Summary
Nous décrivons la méthode prototype pour la fabrication des lamelles de microscope recouvertes de gélatine fluorescente pour visualiser dégradation de la matrice invadopodes médiation. Techniques de calcul à l'aide du logiciel disponible sont présentées pour quantifier les niveaux résultants de protéolyse de la matrice de cellules individuelles au sein d'une population mixte et des groupes pluricellulaires englobant ensemble des champs microscopiques.
Abstract
L'invasion cellulaire dans les tissus locaux est un processus important dans le développement et l'homéostasie. Malregulated invasion et le mouvement cellulaire ultérieur est caractéristique de plusieurs processus pathologiques, notamment l'inflammation, les maladies cardiovasculaires et la métastase des cellules tumorales 1. Dégradation protéolytique focalisée de la matrice extracellulaire (ECM) des composants de la membrane basale épithéliale ou endothéliale est une étape critique dans le lancement invasion cellulaire. Dans les cellules tumorales, en matière d'analyse in vitro a déterminé que la dégradation de l'ECM est accompli par ventrales structures membranaires riches en actine propulsion appelés invadopodes 2,3. Forme invadopodes en apposition étroite l'ECM, où ils modèrent répartition ECM grâce à l'action des métalloprotéases matricielles (MMP). La capacité des cellules tumorales à former invadopodes est directement corrélée avec la capacité d'envahir le stroma locale et ses composants vasculaires 3.
_content "> Visualisation de invadopodes médiation dégradation de la MEC des cellules par microscopie à fluorescence en utilisant des protéines de la matrice colorant marqués enduits sur des lamelles de verre s'est imposée comme la technique la plus répandue pour évaluer le degré de protéolyse de la matrice cellulaire et potentiel invasif 4,5. Ici, nous décrivons une version de la méthode standard pour générer des lamelles de verre à marquage fluorescent en utilisant un commerce Oregon Green-488 conjugué gélatine. Cette méthode est facilement mis à l'échelle pour produire rapidement un grand nombre de lamelles recouvertes. Nous montrons une partie des artefacts communs microscopiques qui sont souvent rencontrées au cours de cette procédure et comment ceux-ci peuvent être évités. Enfin, nous décrivons des méthodes normalisées au moyen de logiciels facilement disponibles pour permettre une quantification de la dégradation de la matrice de gélatine étiquetés médiée par des cellules individuelles et par l'ensemble des populations cellulaires. Les procédures décrites permettent de surveiller avec précision et de façon reproductible invadopodesactivité, et peuvent aussi servir de plateforme pour l'évaluation de l'efficacité de modulation de l'expression des protéines ou des tests anti-invasives composés sur la dégradation de la matrice extracellulaire dans des cadres uniques et multicellulaire.Protocol
1. Production d'Oregon Green 488-gélatine Lamelles couché
- Préparer un sans étiquette 5% (p / p) de bouillon de gélatine / solution de saccharose par addition de 1,25 g de gélatine et 1,25 g de saccharose dans du PBS pour un volume final de 50 ml. Réchauffer la solution de gélatine à 37 ° C et de s'assurer qu'il est entièrement fondu avant l'utilisation. Conservez le mélange final à 4 ° C.
- Nettoyer 13 mm de diamètre # 1 des lamelles de verre en plaçant une lamelle individuelle dans chaque puits d'une plaque à 24 puits tissu plastique de culture. Ajouter 500 ul d'acide nitrique à 20% à chaque puits et incuber pendant 30 min. Aspirer la solution d'acide nitrique et laver trois fois lamelles avec de l'eau déminéralisée.
- Manteau de lamelles avec 500 ul de 50 pg / ml de poly-L-lysine (préparé de 0,1% et solution mère diluée dans de l'eau déminéralisée) à chaque puits pendant 20 min à température ambiante. Aspirer la solution et laver trois fois avec du PBS. La poly-L-lysine revêtement facilite même revêtement et de collage de la recouvrant laBeled gélatine.
