopiske synsfelter, hvor flere celler er til stede, der kollektivt er blevet behandlet med siRNA, vækstfaktorer eller terapeutiske midler. Til dette analysis, billeder, indsamlet på lavere forstørrelse er tilstrækkelige til effektivt at indhente information om populationer af celler.
- Åbn billederne i ImageJ 12. ImageJ til mikroskopi kan downloades fra http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- Kontroller skalaen information ved at vælge menupunktet "Analyze / Set skaler". Denne information vil importere automatisk med mange filformater, men kan indtastes manuelt, hvis det kræves. Korrekt skalering er nødvendig for at rapportere målinger i mikrometer i stedet for pixels.
- Vælg de relevante målinger til at spore ved at vælge "Analyser / Set Målinger." Kontroller Område og Begræns til Threshold.
- Beregn arealet af nedbrydning under anvendelse af det fluorescerende gelatine billede (figur 5A).
- Threshold billedet ("Image / Adjust / Threshold") for at indstille den øvre og nedre pixel intensitetsværdier til at vælge de områder af nedbrydning (fremhævet med rødt, figur 5B). I de efterfølgende billeder, skal du bruge knappen Set i Threshold vinduet for at indstille den samme grænse for alle billeder som et mål betyder at vælge nedbrydning område.
- I nogle tilfælde kan dækglasset ikke være fuldstændig flad, når billederne erhverves. Dette bevirker, at intensiteten af gelatinen at ændre tværs over billedet. Hvis denne variation skaber problemer, når tærskling billedet, korrigere for ujævn belysning over gelatinen ved at trække baggrunden ("Process / Fratræk Baggrund") eller ved filtrering med et båndpasfilter ("Process / FFT / båndpasfilter") eller en pseudo flatfield filter ("Process / Filtre / Pseudo Flatfield"), indtil baggrunden intensitet er ensartet.
- Måle arealet af matrixnedbrydning ("Analyser / analyse Particles"). I Analyser Particles vinduet, skal du vælge en partikelstørrelse> 0 for at fjerne støj fra than selection. Show Skitserer at identificere områder af interesse (ROI'er). Kontroller vise resultater og Opsummér at vise målinger. Hvis tegningen specifikt har skitseret alle de områder af nedbrydning (figur 5C), kopiere det samlede areal målingen i et regneark. Hvis andre genstande blev udvalgt (såsom snavs), registreres kun de områder af det pågældende ROI'er.
- Beregne celleareal med phalloidin farvede (F-actin) billede (figur 5D).
- Threshold billedet ("Image / Adjust / Threshold") for at indstille den øvre og nedre pixelintensitet værdier, således at kanterne af cellerne er valgt (fremhævet med rødt, figur 5E). I de efterfølgende billeder, skal du bruge knappen Set i Threshold vinduet for at indstille den samme grænse for alle billeder som et mål betyder at markere celleområdet.
- 10 måle arealet af cellerne ("Analyser / analyse Particles"). I Analyser PartiCles vindue, skal du vælge en partikelstørrelse> 0 for at fjerne støj fra valget. Vis Skitserer at identificere regioner til analyse (figur 5F). Kontroller vise resultater og Opsummér at vise området målinger. Kontroller ikke Medtag huller hvis der er mellemrum mellem celler i en klynge, så de ikke-valgte pixels inden for klyngen ikke vil blive medtaget i cellens areal. Vælg OK.
- Kopier Area resultater for relevant ROI'er i et regneark.
- Beregne arealet af gelatine nedbrydning pr samlede areal af celler 13.
- En alternativ fremgangsmåde ville være at rapportere inden for nedbrydning pr antal celler fra tælle kerner (figur 5G). Dette er nødvendigt, hvis manipulationer ændrer cellens området mellem forskellige forhold behandlingsgrupper. Automatisk optælling fungerer bedst, hvis kerner er godt adskilt, ensartet i intensitet og runde. Automatisk tælle nuclei ("Plugins / partikel analyse / Nucleus Counter"). Vælg mindste og største partikelstørrelse, en Threshold Metode og en Smoothing metode. Check Subtraher Baggrund, Watershed Filter, Tilføj Particles til ROI Manager og Show Summary (figur 5H).
