Summary
Мы описываем прототип способ получения микроскопом покровные покрыта флуоресцентной желатина для визуализации invadopodia-опосредованной деградации матрице. Вычислительные методы с использованием доступного программного обеспечения представлены для количественного определения результирующего уровня матрицы протеолиза одной клетки в смешанной популяции и для многоклеточных группы охватывает весь микроскопических полей.
Abstract
Сотовый вторжения в местных тканей является важным процессом в развитии и гомеостаза. Malregulated вторжения и последующего движения клетки характерно несколько патологических процессов, в том числе воспаление, сердечно-сосудистые заболевания и метастазов опухолевых клеток 1. Сосредоточен деградации протеолитическими внеклеточного матрикса (ECM) компонентов в эпителиальной или эндотелиальной базальной мембраны является важным шагом в налаживании сотовой вторжения. В опухолевых клетках, обширный анализ в лабораторных установила, что ECM деградации осуществляется вентральной актина богатых мембранных структур называют выступающими invadopodia 2,3. Invadopodia форме в тесном прикладывание к ECM, где они отвечают ECM пробоя под действием матриксных металлопротеиназ (ММП). Способность опухолевых клеток с образованием invadopodia прямо коррелирует со способностью вторгаться в местные стромы и связанные с ними сосудистые компоненты 3.
_content "> Визуализация invadopodia ECM-опосредованной деградации клеток с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием красителей-меченых белков матрицы наносится на стекло покровные стала наиболее распространенной техникой для оценки степени протеолиза матрицы и сотовые инвазивный потенциал 4,5. Здесь мы опишем версия стандартный метод генерации флуоресцентно-меченных покровные стекла с использованием коммерчески доступных Орегон Зеленый-488 желатином сопряжены. этот метод легко масштабируется быстро производить большое количество покрытием покровные. Покажем некоторые общие микроскопические артефакты, которые часто встречаются Во время этой процедуры и как их можно избежать. Наконец, мы опишем стандартные методы использования доступны компьютерные программы, чтобы количественное меченых желатин деградации матрицы опосредовано отдельных клеток и целых клеточных популяций. описанные процедуры дают возможность точно и воспроизводимо мониторинг invadopodiaдеятельности, а также может служить в качестве платформы для оценки эффективности модуляции экспрессии белка или тестирование по борьбе с инвазивными соединений на деградацию внеклеточных матриц в одно-и многоклеточных настройки.Protocol
1. Производство Орегон Зеленый 488-желатин покрытием Покровные
- Подготовка немеченого 5% (м / м) акции желатина / раствор сахарозы путем добавления 1,25 г желатина и 1,25 г сахарозы в PBS до конечного объема 50 мл. Теплый склад желатиновый раствор до 37 ° С и убедитесь, что он полностью растаял перед использованием. Хранить конечной смеси при температуре 4 ° C.
- Очистите диаметром 13 мм № 1 покровные стекла, создав отдельные покровное в каждую лунку 24-луночных пластиковых пластин культуре ткани. Добавить 500 мкл 20%-ной азотной кислоты в каждую лунку и инкубировать в течение 30 мин. Аспирируйте раствора азотной кислоты и вымыть покровные три раза деионизированной водой.
- Пальто покровные с 500 мкл 50 мкг / мл поли-L-лизин (полученный от 0,1% раствора и разводят в деионизированной воде) в каждую лунку в течение 20 мин при комнатной температуре. Аспирируйте раствор и вымыть три раза с PBS. Поли-L-лизин покрытием обеспечивает равномерное покрытие и связь вышележащих ла-белед желатин.
- Добавить 500 мкл 0,5% глутарового альдегида (приготовлен перед употреблением) в каждую лунку и инкубировать 24-луночные планшеты на льду в течение 15 мин. Аспирируйте и мыть три раза холодным PBS. Будьте уверены, чтобы удалить все следы PBS до желатин покрытием. Храните пластины на льду во всех моет, пока желатин не добавляется.