- Ajouter 500 ul de glutaraldéhyde à 0,5% (fait frais avant utilisation) dans chaque puits et incuber les plaques à 24 puits sur la glace pendant 15 min. Aspirer et laver trois fois avec du PBS froid. Assurez-vous d'enlever toute trace de PBS avant enrobage de gélatine. Conserver les plaques sur la glace durant tous les lavages jusqu'à ce que la gélatine est ajoutée.
- Reconstituer le vert Oregon 488-conjugué gélatine comme par le protocole du fabricant et le réchauffer et le sans étiquette 5% de gélatine solution de saccharose / à partir de (1,1) à 37 ° C. Diluer une partie Oregon Green 488 gélatine en huit parties de gélatine sans étiquette / saccharose (par exemple, 500 pi de Oregon Green 488 gélatine dans 4 ml de mélange de gélatine à 5%). Pipette 100 ul de la dilution 488-gélatine mélange (maintenue à 37 ° C) sur chaque lamelle, en utilisant suffisamment de gélatine pour enrober la lamelle sans étalement manuel (ce qui peut conduire à un revêtement lamelle inégale comme le montre la figure 3B). Il est important de garder à l'diluée 488-gélatine mélange à 37 °; C au cours de l'opération de revêtement pour empêcher la solidification prématurée. Partir de cette étape les lamelles doivent être maintenus dans l'obscurité autant que possible pour éviter photoblanchiment potentiel. D'autres protéines de la MEC conjugués à des fluorophores différents peuvent se substituer à la gélatine Oregon Green 488 (voir Discussion).
- Une fois que toutes les lamelles sont recouvertes d'une plaque unique, maintenez la plaque à 24 puits à un angle et retirer l'excès de gélatine de chaque puits par aspiration. Incuber lamelles enrobées dans l'obscurité pendant 10 min à température ambiante.
- Lavez les lamelles à trois reprises avec du PBS, puis ajouter 500 ul de fraîchement fait 5 borohydrure de sodium mg / ml (NaBH4) pendant 15 min à température ambiante afin de réduire et d'inactiver le glutaraldéhyde résiduel. Le borohydrure de sodium est en effervescence, et de petites bulles sera visible sur et autour de chaque lamelle.
- Retirer la solution de NaBH4 par aspiration avec un mouvement de balayage rapide autour de l'extérieur de chaque puits. Prenez soin de ne pas ramasser les lamelles flottantes qui se sont détachés du fond de la plaque de culture tissulaire au cours de NaBH4 traitement. Lamelles individuelles qui flottent au sommet peut être légèrement repoussée vers le bas bien, mais il faut prendre soin de ne pas endommager le revêtement de protéines. Lavez chaque puits trois fois avec du PBS puis incuber lamelles dans de l'éthanol à 70% pendant 30 min à température ambiante.
- En utilisant une technique stérile, transférer les plaques lamelle contenant un type IIA / B hotte à flux laminaire de culture cellulaire et rincer trois fois avec des lamelles de PBS stérile. À ce stade lamelles peuvent être stockés dans du PBS abri de la lumière à 4 ° C pendant au moins deux mois.
- Transfert des lamelles doit être utilisé pour des essais de dégradation d'un puits vide d'une nouvelle plaque à 24 puits par l'élimination soigneuse à l'aide d'une aiguille stérile et une pince. Equilibrer lamelles de 1-24 hr avec les médias complets adaptés au type de cellule spécifique en cours d'analyse. Des précautions doivent être prises pour ne paspour inverser la lamelle ou rayer le revêtement de gélatine (voir la figure 3B).
2. Placage et traitement des cellules sur Oregon Green 488-gélatine Lamelles enduits à dosage ECM dégradation
- 3-5x10 semences 4 cellules sur une lamelle dans chaque puits de la plaque à 24 puits.