- Hvis kerner overlapper ekstensivt eller har en uregelmæssig form eller konsistens, kan automatisk optælling ikke producere en præcis optælling (figur 5H, pile på højre). I dette tilfælde kan manuel tælling lettes ved hjælp af celletæller værktøjet ("Plugins / partikel analyse / Cell Counter"). Dette vil holde tæller som cellerne er markeret under en manuel optælling (Figur 5I).
- Kopiere antal celler (kerner) til et regneark. Beregne arealet af gelatine nedbrydning pr totale antal celler.
4. Kvantificering af Fluorescerende Gelatine Nedbrydning af de enkelte celler i en blandet cellepopulation At evaluere matrixnedbrydning følge af specifikke celler i en population bortset fra andre celler i det område (f.eks transficeret versus ikke-transficerede celler), kan fremgangsmåden i afsnit 3 modificeres til at måle arealet af nedbrydning under de enkelte celler. En yderligere fluorescerende kanal er nødvendig for at markere transficerede celler. I dette tilfælde er højere forstørrelse billeder og godt adskilte celler lettere at kvantificere.
- Kontroller skalaen information ved at vælge menupunktet "Analyze / Set skaler". Vælg de relevante målinger til at spore ved at vælge "Analyser / Set Målinger." Kontroller Område og Begræns til Threshold.
- For individuelle celler, der ikke rører, identificerer hver celle ved hjælp af F-actin billede (figur 6A). Threshold billedet (se 3.9) (figur 6B). Det er vigtigt at fastholde kanterne af cellerne, men der kan være huls indeni, der ikke indgår i tærsklen. Brug de samme intensitet værdier på tværs af billedet for at vælge cellegrænser.
- For at måle det område af cellerne ved at bruge "Analyze / Analyser Partikler." I Analyser Particles vinduet, skal du vælge en størrelse> 0 (for at fjerne støj), Vis konturer, og tjek Vis søgeresulater, Tilføj til Manager og Medtag huller (for at optage hele området inde i omrids). Vælg OK og registrere området for hver celle fra Results vinduet.
- Identificere, hvilke celler transficeres (figur 6C).
- Identificere de områder, nedbrydning ved hjælp af fluorescerende gelatine billede (figur 6D). Hvis det er nødvendigt, filtrere gelatine billedet for at udjævne baggrund intensitet (se 3,6). Threshold at vælge de områder af nedbrydning, hvilket gør sig bekendt med de tærskel-indstillingerne (Figur 6E). Ved efterfølgende billeder, kan du bruge de samme øvre og nedre intensitetsværdier (ved hjælp af Setknappen i Tærskel vindue) for en objektiv udvælgelse af områder af nedbrydning.
- Måle de områder af nedbrydning under cellerne. På den tærsklingsbehandlet fluorescerende gelatine billede, viser en oversigt over de celler ved at vælge ROI'er i ROI vinduet og vælge Mål (Figur 6F). Registrere resultaterne og beregne den normaliserede område med nedbrydning / celle eller celleområdet.
5. Repræsentative resultater
Den samlede skematiske for fremgangsmåden er vist i figur 1.. Fremgangsmåden indebærer fremstilling af dækglas og coating med fluorescens-konjugeret gelatine, udpladning af celler på den overtrukne dækglas for at tillade cellerne at nedbryde gelatine, fastsættelse og mærkning af cellerne for fluorescens mikroskopisk analyse, den fluorescerende matrix imaging at vurdere matrix integritet, og objektivt kvantificering af graden af gelatine matrixnedbrydning hjælp af computer Software.
Figur 1. Overordnet skematisk fremhæver de vigtigste skridt, der er involveret i fluorescerende gelatineovertræk, celle plating, fastsættelse og immunolabeling og evaluere matrix proteolyse.
De vigtigste proceduremæssige skridt, der er involveret i forberedelsen og coating dækglas er skitseret i figur 2.
Figur 2. Skematisk viser de enkelte trin, der er involveret i forberedelsen dækglas for gelatinematrix belægning. Trin udført i lyset (lyser pæren), på is (terninger) og i mørke (ikke-belyste pære) er tegneserie angivet. Trin udført i mørke hjælpe med at forhindre fotoblegning af de fluorescerende matricer.
