Summary
Wir beschreiben die prototypische Verfahren zur Herstellung Mikroskop Deckgläser mit fluoreszierenden Gelatine zur Visualisierung invadopodia-vermittelte Matrixabbau beschichtet. Rechenverfahren Verwendung verfügbarer Software für die Quantifizierung der resultierenden Ebenen der Matrix Proteolyse durch einzelne Zellen innerhalb einer Mischpopulation und für Gruppen, die vielzelligen gesamte mikroskopische Felder dargestellt.
Abstract
Cellular Invasion in lokalen Gewebe ist ein Prozess wichtig in der Entwicklung und Homöostase. Malregulated Invasion und anschließende Zellbewegung ist charakteristisch für mehrere pathologische Prozesse, einschließlich Entzündung, kardiovaskulärer Erkrankung und Tumorzellenmetastase ein. Focalized proteolytischen Abbau der extrazellulären Matrix (ECM)-Komponenten in der epithelialen oder endothelialen Basalmembran ist ein kritischer Schritt bei der Einleitung Zellinvasion. In Tumorzellen hat umfangreiche in vitro-Analyse bestimmt, dass ECM Abbau durch ventralen Aktin Membranplattformen vorstehenden Strukturen bezeichnet invadopodia 2,3 bewerkstelligt wird. Invadopodia Form in engen Apposition zu dem ECM, wo sie mäßig ECM Durchschlag durch die Wirkung von Matrixmetalloproteinasen (MMPs). Die Fähigkeit von Tumorzellen gegenüber invadopodia bilden direkt korreliert mit der Fähigkeit, sich in lokalen Stroma und assoziierten vaskulären Bauteile 3 einzudringen.
_CONTENT "> Visualisierung invadopodia-vermittelten Abbau von ECM Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Farbstoff-markierten Proteine Matrix auf Glas-Deckgläschen beschichtet wurde als die am weitesten verbreitete Technik zum Auswerten des Grades der zellulären Matrix Proteolyse und invasive Potential 4,5 entstanden. Hier beschreiben wir eine Version des Standard-Methode zur Erzeugung fluoreszenzmarkierten Glasdeckgläser Verwendung eines kommerziell erhältlichen Oregon Green 488-Gelatine-Konjugat. Dieses Verfahren ist einfach skaliert rasch bringen zahlreiche beschichtete Deckgläser. Wir zeigen einige der üblichen mikroskopischen Artefakte, die häufig auftreten Während dieses Verfahrens und wie diese vermieden werden. Schließlich haben wir standardisierten Methoden unter Verwendung leicht verfügbarer Computersoftware zur Quantifizierung von markierten Gelatinematrix Abbau durch einzelne Zellen und zellulären Populationen von gesamte vermittelt ermöglichen beschreiben. Die beschriebenen Verfahren bieten die Möglichkeit, genau und reproduzierbar zu überwachen invadopodiaAktivität, und kann auch als Plattform zur Bewertung der Wirksamkeit des Modulierens Proteinexpression oder Testen von Anti-invasiver Verbindungen auf extrazelluläre Matrix Abbau in Einzel-und mehrzellige Einstellungen dienen.Protocol
Ein. Produktion von Oregon Green 488-Gelatine beschichtete Deckgläser
- Planen eines unmarkierten 5% (w / w) stock Gelatine / Saccharose-Lösung durch Zugabe von 1,25 g Gelatine und 1,25 g Saccharose in PBS zu einem Endvolumen von 50 ml. Wärmen die Lager Gelatinelösung bis 37 ° C und sicherzustellen, dass es vor der Verwendung vollständig geschmolzen. Speichern die Endmischung bei 4 ° C.
- Reinigen 13 mm Durchmesser # 1 Deckgläschen, indem ein einzelner Deckglas in jedes Well einer 24-Well-Kunststoff Gewebekulturplatte. Add 500 ul 20% iger Salpetersäure in jede Vertiefung pipettieren und 30 min. Saugen Sie die Salpetersäure und waschen Deckgläser dreimal mit entionisiertem Wasser.
- Coat Deckgläschen mit 500 ul von 50 ug / ml Poly-L-Lysin (hergestellt aus 0,1% Stammlösung verdünnt und in entionisiertem Wasser) in jede Vertiefung für 20 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie die Lösung und dreimal mit PBS. Poly-L-Lysin-Beschichtung erleichtert gleichmäßige Beschichtung und Kleben des aufliegenden laBeled Gelatine.
- Fügen Sie 500 ul von 0,5% Glutaraldehyd (frisch zubereitet vor Gebrauch) in jede Vertiefung und inkubieren die 24-Well-Platten auf Eis für 15 min. Absaugen und dreimal mit kaltem PBS. Achten Sie darauf, um alle Spuren von PBS vor Gelatine Beschichtung zu entfernen. Halten Platten auf Eis in allen Waschungen, bis Gelatine hinzugefügt.