- Развести Орегон Зеленый 488-сопряженных желатин в качестве протокола на производителя и прогрейте его и немеченого 5% желатина / раствор сахарозы из (1,1) до 37 ° C. Развести одну часть штата Орегон Зеленый 488 желатином на восемь частей немеченого желатина / сахарозы (то есть, 500 мкл Орегон Зеленый 488 желатин в 4 мл 5% желатина смесь). Внесите 100 мкл разбавленного 488-желатиновой смеси (выдерживали при 37 ° C) на каждую покровное, используя желатин достаточно, чтобы покрыть покровным без ручного распространения (что может привести к неравномерности покрытия покровным как показано на рисунке 3В). Это важно, чтобы разбавленный 488-желатиновой смеси при 37 ° С, C во время нанесения покрытия процедуры для предотвращения преждевременного затвердевания. С этой шагом вперед покровные должны храниться в темном как можно больше, чтобы избежать возможных фотообесцвечивания. Другие белки ECM конъюгированных с различными флуорофоров может быть заменен на зеленый Oregon 488 желатин (см. Обсуждение).
- После того как все покровные покрывают в одной пластины, удерживая 24-луночный планшет под углом и удалить избыток желатина из каждой лунки по вакуум-аспирации. Инкубируйте покрытием покровные в темноте в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Вымойте покровные три раза PBS, затем добавить 500 мкл свежеприготовленного 5 мг / мл борогидрида натрия (NaBH 4) в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы уменьшить и инактивации остаточных глутаральдегида. Боргидрид натрия является шипучих, а мелкие пузырьки будет видно, и вокруг каждого покровное.
- Снимите NaBH 4 решения, вакуум-аспирация с быстрым широким движением вокруг внешней стороны каждой скважины. Старайтесь не принимать никаких плавающих покровные, которые стали отделяться от нижней части планшета для культуры ткани во время NaBH 4 лечении. Отдельный покровные, которые плавают на вершину можно осторожно отодвинул вниз на дно колодца, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить покрытие белка. Промойте каждую лунку три раза PBS, а затем инкубировать покровные в 70% этаноле в течение 30 мин при комнатной температуре.
- С использованием стерильной техники, передает покровное содержащих пластины типа IIA / B культуре клеток ламинаре и промыть покровные три раза стерильной PBS. На данный момент покровные могут быть сохранены в PBS в защищенном от света при температуре 4 ° C в течение по крайней мере двух месяцев.
- Передача покровные, которые будут использоваться для разложения проб для пустого и новой 24-луночный планшет тщательное удаление при помощи стерильной иглы и пинцет. Уравновесьте покровные в течение 1-24 ч с полным средства, отвечающие определенным типом клеток не анализировали. Необходимо соблюдать осторожность, нечтобы инвертировать покровное или поцарапать покрытие желатином (см. рис 3B).
2. Покрытие и обработка Ячейки Орегон Зеленый 488-желатин покрытием Покровные к деградации анализа ECM
- Семенной 3-5х10 4 клеток на покровном в каждую лунку 24-луночный планшет.
- Провести исследование ход времени, чтобы определить оптимальное время, необходимое для invadopodia деградации деятельности для конкретной линии клеток / тип интерес. Большинство инвазивных клеток требует времени между 4-24 ч для деградации становится очевидным, хотя этот диапазон может варьироваться в широких пределах и должны быть определены эмпирически. Для синхронизации invadopodia деятельности, клеток можно лечить с помощью ингибиторов ММП (например, GM 6001) за нужный период времени, а затем промыть ингибитор, чтобы invadopodia деятельности для продолжения (см., например, 6).
- Промыть покровные три раза PBS, а затем исправить клеток с 500 мкл 10% буферном растворе формалина фосфатазыТе течение 15 мин. Промойте три раза PBS и permeabilize в течение 4 мин с 0,4% Тритон Х-100 в PBS. Промойте три раза PBS, чтобы удалить Triton X-100.
- Этикетка клетки, используя любой стандартный протокол для иммунофлуоресцентного окрашивания (см. п. 7 например) совместно маркировки клеток с флуоресцентными сопряженных фаллоидином для визуализации актиновых филаментов (F-актин) и известный маркер белок, который локализуется в invadopodia (например, cortactin 5, TKS5 8 или N-WASP 9). Помните, чтобы избежать использования 488-меченых вторичных антител или GFP-меченых белков при использовании Орегон Зеленый 488 или FITC-меченые желатина для предотвращения интерференции сигналов.