Ved korrekt udført, dækglas jævnt belagt med Oregon Green 488-konjugeret gelatin, viser ensartet fluorescens, når visualiseret ved mikroskopi (figur 3A). Typiske artefakter, der kan opstå på grund af ukorrekt coating, håndtering, opbevaring og anvendelse af overtrukne dækglas vist i figur 3B.
Figur 3. Eksempler på artefakter forekommer under gelatine coated dækglas og håndtering. A. Orthogonal afbildning af en konfokal z-stakken viser den typiske farve og konsistens en Oregon Green 488-konjugeret gelatine coated dækglas fremstillet ved anvendelse af den foreskrevne protokol. Dækglas bør have en ensartet coating ~ 1-2 um tyk som vist i XZ (nederst) og yz (højre) konfokale fly B. artefakter som kan forekomme under coatingen og forarbejdning af gelatine-overtrukne dækglas omfatter:. Forkert tildækning af dækglas under belægningsprocessen grundtil dårlig blanding, manuel spredning eller delvis størkning af gelatine blanding (ujævn coating), fjernelse af det belagte matrix ved at score med nåle eller tang under håndtering (skraber), tørring af dækglasset overflade under lange opbevaringsperioder, hvilket resulterer i en "brosten "udseende (dehydratiseret) og fotoblegning af det fluorescerende gelatine overflade under billeddannelse på grund af langvarig eller høj intensitet lyseksponering (blegning). Hvid pil indikerer bleget område, der omfatter en forgyldt OSC19 hoved og hals pladecellehistologi karcinom celle. Oregon Green 488-konjugeret gelatine pseudocolored hvidt at forbedre billedkontrast. Bar, 10 um.
De resulterende tynde matrixer fremstillet under denne procedure giver en følsom måde til vurdering af evnen af cellerne til at nedbryde ECM. Figur 4 viser et eksempel på invadopodia aktivitet fra en OSC19 celle udpladet på en Oregon Green-488 konjugeret gelatine dækglasog afbildet af konventionel konfokal mikroskopi samt ved volumen-fill billedgengivelse efter tredimensionelle dekonvolution.
Fig. 4. Repræsentative eksempler på invadopodia matrixnedbrydning aktivitet. A. Visualisering af invadopodia og tilsvarende gelatinematrix proteolyse. OSC19 celler udpladet på Oregon Green 488-konjugerede gelatine dækglas i 10 timer blev fikseret og mærket med rhodamin-konjugeret phalloidin (F-actin) og anti-cortactin antistoffer (visualiseret med en Alexa Fluor 647 sekundært antistof og pseudocolored grøn). Invadopodia er tydelig fokale cytoplasmatiske koncentrationer af F-actin og cortactin der overlapper områder af gelatine clearing (mørke huller i matricen) i det sammenflettede billede. Boxed regioner, der indeholder Pilehovederne angiver individuelle invadopodia og områder af fokal matrix proteolyse som vist i det forstørrede regioner nedenfor. Bar, 10 um. B. Volumen fylde visualisering af invadopodia indtrængen i ECM. OSC19 celler udpladet og farvet som i (A) blev visuelt udført ved opnåelse af 23 successive 0,32 um optiske z-skiver i alt 7,04 um for rhodamin-konjugeret phalloidin og Oregon Green 488-konjugeret gelatine. De indfødte LSM-fil for hver kanal blev åbnet i AutoQuant X2.2 software og en 3D blind dekonvolution af hvert billedstak blev udført ved hjælp af de anbefalede indstillinger (10 iterationer, medium støj). De behandlede billeder blev gemt som TIFF-stakke, der derefter blev åbnet i NIS Elements og gengivet som et volumen visning med alpha blending. The LUTS blev indstillet, og en subvolume blev skabt for at vise en kant inde i cellen, hvor invadopodia er til stede. Dorsal-kantbillede viser invadopodia (rød, pile) indsat i den underliggende gelatine (grøn). Ventral-kantbillede viser protrusive invadopodia og områder af gelatine nedbrydning under dækglassetsom regioner af røde stede i det grønne matrix (pilespidser). Den samlede billede, der præsenteres felt er beskåret til 77 x 65 um, cellen er ~ 60 x 40 um.