- Lösen Sie das Oregon Green 488-konjugierten Gelatine nach dem Protokoll des Herstellers und wärmen es und der unmarkierten 5% Gelatine / Saccharose-Lösung von (1,1) bis 37 ° C. Verdünnte einerseits Oregon Green 488 Gelatine in acht Teile von unmarkiertem Gelatine / Saccharose (dh, 500 ul Gelatine Oregon Green 488 in 4 ml 5% Gelatine-Gemisch). Je 100 ul des verdünnten 488-Gelatine-Mischung (bei 37 ° C) auf jedes Deckglas, mit genug Gelatine zu beschichten das Deckglas ohne manuelle Spreizung (das kann zu einer ungleichmäßigen Deckglas Beschichtung führen wie in 3B gezeigt). Es ist wichtig, um die verdünnte 488-Gelatinemischung bei 37 ° zu halten, C während des Beschichtungsverfahrens, um eine vorzeitige Erstarrung zu verhindern. Von diesem Schritt an die Deckgläser sollte im Dunkeln so weit wie möglich zu vermeiden, um potenzielle Photobleichen gehalten werden. Andere ECM-Proteinen, konjugiert an unterschiedliche Fluorophore können Oregon Green 488 Gelatine (siehe Diskussion) substituiert sein.
- Sobald alle Deckgläser in einer einzigen Platte beschichtet sind, halten die 24 Well-Platte unter einem Winkel und entfernt überschüssiges Gelatine aus jeder Vertiefung durch Vakuumansaugen. Inkubieren beschichtete Deckgläser im Dunkeln für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS, fügen Sie dann 500 ul der frisch zubereiteten 5 mg / ml Natriumborhydrid (NaBH 4) für 15 min bei Raumtemperatur zu reduzieren und inaktivieren verbleibenden Glutaraldehyd. Natriumborhydrid ist Brausetabletten und kleine Blasen werden am und um jedes Deckglas evident.
- Entfernen der NaBH 4-Lösung durch Vakuum-Ansaugen mit einer schnellen Kehrbewegung um die Außenseite von jedem Well. Achten Sie darauf, nicht zu holen keine schwimmenden Deckgläser, die losgelöst von der Unterseite der Gewebekultur Platte während NaBH 4 Behandlung wurde. Freistehendes Deckgläser, die nach oben zu schweben können vorsichtig zurückgeschoben werden auf dem gut unten, aber darauf zu achten, um eine Beschädigung der Protein-Beschichtung werden. Waschen jeder Vertiefung dreimal mit PBS und dann Inkubieren Deckgläser in 70% Ethanol für 30 min bei Raumtemperatur.
- Verwendung steriler Technik übertragen die Deckplättchen-enthaltenden Platten auf einen Typ IIA / B Zellkultur Laminarströmungshaube und spülen Deckgläser dreimal mit sterilem PBS. An diesem Punkt können die Deckgläser in PBS vor Licht geschützt bei 4 ° C für mindestens zwei Monate gelagert werden.
- Übertragen Deckgläser für Abbau-Assays auf eine leere Vertiefung einer neuen 24-Well-Platte durch sorgfältige Entfernung mit einer sterilen Nadel und Pinzette verwendet. Äquilibrieren Deckgläser für 1-24 h mit kompletter Medien entsprechend dem spezifischen Zelltyp wird untersucht. Es muss darauf geachtet nichtum das Deckglas umdrehen oder kratzen die Gelatine-Beschichtung (siehe Abbildung 3B).
2. Plating und Verarbeitung von Zellen auf Oregon Green 488-Gelatine beschichtete Deckgläser zum Assay ECM Degradation
- Saatgut 3-5x10 4 Zellen auf einem Deckglas in jede Vertiefung der 24-Well-Platte.
- Durchführung einer Zeitverlaufsstudie optimalen Zeiten für invadopodia Abbauaktivität für das bestimmte Zelllinie / Typ von Interesse zu bestimmen. Invasivste Zellen erfordern eine Zeit zwischen 4-24 h für den Abbau zu zeigen wird, obwohl dieser Bereich weit variieren kann und sollte empirisch ermittelt werden. Um invadopodia Aktivität synchronisieren, Zellen mit MMP-Inhibitoren (z. B. GM 6001) für einen gewünschten Zeitraum behandelt werden kann, dann waschen Sie den Inhibitor zu ermöglichen invadopodia Aktivität, um fortzufahren (siehe z. B. 6).
- Spülen Deckgläser dreimal mit PBS, dann fix Zellen mit 500 ul 10% gepuffertem Formalin Phosphate für 15 min. Spülen dreimal mit PBS und permeabilisieren für 4 min mit 0,4% Triton X-100 in PBS. Spülen dreimal mit PBS, die Triton X-100 zu entfernen.
- Label-Zellen mit einem beliebigen Standard-Protokoll für die Immunfluoreszenzfärbung (siehe 7 zum Beispiel) durch Co-Kennzeichnung Zellen mit einem fluoreszierenden Phalloidin zur Aktin-Filamenten (F-Aktin) zu visualisieren und für einen bekannten Markerprotein, die invadopodia lokalisiert (z. B.; Cortactin 5, TKS5 8 oder N-WASP 9). Auswahl zu vermeiden, mit 488-markierten sekundären Antikörpern oder GFP-markierten Proteine bei Verwendung Oregon Green 488 oder FITC-markiertem Gelatine zu Signalinterferenz zu verhindern.
- Montieren gefärbten Deckgläsern auf Objektträger aus Glas durch vorsichtiges Umdrehen des Deckglases und stellen Sie es auf einen Tropfen ProLong Gold-antifade oder ähnliches Reagenz.