- Установите окрашенных покровные на предметные стекла микроскопа тщательно обращения покровное и размещение его на каплю продлить antifade золото или аналогичных реагентов.
- Для оценки деградации матрицы, изображение клеток в соответствующие каналы с помощью обычного флуоресцентного или конфокальной микроскопии. Желатин деградациивизуализируются в виде темных областей на покровное за счет протеолитического удаления флуоресцентные желатина (рис. 4а). Маркировка ячеек для актина и белка invadopodia маркер позволяет подтверждения invadopodia на участках матрицы деградации объединенного изображения (рис. 4а).
- Деградация деятельности можно также отслеживать в режиме реального времени изображений живых клеток с флуоресцентными метками рекомбинантных белков для отслеживания invadopodia формирования и деградации матрицы 5,10,11.
3. Количественный флуоресцентный Желатин деградации путем измерения нормализованной деградации матрицы
Этот анализ дает нормированной области деградации матрицы по отношению к площади клетки или количество клеток. Это полезно для анализа всей микроскопических полей зрения, где несколько ячеек присутствуют, которые обрабатывались с миРНК, факторы роста или терапевтических агентов. Для этого анаы, изображений, собранных на меньшем увеличении достаточно, чтобы эффективно собирать информацию о популяциях клеток.
- Откройте изображение в ImageJ 12. ImageJ для микроскопии могут быть скачаны с http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- Проверьте масштабе информации, выбрав команду меню "Анализ / Set Scale." Эта информация будет импортировать автоматически со многими форматами файлов, но можно ввести вручную, если требуется. Правильное масштабирование необходимо сообщить измерения в микронах, а не пикселей.
- Выберите соответствующие измерения, чтобы отслеживать, выбрав "Анализ / установка измерения". Проверьте зону и ограничение до порога.
- Вычислить площадь деградации использованием флуоресцентных изображений желатина (рис. 5).
- Порог изображения ("Image / Adjust / Threshold"), чтобы установить верхние и нижние пиЗначения Xel интенсивности, чтобы выбрать областей деградации (выделен красным цветом; рис. 5б). В последующие изображения, используйте кнопку Установить в преддверии окна, чтобы установить тот же порог для всех изображений в качестве объективной означает деградацию, чтобы выбрать область.
- В некоторых случаях, покровное не может быть идеально ровной, когда изображения приобрели. Это вызывает напряженность желатин изменить на изображении. Если этот вариант создает проблемы при пороговой изображения, для правильной неравномерность освещения по всей желатин путем вычитания фона ("Process / вычитание фона"), либо путем фильтрации с полосовой фильтр ("Процесс / FFT / полосовой фильтр") или псевдо flatfield фильтр ("Process / Фильтры / Псевдо Flatfield"), пока интенсивность фона равномерно.
- Измерьте площадь матрицы деградации ("Анализ / Анализ частиц»). В окне Анализ частиц, выберите размер частиц> 0 для удаления шума с тОн выбора. Показать Контуры для выявления областей, представляющих интерес (трансформирования). Проверьте Показать результаты и обобщить, чтобы показать измерений. Если чертеж конкретно изложил все области деградации (рис. 5С), скопировать Всего измерения площади в электронную таблицу. Если другие объекты были выбраны (таких, как мусор), запишите только те области, соответствующей области трансформирования.
- Рассчитать ячейку области с помощью фаллоидином окрашенные (F-актин) изображение (рис. 5D).
- Порог изображения ("Image / Adjust / Threshold"), чтобы установить верхние и нижние значения интенсивности пикселей, так что края клетки выбран (выделен красным цветом, рисунок 5E). В последующие изображения, используйте кнопку Установить в преддверии окна, чтобы установить тот же порог для всех изображений в качестве объективной означает для выбора ячеек.