- Mener une étude de cours à temps pour déterminer les temps optimaux nécessaires à l'activité de dégradation invadopodes pour la lignée cellulaire particulière / type d'intérêt. La plupart des cellules invasives nécessitent un temps entre 24.04 h pour la dégradation à se manifester, bien que cette plage peut varier considérablement et devrait être déterminée empiriquement. Pour synchroniser l'activité invadopodes, les cellules peuvent être traitées avec des inhibiteurs de MMP (par exemple, GM 6001) pour une période de temps désirée, puis laver l'inhibiteur de l'activité pour permettre invadopodes de procéder (par exemple, voir 6).
- Rincer lamelles trois fois avec PBS, puis fixer les cellules avec 500 pi de 10% tamponnée de formol phosphate pendant 15 min. Rincer trois fois avec du PBS et perméabiliser pendant 4 min avec 0,4% de Triton X-100 dans du PBS. Rincer trois fois avec du PBS pour éliminer le Triton X-100.
- Marquer les cellules en utilisant un protocole standard pour l'immunofluorescence (voir 7 par exemple) en co-marquage fluorescent des cellules avec la phalloïdine conjugué de visualiser les filaments d'actine (F-actine) et d'une protéine marqueur connu qui se localise à invadopodes (par exemple, cortactine 5, TKS5 8, ou N-WASP 9). souvenir d'éviter d'utiliser 488-anticorps secondaires marqués ou GFP protéines marquées à l'aide si Oregon Green 488 marqué au FITC ou la gélatine pour éviter les interférences.
- Montez lamelles colorées sur des lames de microscope en verre en prenant soin inversion de la lamelle et le placer sur une goutte de ProLong antifade d'or ou d'un réactif similaire.
- Pour évaluer dégradation de la matrice, les cellules d'image dans les canaux appropriés à l'aide d'un microscope fluorescent classique ou confocale. La dégradation de la gélatineest visualisée par des zones plus sombres sur la lamelle en raison de l'élimination protéolytique de la gélatine fluorescente (figure 4A). Marquage des cellules à l'actine et une protéine marqueur invadopodes permet la confirmation de invadopodes à des sites de dégradation de la matrice dans les images fusionnées (figure 4A).
- Activité de dégradation peuvent aussi être surveillées en temps réel par imagerie des cellules vivantes avec fluorescence taggés protéines recombinantes pour suivre la formation et de dégradation de la matrice invadopodes 5,10,11.
3. La quantification de la dégradation par la mesure de la gélatine fluorescente dégradation de la matrice normalisée
Cette analyse donne l'aire normalisée de dégradation de la matrice par rapport à la surface des cellules ou le nombre de cellules. Il est utile pour l'analyse des champs microscopiques entières de vue où plusieurs cellules sont présentes qui ont été collectivement traitées avec des facteurs de croissance, des siRNA ou des agents thérapeutiques. Pour cette analysis, des images recueillies à faible grossissement sont suffisants pour collecter efficacement des informations sur des populations de cellules.
- Ouvrez les images dans ImageJ 12. ImageJ pour la microscopie peuvent être téléchargés à partir http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- Vérifiez les informations d'échelle en choisissant la commande de menu "Analyze / Set Scale." Cette information sera automatiquement importée avec de nombreux formats de fichiers, ils peuvent être saisis manuellement si nécessaire. Mise à l'échelle appropriée est nécessaire pour rendre compte des mesures en microns plutôt que de pixels.
- Sélectionner les mesures appropriées pour suivre en choisissant «Analyser / Définir des mesures." Vérifiez la zone et limiter au Seuil.
- Calculer l'aire de la dégradation de l'image fluorescente utilisant la gélatine (figure 5A).