- Um Matrixabbau, Bild Zellen in entsprechenden Kanäle mit einem herkömmlichen Leuchtstoff-oder konfokalen Mikroskop zu beurteilen. Gelatin Abbauvisualisiert wird als dunklere Bereiche auf dem Deckglas aufgrund der proteolytischen Entfernung der fluoreszierenden Gelatine (4A). Markierung von Zellen für Actin und einem invadopodia Markerprotein ermöglicht Bestätigung invadopodia an Stellen der Matrixabbau in fusionierten Bilder (4A).
- Abbauaktivität können auch in Echtzeit durch lebenden Zellen mit fluoreszierenden-markierten rekombinanten Proteinen an invadopodia Formation und Matrixabbau 5,10,11 verfolgen überwacht werden.
3. Quantifizierung von Fluorescent Gelatin Abbau durch Messung normalisierte Matrix Degradation
Diese Analyse liefert die normierte Fläche Matrixabbau relativ zum Bereich der Zellen oder der Anzahl der Zellen. Es ist nützlich zum Analysieren gesamte mikroskopischen Sichtfelder, in denen mehrere Zellen vorhanden sind, die kollektiv wurden mit siRNA, Wachstumsfaktoren oder therapeutischen Mitteln behandelt. Aus diesem analysis, sind die Bilder bei niedriger Vergrößerung gesammelt ausreichen, um effizient zu sammeln Informationen über Populationen von Zellen.
- Öffnen Sie die Bilder in ImageJ 12. ImageJ für die Mikroskopie kann heruntergeladen werden unter http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- Überprüfen Sie die Waage Informationen, indem Sie den Menübefehl "Analyze / Set Scale." Diese Informationen werden automatisch importieren mit vielen Dateiformaten, können aber manuell eingegeben werden, falls erforderlich. Richtige Skalierung erforderlich ist, um Messungen in Mikrometer anstatt Pixel berichten.
- Wählen Sie die entsprechenden Messungen zu verfolgen, indem Sie "Analyze / Set Maße." Überprüfen Area und Beschränken auf Threshold.
- Berechnung der Fläche des Abbaus mit dem fluoreszierenden Bild Gelatine (5A).
- Threshold das Bild ("Bild / Anpassen / Threshold"), um die oberen und unteren pixel Intensitätswerte, um die Bereiche des Abbaus (rot hervorgehoben; 5B). In den folgenden Bildern, benutzen Sie die Set-Taste in der Threshold-Fenster, um die gleiche Schwelle für alle Bilder gleichzeitig festzulegen, wie ein objektives Mittel, um den Abbau zu wählen.
- In einigen Fällen kann das Deckglas nicht vollkommen flach, wenn Bilder erfasst werden. Dies bewirkt, dass die Intensität der Gelatine um das vergrößerte Bild zu ändern. Wenn diese Variation schafft Probleme bei Schwellwertbildung des Bildes für korrekte ungleichmäßige Ausleuchtung über die Gelatine durch Subtrahieren der Hintergrund ("Process / Subtrahieren Hintergrund") oder durch Filtern mit einem Bandpassfilter ("Process / FFT / Bandpass-Filter") oder ein Pseudo Flatfield Filter ("Process / Filter / Pseudo Flatfield"), bis der Hintergrund-Intensität ist einheitlich.
- Man misst die Fläche der Matrix Abbau ("Analyze / Analyze Particles"). In der Analyse Partikel-Fenster, wählen Sie eine Korngröße von> 0 bis Lärm von t entfernenEr Auswahl. Show Outlines Regionen von Interesse (ROI) zu identifizieren. Check-Anzeige Ergebnisse und zusammenfassen, um Messungen zeigen. Wenn die Zeichnung wurde speziell alle Bereiche des Abbaus (Abbildung 5C) umrissen, kopieren Sie die Gesamtfläche Messung in einer Tabellenkalkulation. Wenn andere Objekte selektiert wurden (wie Debris), aufzunehmen, nur die Bereiche der entsprechenden ROIs.
- Berechnen Sie den Zellbereich mit dem Phalloidin gefärbt (F-Aktin) Bild (Abbildung 5D).
- Threshold das Bild ("Bild / Anpassen / Threshold"), um die oberen und unteren Pixelintensitätswerte so dass die Kanten der Zellen ausgewählt sind (rot hervorgehoben; Abbildung 5E) eingestellt. In den folgenden Bildern, benutzen Sie die Set-Taste in der Threshold-Fenster, um die gleiche Schwelle für alle Bilder gleichzeitig festzulegen, wie ein objektives Mittel zur Zelle auszuwählen.
- 10 Messen Sie den Bereich der Zellen ("Analyze / Analyze Particles"). In der Analyse Partizeuge Fenster, wählen Sie eine Korngröße von> 0 bis Lärm von der Auswahl zu entfernen. Anzeigen Outlines zu Regionen zur Analyse (5F) zu identifizieren. Check-Anzeige Ergebnisse und zusammenfassen zu Gebiet Messungen zeigen. Prüfen nicht einschließen Löcher wenn Räume zwischen Zellen in einem Cluster sind, so dass die nicht-ausgewählten Pixel innerhalb des Clusters wird nicht in dem Zellenbereich Berechnung einbezogen werden. Wählen Sie OK.