- 10 Измерить площадь клетки ("Анализ / Анализ частиц»). В анализ Партиичастицы окне выберите размер частиц> 0 для удаления шума с выбором. Показать Контуры для выявления областей для анализа (рис. 5F). Проверьте Показать результаты и обобщить, чтобы показать область измерений. Не флажок Включить отверстий, если есть пространство между клетками в кластере, так что не выбранные пиксели внутри кластера, не будут включены в расчет площадь ячейки. Нажмите кнопку ОК.
- Скопируйте Площадь результаты для соответствующих трансформирования в электронную таблицу.
- Вычислить площадь желатин деградация в общей площади клетки 13.
- Альтернативный подход мог бы сообщить области деградации на количество клеток из подсчета ядер (рис. 5Г). Это необходимо, если манипуляции изменить ячеек между различными сравниваемых группах лечения. Автоматический подсчет работает лучше, если ядер хорошо разделены, равномерное по интенсивности и круглые. Автоматически рассчитывать нуклоновя ("Plugins / анализа частиц / Nucleus Counter"). Выберите наименьшего и наибольшего размера частиц, порог метод и метод сглаживания. Проверьте вычитание фона, водораздел процедить, добавить частицы ROI менеджер и Show Summary (рис. 5H).
- Если ядра перекрываются широко или имеют неправильную форму или текстуру, автоматический подсчет не может производить точный подсчет (рис. 5H, стрелки справа). В этом случае ручной подсчет можно облегчить с помощью инструмента ячейки счетчика ("Plugins / анализа частиц / Счетчик клеток"). Это позволит вести учет как клетки отмечены во время ручного счета (рис. 5I).
- Скопируйте количество клеток (ядер) в электронную таблицу. Вычислить площадь желатин деградации в общем количестве клеток.
4. Количественный флуоресцентный Желатин деградации отдельных клеток в смешанной клеточной популяции Для оценки матрицы деградация в результате специфических клеток в популяции отдельно от других клеток в поле (например, трансфекции по сравнению с не-трансфицированные клетки), процедура в разделе 3 может быть изменен, чтобы измерить площадь под деградации отдельных клеток. Дополнительных флуоресцентных канала Стоит отметить, трансфицированных клеток. В этом случае большее увеличение изображения и хорошо разделенных клеток легче количественно.
- Проверьте масштабе информации, выбрав команду меню "Анализ / Установка масштаба". Выберите соответствующие измерения, чтобы отслеживать, выбрав "Анализ / установка измерения". Проверьте зону и ограничение до порога.
- Для отдельных клеток, которые не касаются, идентифицировать каждую ячейку с помощью F-актин изображение (рис. 6а). Порог изображение (см. 3,9) (рис. 6В). Важно, чтобы захватить края клетки, но не может быть дыранаходится внутри, которые не входят в порог. Используйте те же значения интенсивности по фотографии, чтобы выбрать ячейку границ.
- Для измерения площади клетки, используйте "Анализ / Анализ частиц.« В окне Анализ частиц, выберите размер> 0 (для устранения шума), контуры Show, и проверьте Показать результаты, Добавить в менеджер и включить отверстия (для записи всей площади внутри контура). Выберите OK и записывать района для каждой ячейки в окне результатов.
- Определите, какие клетки трансфицируют (рис. 6).
- Определить области деградации использованием флуоресцентных изображений желатина (рис. 6D). При необходимости фильтровать желатин изображение, чтобы выровнять интенсивность фона (см. раздел 3.6). Порог для выбора областей деградации, что делает сведению пороговых значений (рис. 6E). В последующие изображения, использовать эти же верхние и нижние значения интенсивности (с помощью Setкнопки в окне Порог) для целей отбора районов деградации.
- Измерьте области деградации под клетками. На thresholded флуоресцентные изображения желатин, показывают контуры клеток, выбрав трансформирования в окне диспетчера ROI и выбрав измерения (рис. 6F). Запишите результаты и рассчитать нормированные области деградации / ячейку или область ячеек.
5. Представитель Результаты
Общая схема для процедуры показана на рисунке 1. Процедура предполагает подготовку покровные стекла и покрытий с флуоресцентно-сопряженных желатин, покрывая клеток на покрытие покровные клетки, чтобы деградировать желатин, крепления и маркировки клеток для микроскопического анализа флуоресценции, визуализации флуоресцентных матрицы для оценки матрицы целостности, и объективной количественной оценки степени деградации желатин матрицы с помощью компьютера Softwarе.