Figur 5 viser nogle af de vigtige skridt til kvantificering af normaliseret gelatinematrix nedbrydning som beskrevet i trin 3 i protokollen. Denne procedure er at tillade objektiv kvantificering af gelatine nedbrydning i et helt synsfelt, og er egnet til matrixnedbrydning tilskrives mange celler i området.
Figur 5. Screen Capture billeder viser vigtige skridt i computational-assisteret kvantificering af normaliseret gelatine nedbrydning af celler i en hel mikroskopisk billede som beskrevet i protokol trin 3. Alle fluorescerende billeder er blevet konverteret til gråtoner bedre vise den røde tærskelværdiansættelse og ROI markeringer. A. Imalder af Oregon Green 488-konjugeret gelatine, der viser mørke områder ("huller"), hvor nedbrydningen har fundet sted (trin 3,4). B. tærsklingsbehandlet gelatine billede kortlægge områder nedbrydning i rød (trin 3,5). C. Tegning, der viser ROI'er målt for område af nedbrydning (trin 3.7). D. Rhodamin phalloidin-farvning af F-actin (trin 3.8). E. tærsklingsbehandlet actin billede fremhæve samlede celleareal i rødt (trin 3.9). F. Tegning celleområder, der skal måles (trin 3.10) . G. Billede af DAPI-farvede cellekerner (trin 3,13). H. Rød skitserer udstillingsresultater fra automatisk kerner optælling (trin 3,13). Den Watershed filter har potentiale til separate kerner, der rører (hvid pil). Hvis kerner overlapper hinanden meget, kan de ikke adskilles i individuelle objekter (rød pil). Hvis en kerne har en uregelmæssig form, kan den separeres i flere objekter (gul pil). I. </ Strong> Resultater fra mærkning kerner under en manuel tælling ved hjælp af celletæller værktøjet (trin 3.14).
Figur 6. viser udvalgte trin i kvantificere fluorescerende gelatine nedbrydning af individuelle celler i en blandet cellepopulation som beskrevet i protokol trin 4. Her kan matrixnedbrydning af transficerede celler analyseres inden for en blandet population af transficerede og ikke-transficerede celler.
Figur 6. Screen fange billeder af trin involveret i at kvantificere gelatine nedbrydning fra individuelle transficerede celler i en celle population. Kvantificering af en enkelt transficeret OSC19 cell overudtrykker rekombinant cortactin fusioneret til FLAG-epitopmærket er vist som et eksempel. Alle fluorescerende billeder er blevet konverteret til gråtoner bedre vise den røde tærskelværdiansættelse og gule ROI markeringer. A. B. Tegning af det samlede celle område baseret på F-actin-farvning efter påføring af Threshold og Analyze Partikler funktioner (trin 4,2-3). C. Konfokal billede af anti-FLAG immunolabeling af cellepopulationen viser en enkelt celle, der udtrykker FLAG-mærket cortactin (markeret med *) (trin 4.4). D. Billede af Oregon Green 488-konjugeret gelatine, viser mørke områder ("huller"), hvor nedbrydning har opstod (trin 4,5) E. tærsklingsbehandlet gelatine billede fremhæve mørke områder med nedbrydning i rød (trin 4,5). F. tærsklingsbehandlet gelatine billede overlejret med celle konturer fra panel B (trin 4,6). Bemærk, at kun de tærskelværdisammenlignede pixler i cellen omrids tælles i analysen. Områder med nedbrydning uden den aktuelle celle position (hvid pil) skyldes cellemigrering på tværs af gelatine over tid og ikke inkluDED i analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til at visualisere cellerne nedbryde den extracellulære matrix har bidraget til at finde de molekylære mekanismer anvendt i de tidlige trin i celleinvasion. Udviklet af Wen-Tien Chen i begyndelsen af 1980'erne 4,14,15, har coating fluorescensmærkede ekstracellulære proteiner på dækglas til efterfølgende mikroskopisk analyse vist sig som den primære metode at vurdere invadopodia funktion på en lang række celletyper. Den foreskrevne protokol viser den grundlæggende metode til fremstilling af gelatine-overtrukne dækglas, der danner en kollagen lag mindre end 2 um tyk egnet til påvisning af ekstracellulær matrixnedbrydning af celler i de fleste konventionelle fluorescerende og konfokale mikroskoper 11,16-18, svarende til hvad der er tidligere blevet beskrevet 19-21. Disse egenskaber muliggør hurtig produktion af overtrukne dækglas stand til at detektere den indledende indtræden af matrixnedbrydning. Følsomheden gives ved the resulterende tynde gelatinematrix på de underliggende hårde glasoverflade sandsynlige hjælper med til at fremme invadopodia dannelse som reaktion på den høje iboende stivhed af den samlede matrix miljøet 22. Imidlertid er disse matricer ikke velegnede til analyse af invadopodia forlængelse eller supplerende morfologisk evaluering, der er opnået ved hjælp af tykkere (30-100 um) gelatinelag med lignende metodik, overtrukne transwells eller elektronmikroskopi 20,23,24.