- Kopieren Sie den Bereich für die entsprechenden ROIs in eine Tabellenkalkulation.
- Berechnen Sie die Fläche von Gelatine Abbau pro Gesamtfläche von Zellen 13.
- Ein alternativer Ansatz besteht darin, den Bereich der Abbau pro Anzahl von Zellen von der Zählung Kerne (5G) hinweisen. Dies ist notwendig, wenn Manipulationen verändern die Zellen zwischen verschiedenen Vergleich Behandlungsgruppen. Automatische Zählung funktioniert am besten, wenn Kerne gut getrennt sind, einheitlich in der Intensität und rund. Automatisch zählen Keimbildungi ("Plugins / Particle Analysis / Nucleus Counter"). Wählen kleinsten und größten Partikelgröße, eine Threshold-Methode und eine Glättung Methode. Überprüfen Subtrahieren Hintergrund, Watershed Filter, hinzufügen Partikel zu ROI-Manager und Show Summary (Abbildung 5H).
- Wenn Kerne weitgehend überlappen oder eine unregelmäßige Form oder Textur können automatische Zählen nicht produzieren eine genaue Zählung (Abbildung 5H, Pfeile rechts). In diesem Fall kann das manuelle Zählen erleichtert über die Zellzahl-Werkzeug ("Plugins / Particle Analysis / Cell Counter") werden. Dies hält Zählung als Zellen während einer manuellen Zählung (Abbildung 5I) sind markiert.
- Kopieren der Anzahl von Zellen (Kerne) in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnung der Fläche von Gelatine Abbau pro Gesamtanzahl von Zellen.
4. Quantifizierung von fluoreszierenden Gelatin Degradation von einzelnen Zellen in einer gemischten Zellpopulation Um Matrixabbau sich aus spezifischen Zellen in einer Population von anderen Zellen innerhalb des Feldes (zB transfizierte gegenüber nicht-transfizierte Zellen) zu bewerten, kann die Prozedur in Abschnitt 3 modifiziert werden, um den Bereich der Abbau unter einzelnen Zellen zu messen. Eine zusätzliche fluoreszierende Kanal benötigt wird, um transfizierte Zellen zu markieren. In diesem Beispiel sind Bilder mit höherer Vergrößerung und gut getrennten Zellen leichter zu quantifizieren.
- Überprüfen Sie die Waage Informationen, indem Sie den Menübefehl "Analyze / Set Scale." Wählen Sie die entsprechende Messungen zu verfolgen, indem Sie "Analyze / Set Maße." Überprüfen Area und Beschränken auf Threshold.
- Für die einzelnen Zellen, die sich nicht berühren werden, zu identifizieren jede Zelle unter Verwendung des F-Aktin-Bild (Abbildung 6A). Threshold das Bild (siehe 3,9) (6B). Es ist wichtig, um die Kanten der Zellen zu erfassen, aber es kann sein Lochdrin, die nicht in der Schwelle enthalten. Verwenden Sie die gleiche Intensität Werte über Bilder Zellgrenzen wählen.
- Um den Bereich der Zellen zu messen, verwenden "Analyze / Analyze Particles." In der Analyze Particles Fenster, wählen Sie eine Größe> 0 (Rauschen zu eliminieren), Show Outlines, und überprüfen Sie Ergebnisse anzeigen, hinzufügen, um Manager und einbeziehen Löcher (für die Aufnahme der gesamte Bereich innerhalb der Kontur). Klicken Sie auf OK und notieren Sie die Fläche für jede Zelle aus dem Fenster Ergebnisse.
- Identifizieren welche Zellen transfiziert werden (6C).
- Identifizieren anhand der Abbau unter Verwendung des fluoreszierenden Bildes Gelatine (6D). Falls erforderlich, filtern Sie die Gelatine Bild Hintergrund-Intensität sogar (siehe 3.6). Threshold, um die Bereiche des Abbaus wählen, unter Nennung der Schwellwert-Einstellungen (Abbildung 6E). Bei nachfolgenden Bilder, verwenden die gleichen oberen und unteren Intensitätswerte (mit dem SetButton in der Threshold Fenster) für eine objektive Auswahl der Gebiete des Abbaus.
- Die Peakflächen der Abbau unter den Zellen. Auf der gethresholdeten fluoreszierenden Bild Gelatine, zeigen einen Umriss der Zellen durch Auswahl ROIs in der ROI-Manager-Fenster und Auswählen Measure (Abb. 6F). Notieren Sie die Ergebnisse und die Berechnung der normalisierten Bereich der Abbau / Zelle oder Bereich.
5. Repräsentative Ergebnisse
Das allgemeine Schema für das Verfahren ist in Abbildung 1 gezeigt. Das Verfahren beinhaltet Vorbereitung der Deckgläschen und Beschichtung mit Fluoreszenz-konjugierte Gelatine, Ausplattieren der Zellen auf die beschichteten Deckgläser, damit Zellen, um die Gelatine abgebaut, Fixieren und Beschriften von Zellen für die Fluoreszenz-mikroskopischen Analyse, Abbildung der fluoreszierenden Matrix die Matrix Integrität zu beurteilen, und objektiv zu quantifizieren das Ausmaß der Gelatinematrix Abbau mit Computer SoftwarE.