Рисунок 1. Общая схема выделения ключевых этапов в люминесцентных желатин покрытием, сотовые покрытия, фиксации и иммунного и оценки матрицы протеолиза.
Ключевым процессуальные действия, участвующих в подготовке и покровные стекла покрытия указаны на рисунке 2.
Рисунок 2. Схема демонстрирует отдельные этапы подготовки стекла покровные для желатина покрытие матрицы. Шаги, проведенного в свет (горит лампа), на лед (кубиками) и в темноте (без подсветки лампы) являются мультфильма указано. Шаги, проведенных в темном поможет предотвратить фотообесцвечивания флуоресцентных матриц.
При правильном исполнении, покровные равномерно покрыта Орегон Зеленый 488-сопряженных гelatin, показывая однородной флуоресценции при визуализированы с помощью микроскопии (рис. 3А). Типичные артефакты, которые могут возникнуть из-за неправильного покрытия, обработки, хранения и использования покрытием покровные показано на рисунке 3b.
Рисунок 3. Примеры артефактов, возникших в ходе подготовки желатин покрытием покровное и обработки. А. Ортогональные зрения конфокальной Z-Stack показывает типичный цвет и консистенцию Орегон Зеленый 488-сопряженных желатин покрытием покровное производится с использованием установленного протокола. Покровные стекла должны иметь однородные покрытия ~ 1-2 мкм, как показано на XZ (внизу) и YZ (справа) конфокальной плоскости B. артефактов, которые могут возникнуть во время нанесения покрытия и обработки желатин покрытием покровные включают в себя:. Неправильное покрытие покровное в процессе нанесения покрытия за счетплохого перемешивания, руководство распространение или частичного затвердевания смесь желатина (неравномерное покрытие), снятие с покрытием матрицы, забив с иглами или щипцами во время обработки (царапины), сушка покровное поверхность в течение длительного времени хранения, в результате чего "булыжника "внешности (обезвоженного) и фотообесцвечивания флуоресцентных желатин поверхности во время съемки из-за длительного воздействия или высокой интенсивности света (обесцвечивание). Белая стрелка указывает беленой охватывает площадь покрытая голова и шея OSC19 плоскоклеточный рак. Орегон Зеленый 488-сопряженных желатин псевдоцветной белого для повышения контрастности изображения. Бар, 10 мкм.
В результате тонкого матриц производится во время этой процедуры обеспечивают чувствительные средства для оценки способности клеток к деградации ECM. Рисунок 4 показывает пример деятельности invadopodia от OSC19 клетки высевают на зеленый Oregon-488 сопряженной желатин покровноеи изображается обычной конфокальной микроскопии, а также по объему заполнения рендеринга изображений после трех мерной деконволюции.
Рисунок 4. Типичные примеры invadopodia деятельности деградации матрицы.. Визуализация invadopodia и соответствующие желатин протеолиза матрицы. OSC19 клеток высевали на Орегон Зеленый 488-сопряженных желатин покровные в течение 10 часов были зафиксированы и помечены с родамин-конъюгированного фаллоидином (F-актин) и анти-cortactin антител (визуализированы с Alexa Fluor 647 вторичным антителом и псевдоцветной зеленый). Invadopodia очевидны в качестве координационного цитоплазматическая концентрация F-актин и cortactin, которые перекрываются с районами желатин очистки (темные отверстия в матрице) в рамках объединенного изображения. Boxed областей, содержащих стрелки указывают на отдельные invadopodia и районах координационные протеолиза матрицы, как показано в увеличенном повторнойрегионах ниже. Бар, 10 мкм. B. Объем заполнения визуализации проникновения invadopodia в ECM. OSC19 посеянных клеток и витражей, как в (A) были визуально, оказываемых получения 23 последовательных 0,32 мкм оптического г-ломтики общую 7,04 мкм для родамина-сопряженных фаллоидином и Орегон Зеленый 488-сопряженных желатин. Исходный файл LSM для каждого канала был открыт в AutoQuant X2.2 программного обеспечения и 3D слепой деконволюции каждое изображение стека была выполнена с использованием рекомендуемых параметров (10 итераций, средний шум). Обработанные изображения были сохранены как стеки TIFF, которые затем были открыты в NIS Elements и оказанных как объем вида с альфа-смешивание. ТМП были скорректированы, и подтом был создан, чтобы показать края внутрь клетки, где invadopodia нет. Спинной краем зрения демонстрирует invadopodia (красный, стрелки) вставляется в основной желатин (зеленый). Брюшной края зрения показывает, выступающими invadopodia и области желатин деградации под покровноев регионах красного присутствуют в зеленой матрице (наконечники стрел). Полное поле изображения, представленного обрезается до 77 х 65 мкм; ячейки составляет ~ 60 х 40 мкм.