Vi har fundet, at præ-konjugeret fremstillet kommercielt Oregon Green 488 gelatine tillader hurtig eksperimentelle opsætning og konsistente, reproducerbare resultater. Imidlertid alkalisk borat konjugering af fluorescein isothiocyanat (FITC) til ikke-mærket gelatine er en populær og billig fremgangsmåde til fremstilling af fluorescerende gelatine konjugater 20. Fibronectin er også anvendes som en alternativ matrixprotein til mærkning og dækglas coating 4,9, og i nogle tilfælde ivestigators har anvendt mærket fibronectin lagdelt på umærkede gelatine overtrukne dækglas for at skabe tættere matricer 11,25. Andre matricer kan anvendes, afhængigt af egenskaberne af celletypen. Foruden farvestoffer i den grønne 488 nm spektret, har en lang række fluoroforer også været anvendt med manuelle koblingsmetoder til at generere dækglas med forskellig fluorescensspektre, herunder rhodamin 21,26, Alexa Fluor 350 24, 546 21, 568 5,11 , 594 27 og 647 5 farvestoffer. Sådanne konjugater er let at tilpasse til anvendelse i den foreskrevne protokol, hvilket giver fleksibilitet for anvendelse af specifikke ECM-protein-farvning kombinationer er egnede til de fleste enhver billeddannende filtersæt.
De heri beskrevne teknikker tilvejebringer de nødvendige detaljerede trin til anvendelse ImageJ at kvantificere gelatine matrixnedbrydning tilskrives individuelle celler i en heterogen population eller hele cellegrupper som offentliggjort previously 6,28. Leverandørejet software er også med held blevet anvendt til samme formål 5,25. I denne protokol, er området matrixnedbrydning normaliseret til enten det samlede areal af de celler eller det totale antal celler (kerner) på området. Generelt vil begge muligheder for normalisering give samme resultat (ELW, data ikke vist). Hvis forskellige cellelinjer med forskellige størrelser celler sammenlignes, eller hvis eksperimentel behandling får cellerne til at ændre størrelse, så kan det være mere korrekt at normalisere til celleantal. På den anden side har mange cancercellelinier en høj procentdel af mange kerneholdige celler, i hvilket tilfælde den samlede celleareal kan være en mere nøjagtig parameter for normalisering. Også, hvis kun en del af en celle indfanges i et billede (fig. 6), kan det være bedre at normalisere til celle område og ikke undervurdere nedbrydning potentiale for en individuel celle. Det er vigtigt at optimere billedanalyse til bedst passerkarakteristika og nuancer i den specifikke forsøgsopstillingen.
Til bestemmelse af celletal i en overfyldt område, er tælle kerner ofte den valgte fremgangsmåde. ImageJ har en kerne tæller plugin for automatisk tælling. En mulighed i dette værktøj er det Watershed filter. Dette filter vil hjælpe særskilt kerner, der rører ved adskillelsen dem i individuelle objekter (figur 5H, hvid pil). Imidlertid kan dette filter ikke kunne adskille kerner, der overlapper udstrakt (figur 5H, rød pil). Desuden, hvis en kerne har en uregelmæssig form og store variationer i intensitet kan filterets adskille en enkelt kerne i flere objekter (figur 5H, gul pil). Derfor er det vigtigt at prøve forskellige tærsklingsprocesparametre og udjævning metoder i dette plugin til at bestemme de bedste parametre for analyse. Hvis den automatiske optælling ikke producerer nøjagtige tal, celletæller plugin kan faci litate manuel tælling af celler eller kerner.