Abbildung 1. Insgesamt schematische Hervorhebung der wichtigsten Schritte in fluoreszierenden Gelatineschicht, Zell plating beteiligt, Fixieren und Immunmarkierung und Auswertung Matrix Proteolyse.
Die wichtigsten Verfahrensschritte bei der Vorbereitung und Beschichtung von Glas Deckgläser sind in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2. Schematische zeigt die einzelnen Schritte bei der Vorbereitung Deckgläschen für Gelatine Matrix-Beschichtung beteiligt. Schritte im Licht (lit Glühbirne), auf Eis (Würfel) und im Dunkeln (nicht beleuchtete Glühbirne) durchgeführt werden cartoon angezeigt. Schritte im Dunkeln Hilfe durchgeführt verhindern Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe Matrizen.
Wenn sie richtig durchgeführt wird, werden die Deckgläschen gleichmäßig mit Oregon Green 488-konjugierten g beschichtetelatin, homogene Fluoreszenz, wenn die Anzeige visualisiert durch Mikroskopie (Abbildung 3A). Typische Artefakte, die durch unsachgemäße Beschichtung entstehen können, Handhabung, Lagerung und Verwendung von beschichteten Deckgläsern in 3B gezeigt.
Abbildung 3. Beispiele für Artefakte während gelatinebeschichteten Deckplättchens Herstellung und Handhabung gestoßen. A. Orthogonal-Ansicht eines konfokalen Z-Stapel, die die typische Farbe und Konsistenz eines Oregon Green 488-konjugierten gelatinebeschichteten Deckglas hergestellt unter Verwendung des vorgeschriebenen Protokoll. Deckgläser sollte eine homogene Beschichtung ~ 1-2 um dick sind wie in der XZ-(unten) und YZ (rechts) gezeigt konfokalen Ebenen B. Artefakte, die während der Beschichtung und Verarbeitung von Gelatine beschichtete Deckgläser auftreten können, sind:. Unsachgemäße Abdeckung der Deckglas während des Beschichtungsprozesses durchschlechte Durchmischung manuelle Spreizung oder teilweise Verfestigung der Gelatine-Gemisch (ungleichmäßige Beschichtung), Entfernen des beschichteten Matrix durch erziehlt mit Nadeln oder Zangen während der Handhabung (Kratzen), Trocknen des Deckplättchens Oberfläche während längerer Lagerzeit, was zu einem "kopfstein "Aussehen (getrocknet) und Ausbleichen der fluoreszierenden Gelatineoberfläche während der Bildgebung durch längere oder hoher Intensität Belichtung (Bleichen). Weißer Pfeil zeigt gebleichte Gebiet umfasst eine beschichtete OSC19 Kopf und Hals Plattenepithelkarzinom Zelle. Der Oregon Green 488-konjugierten Gelatine weiß Falschfarben den Bildkontrast zu erhöhen. Bar, 10 um.
Die resultierenden dünnen Matrizen während dieses Verfahrens erzeugt stellen ein empfindliches Mittel, um die Fähigkeit von Zellen an ECM verschlechtern auszuwerten. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel invadopodia Aktivität aus einer Zelle auf einem OSC19 Oregon Green-488 konjugiert Gelatine Deckplättchens ausplattiertund durch herkömmliche konfokale Mikroskopie sowie Vol.-fill Bildwiedergabesystem nach dreidimensionale Entfaltung abgebildet.
Abbildung 4. Repräsentative Beispiele invadopodia Matrixabbau Aktivität. A. Visualisierung invadopodia und entsprechenden Gelatinematrix Proteolyse. OSC19 ausplattierten Zellen auf Oregon Green 488-konjugierten Gelatine Deckgläser für 10 h wurden fixiert und mit Rhodamin-konjugierten Phalloidin (F-Aktin) und Anti-Antikörper Cortactin (visualisiert mit Alexa Fluor 647 sekundären Antikörper und Falschfarben grün). Invadopodia ergeben sich als fokale cytoplasmatischen Konzentrationen von F-Actin und Cortactin, die mit Bereichen der Gelatine Lichtung (dunkle Löcher in der Matrix) in dem gemischten Bild überlappen. Karton enthaltenden Bereichen Pfeilspitzen zeigen einzelne invadopodia und Bereiche der fokalen Matrix Proteolyse wie in der vergrößerten re gezeigtenRegionen unten. Bar, 10 um. B. Volume füllen Visualisierung invadopodia Eindringen in das ECM. OSC19 Zellen plattiert und gefärbt, wie in (A) wurden visuell durch Erhalten 23 aufeinanderfolgenden 0,32 um optische z-Scheiben insgesamt 7,04 um für Rhodamin-konjugierten Phalloidin und Oregon Green 488-konjugierten Gelatine gerendert. Der gebürtige LSM-Datei für jeden Kanal eingestellt wurde AutoQuant X2.2 Software geöffnet und ein 3D-blinden Entfaltung eines jeden Bildstapel wurde unter Verwendung der empfohlenen Einstellungen (10 Iterationen, mittlere Rauschen). Die bearbeiteten Bilder wurden als TIFF-Stacks, die dann in NIS Elements wurden geöffnet und gerendert als Volumen Ansicht mit Alpha-Blending gespeichert. Die LUTs wurden angepasst, und ein Teilvolumen wurde geschaffen, um eine Kante im Inneren der Zelle, wo invadopodia vorhanden sind zeigen. Dorsal-edge Blick zeigt invadopodia (rot, Pfeile) in das darunter liegende Gelatine (grün) eingesetzt. Ventral-edge Ansicht zeigt protrusive invadopodia und Bereiche von Gelatine Abbau unter dem Deckglasals Bereiche in dem roten grünen Matrix (Pfeilspitzen). Die gesamte Bildfeld präsentiert wird bis 77 x 65 um beschnitten; die Zelle ~ 60 x 40 um.