На рисунке 5 показаны некоторые из важных шагов для количественного определения нормированной желатин деградации матрицы, как описано в пункте 3 протокола. Эта процедура разработана, чтобы обеспечить беспристрастный количественного желатина деградации всему полю зрения, и подходит для матрицы отнести к деградации многих клеток в поле.
Рисунок 5. Экрана захвата изображения демонстрируют основные этапы вычислительного при содействии количественного нормированных желатин деградации клеток в течение всей микроскопических изображений, как описано в протоколе шаг 3. Все флуоресцентные изображения были преобразованы в оттенках серого для лучшего отображения красного порога рентабельности и маркировки. А. Imвозраст Орегон Зеленый 488-сопряженных желатин, показывая темные области ("дыры"), где произошла деградация (шаг 3,4). B. Thresholded желатин изображения выделения областей деградации в красном (шаг 3,5). C. чертеж трансформирования измеряли площадь деградации (шаг 3,7). D. родамина фаллоидином окрашивания F-актин (шаг 3,8). E. Thresholded актина изображение выделение общей площадью ячейки в красный (шаг 3,9). F. чертеж ячеек, которые должны быть измерены (шаг 3,10) . G. Изображение DAPI-окрашенных ядер клеток (шаг 3,13). H. красный контур показать результаты автоматического подсчета ядер (шаг 3,13). Водораздел фильтр имеет потенциал для отдельных ядер, которые касаются (белая стрелка). Если ядра перекрываются широко, они не могут быть разделены на отдельные объекты (красная стрелка). Если ядро имеет неправильную форму, он может быть разделен на несколько объектов (желтая стрелка). I. </ Сильные результаты> с маркировкой ядер во время ручной подсчет с помощью инструмента ячейки счетчика (шаг 3,14).
Рисунок 6. Выберите демонстрирует этапы количественного флуоресцентного желатин деградация отдельных клеток в смешанной клеточной популяции, как описано в протоколе шаге 4. Здесь матрица деградации трансфицированные клетки могут быть проанализированы в рамках смешанной населения трансфицированных и не трансфицированных клеток.
Рисунок 6. Экран захвата изображений из этапов количественного желатин деградации отдельных трансфицированных клеток в клеточной популяции. Количественное одного трансфицированных OSC19 клетки гиперэкспрессией рекомбинантного cortactin слит с тегом эпитопом FLAG показан в качестве примера. Все флуоресцентные изображения были преобразованы в оттенках серого для лучшего отображения красного и желтого порог маркировки ROI. A. B. Рисунок общая площадь ячейки на основе F-актин окрашивания после применения порог и анализ частиц функций (шаг 4.2-3). C. конфокальной изображения анти-FLAG иммунного клеточной популяции демонстрируют одну ячейку выражения FLAG-отмеченных cortactin (отмечены *) (шаг 4,4). D. Изображение Орегон Зеленый 488-сопряженных желатин, показывая темные области ("дыры"), где деградация имеет произошло (шаг 4,5) E. Thresholded желатин изображение выделение темных областей деградации в красном (шаг 4,5). F. Thresholded желатин наложения изображений с мобильного очертания с панелью B (шаг 4,6). Отметим, что только thresholded пикселей внутри клетки контуры учитывается в анализе. Области деградации за пределами текущего местоположения ячейки (белая стрелка) в результате миграции клеток через желатина в течение долгого времени и не вклюДед в анализе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способность визуализировать клетки унижающие внеклеточного матрикса помог в раскрытии молекулярных механизмов, занятых в ранних стадиях клеточного вторжения. Pioneered Вэнь-тянь Chen в начале 1980-х годов 4,14,15, покрытием флуоресцентно меченых белков внеклеточного на