I tilfælde anvender transient transfektion, vil billederne ofte indeholde en blanding af celler, som udtrykker eller ikke udtrykker et protein af interesse (Figur 6). I dette scenario er det ikke altid klart, hvilke celler var ansvarlige for at skabe områder med matrixnedbrydning. Dette gælder især, hvis cellerne migrerer hen over gelatine. For at være konsekvent i analysen, er det vigtigt kun at måle de nedslidte områder direkte under hver celle. Ved tærskling at vælge de mørke områder i matrixen og ved hjælp af actin til at generere celle konturer, vil kun de beskadigede områder under cellerne kvantificeres. Denne procedure vil udelukke nedslidte områder uden for cellegrænser fra analyse (figur 6F, pil). Assayet kan kræve optimering for at vælge et tidspunkt, der tillader tilstrækkelig tid for nedbrydning før cellerne har haft mulighed for at bevæge sig.
"> Talrige fremgangsmåder er blevet udviklet til kvantificering invadopodia dannelse og funktion. Foruden matrixnedbrydning, indbefatter andre ofte rapporteres parametre bestemmelse af antallet af invadopodia per celle, procentdelen af celler, som viser invadopodia inden for en given population, og antallet af" umoden "eller" præ "ikke-nedbrydende invadopodia forhold til" modne "invadopodia stand til at nedbryde ECM'en 11,13,25,26. Fremgangsmåde (e) valg for invadopodia vurdering afhænger af særlige egenskaber ved hver celletype. for eksempel optælling af antallet af invadopodia per celle eller bestemmelse af procentdelen af celler indeholdende invadopodia er en enkel fremgangsmåde, som fungerer godt, hvis de analyserede celler indeholder blot nogle få fremtrædende invadopodia, men vanskeligere i celler, der har snesevis af invadopodia eller hvor invadopodia kan være små og vanskelig at opdage. Anvendelse nedbrydningen assayet gør det muligt at beregne procentdelen af præ-invadopodia vs. modent invadopodia i enkelte celler eller i en population ved at sammenligne det totale antal celler med invadopodia den procentdel, der er nedværdigende matrix. Hvis der er en uoverensstemmelse, hvor færre celler er nedbrydende matrix sammenlignet med celler, som viser invadopodia, kan det indikere, at disse celler danner præ-invadopodia, der var i stand til matrixnedbrydning på tidspunktet blev cellerne fikseret.Uanset hvilken metode befæstninger vælges til analyse, er det vigtigt at kvantificere de ønskede invadopodia egenskaber så objektivt som muligt. Ved afhentning billeder på mikroskopet, skal du vælge felter ved at kigge på celler (actin), snarere end den fluorescerende matrix, for at undgå bias fra fortrinsvis udvælge områder med høje niveauer af nedbrydning. Flere billeder skal erhverves for at sikre en rimelig repræsentation af cellepopulationen. Billeder bør også erhverves på et passende forstørrelse. For ensartede populationer af celler, kan lavere forstørrelseanvendes til at indsamle flere celler, så længe de områder af nedbrydning stadig kan løses. Højere forstørrelse billeder foretrækkes at måle områder under de enkelte celler og til at løse individuelle invadopodia. Når områder bliver kvantificeres, tærskling billeder baseret på intensitet er mere objektiv end manuelt at vælge det område af matrixen til at måle. I alle tilfælde skal et tilstrækkeligt antal celler fra flere uafhængige forsøg analyseres til opnåelse af statistisk relevante, reproducerbare resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af begavelse midler fra West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Vi takker Susette Mueller (Georgetown University) og Laura Kelley for tidlig rådgivning og assistance. Brugen af West Virginia University Microscopy Imaging Facility (støttet af Mary Babb Randolph Cancer Center, og NIH tilskud P20 RR16440, P30 RR032138 og P30 GM103488) er modtaget med tak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