Abbildung 5 zeigt einige der wichtigsten Schritte für die Quantifizierung der normalisierten Gelatinematrix Abbau, wie in Schritt 3 des Protokolls beschrieben. Dieses Verfahren wurde entwickelt, um für unvoreingenommene Quantifizierung von Gelatine Abbau in einem gesamte Sehfeld ermöglichen, und ist geeignet für Matrixabbau zurückzuführen auf viele Zellen innerhalb des Feldes.
Abbildung 5. Screen Capture Bilder Demonstration der wichtigsten Schritte in Computational-gestützte Quantifizierung der normalisierten Gelatine Abbau von Zellen innerhalb eines ganzen mikroskopischen Bild als im Protokoll Schritt 3 beschrieben. Alle fluoreszierende Bilder wurden in Graustufen umgewandelt besser zeigen die roten Schwellwertbildung und ROI Markierungen. A. ImAlter Oregon Green 488-konjugierten Gelatine, welche dunkle Bereiche ("Löchern"), wo Verschlechterung aufgetreten ist (Schritt 3.4). B. schwellwertverarbeiteten Bildes Gelatine hervorgehobene Bereiche Abbau in rot (Schritt 3.5). C. Zeichnung zeigt ROIs gemessen für Bereich des Abbaus (Schritt 3.7). D. Rhodamin Phalloidin-Färbung von F-Aktin (Schritt 3.8). E. gethresholdeten Aktin Bildes hervorheben gesamten Zellenbereich in rot (Schritt 3.9). F. Zeichnung zeigt Zellbereiche zu messenden (Schritt 3.10) . G. Bild von DAPI-gefärbten Zellkernen (Schritt 3,13). H. roten Konturen zeigen Ergebnisse von automatischen Kerne Zählen (Schritt 3,13). Das Watershed-Filter hat das Potenzial zu trennen Kerne, die sich berühren (weißer Pfeil). Wenn Kerne weitgehend überlappen, können sie nicht in einzelne Objekte (roter Pfeil) getrennt werden. Wenn ein Kern eine unregelmäßige Form, kann sie in mehrere Objekte (gelber Pfeil) getrennt werden. I. </ Strong> Ergebnisse aus der Marktbewertung von Kernen bei einer manuellen Zählung mit der Zelle Gegenwerkzeug (Schritt 3,14).
Abbildung 6. zeigt select Schritte bei der Quantifizierung fluoreszierenden Gelatine Abbau von einzelnen Zellen innerhalb einer gemischten Zellpopulation, wie im Protokoll Schritt 4 beschrieben beteiligt. Hier kann Matrixabbau durch transfizierte Zellen innerhalb einer Mischpopulation von transfizierten und nicht-transfizierten Zellen analysiert werden.
Abbildung 6. Screen Capture Bilder von Schritten bei der Quantifizierung Gelatine Abbau von einzelnen transfizierten Zellen innerhalb einer Zellpopulation beteiligt. Quantifizierung einer einzigen Zelle transfizierten OSC19 überexprimierenden rekombinanten Cortactin fusioniert an das FLAG-Epitop-Tag ist als ein Beispiel gezeigt. Alle fluoreszierende Bilder wurden in Graustufen umgewandelt besser zeigen die roten Thresholding und gelb ROI Markierungen. A. B. Zeichnung des gesamten Zellfläche auf F-Aktin Färbung beruht nach Anwendung des Threshold und Analysieren Partikel Funktionen (Schritt 4.2-3). C. Konfokales Bild von Anti-FLAG Immunomarkierung der Zellpopulation zeigt eine einzelne Zelle, die FLAG-markierten Cortactin (mit * gekennzeichnet) (Schritt 4,4). D. Bild von Oregon Green 488-konjugierten Gelatine, zeigt dunkle Bereiche ("Löcher"), wo Abbau hat aufgetreten ist (Schritt 4,5) E. gethresholdeten Gelatine Bild Hervorhebung dunklen Bereichen des Abbaus in rot (Schritt 4,5). F. gethresholdeten Gelatine Bild überlagert mit Zell-Linien von der Platte B (Schritt 4,6). Es werden nur die Pixel innerhalb der gethresholdeten Zelle Umrisse in der Analyse werden gezählt. Bereiche der Abbau außerhalb des aktuellen Zellenposition (weißer Pfeil) resultieren aus Zellmigration in der Gelatine mit der Zeit und sind nicht InclusionDED in der Analyse.