стекло покровные для последующего микроскопического анализа появился в качестве основного метода в оценке invadopodia функции в широком диапазоне типов клеток. Предписанных протоколом демонстрирует основной метод, используемый для подготовки желатин покрытием покровные, которые образуют слой коллагеновых менее 2 мкм подходит для определения внеклеточной матрицы деградацию клеток в самых обычных флуоресцентных микроскопов и конфокальной 11,16-18, подобно тому, что имеет были описаны ранее 19-21. Эти свойства позволяют быстрое производство покрытием покровные способна обнаруживать начальные начала матрицы деградации. Чувствительность предоставляемой-йэлектронной результатом тонкой желатиновой матрицей на основном жестком поверхности стекла вероятно, помогает в содействии invadopodia образование как ответ на высоком присуща жесткость общая обстановка в матрице 22. Тем не менее, эти матрицы не очень хорошо подходит для анализа invadopodia удлинение или дополнительного морфологического оценки, которые были достигнуты использованием толще (30-100 мкм) слоя желатина с похожей методологии, покрытые transwells или электронной микроскопии 20,23,24.
Мы обнаружили, что предварительно сопряженных серийно выпускаемых Орегон Зеленый 488 желатином позволяет быстро множества экспериментальных и последовательной, воспроизводимость результатов. Тем не менее, щелочные сопряжения борат флуоресцеина изотиоцианат (FITC), чтобы немеченого желатина остается популярной и недорогой способ получения флуоресцентных желатин конъюгаты 20. Фибронектин также используется в качестве альтернативного белковой матрицы для маркировки и покровное покрытие 4,9, а в некоторых случаях втелей использовали меченый фибронектин слоями на немеченого желатин покрытием покровные для создания плотных матриц 11,25. Другие матрицы могут быть использованы, в зависимости от специфики типа клеток. В дополнение к красителями в зеленый 488 нм спектра, широкий спектр флуорофоров были также использованы с ручным методам связи для получения покровных с разными спектрами флуоресценции, в том числе родамина 21,26, Alexa Fluor 350 24 546 21 568 5,11 , 594 27 и 647 5 красителей. Такие конъюгаты легко адаптируются для использования в установленном протокола, что обеспечивает гибкость для использования конкретного ECM белок-краситель комбинаций подходят для большинства любой набор изображений фильтра.
Методы, описанные здесь, обеспечивают необходимые подробные инструкции по использованию ImageJ количественно желатин деградации матрицы отнесены к отдельным клеткам в гетерогенной популяции или для всей группы клеток, опубликованной предыдущаяiously 6,28. Собственная программа также успешно использоваться для той же цели 5,25. В этом протоколе области деградации матрицы нормировать либо общая площадь клеток или общее количество клеток (ядер) в поле. Как правило, оба варианта для нормализации даст тот же результат (ELW, данные не показаны). Однако если в различных клеточных линиях, имеющих различные размеры клетки сравниваются, или если экспериментальное лечение заставляет клетки изменять размер, то она может быть более точной, чтобы нормализовать количество клеток. С другой стороны, многие клеточные линии рака имеют высокий процент мульти-ядерных клеток, в этом случае общая площадь ячейки может быть более точным параметром для нормализации. Кроме того, если только часть клетки, захваченных в изображении (рис. 6), может быть, лучше, чтобы нормализовать в ячейку области, а не недооценивать деградации потенциал для отдельной клетки. Это важно для оптимизации анализа изображений для лучшего костюмахарактеристики и нюансы конкретной экспериментальной установки.