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Discussion
Die Fähigkeit, Zellen zu einer Verschlechterung der extrazellulären Matrix visualisieren hat die Entdeckung der molekularen Mechanismen in den frühen Schritten Zellinvasion beschäftigt unterstützt. Pionierarbeit von Wen-Tien Chen in den frühen 1980er Jahren 4,14,15 hat Beschichtung fluoreszenzmarkierten extrazelluläre Proteine auf Deckgläsern für die anschließende mikroskopische Analyse als primäre Technik bei der Beurteilung invadopodia Funktion in einem breiten Spektrum von Zelltypen entstanden. Die vorgeschriebenen Protokoll zeigt die grundlegende Verfahren zum Herstellen von mit Gelatine beschichteten Deckgläsern, die einen kollagenen Schicht weniger als 2 um dick geeignet für den Nachweis von extrazellulären Matrix Abbau durch Zellen in den meisten herkömmlichen fluoreszierenden und Konfokalmikroskopen 11,16-18 bilden, ähnlich dem, was verwendet hat zuvor 19-21 beschrieben. Diese Eigenschaften erlauben eine schnelle Herstellung von beschichteten Deckgläsern Lage ist, die anfängliche Einsetzen der Matrixabbau. Die Empfindlichkeit von th gewährte resultierenden dünnen Gelatinematrix auf den darunterliegenden harten Glasoberfläche wahrscheinlich Hilfsmittel bei der Förderung invadopodia Formation als Reaktion auf das hohe Eigensteifigkeit des gesamten Matrix-Umgebung 22. Jedoch werden diese Matrizen nicht gut für die Analyse von invadopodia Dehnung oder zusätzliche morphologische Bewertung, die erzielt wurde unter Verwendung dickerer (30-100 um) Gelatineschichten mit ähnlichen Methodologie beschichteten Transwells oder Elektronenmikroskopie 20,23,24 geeignet.
Wir haben gefunden, dass Vor-konjugierten kommerziell hergestellten Oregon Green 488 Gelatine zur raschen experimentelle Aufbau und konsistenten, reproduzierbaren Ergebnissen ermöglicht. Jedoch bleibt alkalischen Borat Konjugation von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) nach unmarkierten Gelatine ein beliebtes und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von fluoreszierenden Gelatine Konjugate 20. Fibronectin ist ebenfalls als Alternative Matrixprotein zur Markierung und Deckglas Beschichtung 4,9, und in einigen Fällen im verwendetenvestigators bezeichnet haben Fibronektin auf unmarkierten Gelatine beschichtete Deckgläser geschichtet zu schaffen dichter Matrizen 11,25 verwendet. Andere Matrizen könnte verwendet werden, je nach den spezifischen Gegebenheiten des Zelltyps. Neben Farbstoffen im grünen Spektrum 488 nm, haben eine Vielzahl von Fluorophoren auch mit manuellen Kopplungsverfahren verwendet worden, um Deckgläser mit unterschiedlichen Fluoreszenzspektren, einschließlich Rhodamin 21,26, Alexa Fluor 350 24, 546 21, 568 5,11 erzeugen , 594 27 und 647 5 Farbstoffe. Solche Konjugate sind leicht anpassbar für die Verwendung in dem vorgeschriebenen Protokoll, die Flexibilität zur Nutzung spezifischer ECM-Protein-Farbstoff-Kombinationen für die meisten jeder bildgebenden Filtersatz.
Die hierin beschriebenen Techniken die notwendigen detaillierten Schritte zur Nutzung ImageJ zu Gelatine Matrixabbau zugeschrieben einzelne Zellen in einer heterogenen Population oder ganze Zellgruppen quantifizieren veröffentlicht als previously 6,28. Proprietäre Software wurde auch erfolgreich für den gleichen Zweck 5,25 beschäftigt. In diesem Protokoll wird die Fläche von Matrixabbau entweder der Gesamtfläche der den Zellen oder der Gesamtzahl von Zellen (Kerne) im Bereich normalisiert. Im Allgemeinen werden beide Optionen zur Normierung das gleiche Ergebnis (ELW, Daten nicht gezeigt). Wenn jedoch verschiedene Zelllinien mit unterschiedlich großen Zellen werden verglichen oder ob die experimentelle Behandlung bewirkt Zellen zu ändern, dann kann es genauer zu Zellzahl normalisieren. Auf der anderen Seite sind viele Krebszelllinien einen hohen Prozentsatz von mehrkernigen Zellen, in diesem Fall insgesamt Zellfläche kann ein genauerer Parameter für die Normalisierung sein. Auch wenn nur ein Teil einer Zelle in einem Bild (Bild 6) erfasst wird, kann es besser sein, um Zellfläche normalisieren anstatt unterschätzen Abbaupotential für eine einzelne Zelle. Es ist wichtig, die Bildanalyse zur besten entsprechen optimierendie Eigenschaften und Nuancen der spezifischen Versuchsanordnung.
Zur Bestimmung Zellzahlen in einem überfüllten Feld Zählen Kerne ist oft die Methode der Wahl. ImageJ hat einen Kern Zähler Plugin für automatische Zählung. Eine Option in diesem Tool ist die Watershed-Filter. Dieser Filter hilft separaten Kernen, die sortenrein in einzelne Objekte (Abbildung 5H, weißer Pfeil) berühren. Jedoch kann diese Filter nicht in der Lage sein, das weitgehend getrennte Kerne überlappen (Figur 5H, roter Pfeil). Darüber hinaus, wenn ein Kern eine unregelmäßige Form und große Variationen in der Intensität, kann der Filter einen einzigen Zellkern in mehrere Objekte (Abbildung 5H, gelber Pfeil) zu trennen. Daher ist es wichtig, verschiedene Schwellenwertbildung und Glätten Methoden dieses Plugin versuchen, die besten Parameter für die Analyse zu bestimmen. Wenn die automatische Zählung der keine genauen Zahlen, kann die Zelle Zähler plugin faci litate manuellen Zählung von Zellen oder Kerne.
In Fällen unter Verwendung transienter Transfektion werden die Bilder enthalten oft eine Mischung von Zellen exprimieren oder nicht exprimieren, das ein Protein von Interesse (Abbildung 6). In diesem Szenario ist es nicht immer offensichtlich, welche Zellen für die Erstellung Bereichen Matrixabbau waren. Dies gilt insbesondere, wenn die Zellen über der Gelatine migrieren. Um bei der Analyse konsistent ist es wichtig, dass nur die degradierten Bereiche zu messen direkt unter jeder Zelle. Durch Schwellenwerten, um die dunklen Bereiche in der Matrix auswählen und mit dem Aktin zu Zelle Konturen erzeugen, werden nur die degradierten Flächen unter den Zellen quantifiziert werden. Dieses Verfahren wird degradierten Flächen außerhalb der Zelle Grenzen von Analyse (6F, Pfeil) auszuschließen. Der Assay kann verlangen Optimierung auf einen Zeitpunkt, der genügend Zeit ermöglicht das verlustfreie bevor die Zellen Gelegenheit hatte, zu selektieren.
"> Zahlreiche Verfahren entwickelt worden, um invadopodia Bildung und Funktion zu quantifizieren. Neben Matrixabbau umfassen andere häufigsten berichtete Parameter Bestimmen der Anzahl von invadopodia pro Zelle, den Prozentsatz der Zellen, die invadopodia innerhalb einer Population, und die Anzahl von" unreifen "oder" pre reifen "invadopodia abbauen kann der ECM 11,13,25,26" non-abbauenden invadopodia Vergleich zu ". Verfahren (e) der Wahl für invadopodia Auswertung auf inhärente Eigenschaften jeder Zelltyp abhängen. Zum Beispiel Zählen der Anzahl von invadopodia pro Zelle oder zur Bestimmung des Prozentsatzes von Zellen, die invadopodia ist ein einfacher Ansatz, die gut funktioniert, wenn die analysierten Zellen nur einige prominente invadopodia enthalten, aber schwieriger wird in Zellen, die Dutzende oder wo invadopodia invadopodia kann klein haben und schwierig zu detektieren. Verwenden des Abbaus Assay macht es möglich, den Prozentsatz der vor invadopodia v berechnens. Ältere invadopodia in einzelne Zellen oder in einer Population durch Vergleichen der Gesamtanzahl der Zellen mit invadopodia dem Prozentsatz, der abbauenden Matrix sind. Wenn es eine Diskrepanz in denen weniger Zellen sind abbauenden Matrix im Vergleich zu Zellen anzeigt invadopodia, kann dies bedeuten, dass diese Zellen bilden, die Pre-invadopodia unfähig Matrixabbau zu der Zeit wurden die Zellen fixiert wurden.Egal welche Methode Kombination für die Analyse ausgewählt, ist es wichtig, um die gewünschten Eigenschaften invadopodia so objektiv wie möglich zu quantifizieren. Beim Sammeln von Bildern auf dem Mikroskop wählen Felder durch suchen Zellen (Actin), anstatt der fluoreszierenden Matrix, zum Vorspannen von vorzugsweises Auswählen Bereichen mit hohen Abbau zu vermeiden. Mehrere Bilder sollten erworben um eine angemessene Vertretung der Zellpopulation gewährleisten. Bilder sollten auch bei einer geeigneten Vergrößerung erworben werden. Für einheitliche Populationen von Zellen, können niedrigere Vergrößerungverwendet werden, um mehr Zellen einzuziehen, solange die Bereiche Abbau noch aufgelöst werden kann. Bilder mit höherer Vergrößerung werden bevorzugt, um Gebiete unter einzelnen Zellen zu messen und einzelnen invadopodia lösen. Wenn Bereiche, die sind quantifiziert, Schwellenwert Bilder basierend auf Intensität ist objektiver als manuell die Wahl der Bereich der Matrix zu messen. In allen Fällen ist eine ausreichende Anzahl von Zellen, die aus mehreren voneinander unabhängigen Experimenten analysiert, um statistisch aussagekräftige, reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Stiftungsfonds von der West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center unterstützt. Wir danken Susette Mueller (Georgetown University) und Laura Kelley für die frühe Beratung und Unterstützung. Die Verwendung der West Virginia University Microscopy Imaging Facility (unterstützt von der Mary Babb Randolph Cancer Center und NIH Zuschüsse P20 RR16440, P30 und P30 RR032138 GM103488) wird dankbar anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