Для определения количества клеток в переполненном поле, считая ядер часто методом выбора. ImageJ имеет плагин ядра счетчиков для автоматического подсчета. Один из вариантов этого инструмента является водоразделом фильтр. Этот фильтр поможет отдельных ядер, которые касаются путем разделения их на отдельные объекты (рис. 5Н, белая стрелка). Тем не менее, этот фильтр не может быть в состоянии отдельных ядер, которые перекрывают широко (рис. 5Н, красная стрелка). Кроме того, если ядро имеет неправильную форму и большие различия в интенсивности, фильтр может отделить одно ядро на несколько объектов (рис. 5Н, желтая стрелка). Поэтому, важно, чтобы попробовать различные методы пороговой и сглаживания в этом плагине, чтобы определить наилучшие параметры для анализа. Если автоматический подсчет не дает точных цифр, плагин ячейки счетчика может ВВСКИ litate руководство подсчета клеток или ядер.
В случае использования временной трансфекции, изображение будет часто содержат смесь клеток, экспрессирующих или не выражал интерес белка (рис. 6). В этом случае, это не всегда очевидно, какие клетки были ответственны за создание областях матрицы деградации. Это особенно верно, если клетки мигрируют через желатин. Чтобы быть последовательными в анализе, важно измерять только пострадавших районах, непосредственно под каждой ячейке. По пороговой для выбора темных областей в матрице и с помощью актина для создания ячейки очертания, только деградированных площадей под клетки будут количественно. Эта процедура позволит исключить деградированных территорий за пределами границ ячеек из анализа (рис. 6F, стрелка). Анализ может потребовать оптимизации, чтобы выбрать момент времени, что позволяет достаточно времени для деградации, прежде чем клетки имели возможность двигаться.
"> Многие методы были разработаны для количественного invadopodia формирование и функции. В дополнение к деградации матрице, другие часто сообщали параметры включают в себя определение количества invadopodia в клетку, процент клеток, воспроизводящих invadopodia в данной популяции, а количество" незрелых »или« до », не унижающее invadopodia по сравнению с« зрелых »invadopodia, способных разлагать ECM 11,13,25,26. метод (ы) выбор для invadopodia оценки зависят от врожденных особенностей каждого типа клеток. Например, подсчет количества invadopodia на ячейку или определения доли клеток, содержащих invadopodia является простой подход, который хорошо работает, если проанализировать клетки содержат всего несколько видных invadopodia, но и становится более трудным в клетках, которые имеют десятки invadopodia или там, где invadopodia может быть небольшим и их трудно обнаружить. Использование деградации анализ позволяет вычислить процент предварительного invadopodia Vс. зрелые invadopodia в одиночных камерах или в популяции, сравнивая общее количество клеток с invadopodia в процентах, унижающих матрицы. Если есть расхождение, где меньше клеток унижающие матрицы по сравнению с клетками отображения invadopodia, это может означать, что эти клетки формируют предварительные invadopodia, что были не в состоянии деградации матрице во время клетки фиксировали.Какой бы метод комбинации выбранных для анализа, важно количественно требуемые характеристики invadopodia как можно более объективно. При сборе изображений на микроскоп, выбрать поля, глядя на клетки (актин), а не флуоресцентных матрицу, чтобы избежать смещения от преимущественно выборе районах с высоким уровнем деградации. Многочисленные изображения должны быть приобретены для обеспечения справедливого представительства клеточной популяции. Изображения должны быть получены также и в соответствующем увеличении. Для равномерного популяций клеток, меньшее увеличение можетбыть использованы для сбора более ячеек тех пор, пока областей деградации все еще может быть решена. Высшее изображений увеличения предпочтительны для измерения площадей под отдельными клетками и решить отдельные invadopodia. Когда областях в настоящее время количественно, пороговой изображений на основе интенсивности является более объективным, чем вручную выбрать область матрицы для измерения. Во всех случаях, достаточное количество клеток из нескольких независимых экспериментов должны быть проанализированы, чтобы дать статистически значимым, воспроизводимые результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана благотворительные фонды из Университета Западной Вирджинии Мария Babb Randolph онкологический центр. Мы благодарим Susette Мюллер (Georgetown University) и Лора Келли для ранней консультации и помощь. Использование West Virginia University фонда изображений микроскопии (при поддержке Марии Babb Randolph онкологический центр и, NIH гранты RR16440 P20, P30 и P30 RR032138 GM103488) с благодарностью.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