- Seuil de l'image ("image / Réglage / Seuil») pour régler la pi supérieure et inférieurevaleurs d'intensité xel pour sélectionner les zones de dégradation (surligné en rouge; figure 5B). Dans les images suivantes, utilisez le bouton Définir dans la fenêtre Seuil de fixer le seuil à toutes les images comme un moyen objectif de sélectionner la zone de dégradation.
- Dans certains cas, la lamelle peut ne pas être parfaitement plane lorsque les images sont acquises. Ce qui provoque l'intensité de la gélatine à changer dans l'image. Si cette variation crée des problèmes lors de seuillage de l'image, bonne pour l'éclairage inégal à travers la gélatine par soustraction du fond («Processus / Soustraire de fond") ou par filtration avec un filtre passe-bande («Processus / FFT / Bandpass Filter") ou un pseudo flatfield filtre («Processus / Filtres / Pseudo Flatfield") jusqu'à ce que l'intensité de fond est uniforme.
- Mesurer la surface de dégradation de la matrice («Analyse / Analyse particules»). Dans la fenêtre Analyser particules, choisissez une taille de particules> 0 pour supprimer le bruit de til sélection. Afficher Décrit pour identifier les régions d'intérêt (ROI). Vérifiez Résultats d'affichage et de montrer Résumer les mesures. Si le dessin a clairement souligné tous les domaines de la dégradation (figure 5C), copiez la mesure Secteur total dans un tableur. Si d'autres objets ont été sélectionnés (comme les débris), enregistrer seulement les domaines de la RIs pertinentes.
- Calculer l'aire de la cellule à l'aide teinté phalloïdine (F-actine) image (Figure 5D).
- Seuil de l'image ("image / Réglage / Seuil») pour régler les valeurs supérieures et inférieures d'intensité des pixels de telle sorte que les bords des cellules sont sélectionnées (surlignées en rouge; 5E figure). Dans les images suivantes, utilisez le bouton Définir dans la fenêtre Seuil de fixer le seuil à toutes les images comme un moyen objectif de sélectionner la zone de cellule.
- 10 Mesure de la surface des cellules ("Analyse / Analyse particules»). Dans le Parti Analysercles fenêtre, choisissez une taille de particules> 0 pour supprimer le bruit de la sélection. Afficher Décrit pour identifier les régions pour l'analyse (figure 5F). Vérifiez Résultats d'affichage et de résumer pour montrer mesures de surface. Ne pas vérifier comprennent des trous s'il ya des espaces entre les cellules d'une grappe de sorte que les pixels non sélectionnés dans la grappe ne sont pas incluses dans le calcul de la surface cellulaire. Cliquez sur OK.
- Copier les résultats surface pour les RIs pertinentes dans un tableur.
- Calculer l'aire de la dégradation de la gélatine par la superficie totale des cellules 13.
- Une autre approche serait de rapporter la zone de dégradation par rapport au nombre de cellules de comptage de noyaux (figure 5G). Cela est nécessaire si les manipulations de modifier la zone de la cellule entre les différents groupes de traitement par rapport. Comptage automatique fonctionne mieux si les noyaux sont bien séparés, uniforme en intensité et en rond. Compter automatiquement nuclei («Plugins / Analyse de particules / Compteur Nucleus"). Choisissez la taille des particules petites et plus fortes, une méthode de seuil et d'une méthode de lissage. Vérifiez Soustraire fond, Filtre bassin, ajouter des particules dans le Gestionnaire ROI et résumé Show (figure 5H).
- Si les noyaux se chevauchent largement ou ont une forme irrégulière ou de la texture, le comptage automatique peut ne pas produire un décompte précis (figure 5H, des flèches sur la droite). Dans ce cas, le comptage manuel peut être facilité en utilisant l'outil de compteur de cellules ("Plugins / Analyse de particules / Compteur de cellules"). Cela permet de garder comptent comme des cellules sont marquées pendant un comptage manuel (figure 5I).
- Copiez le nombre de cellules (noyaux) dans un tableur. Calculer l'aire de la dégradation par la gélatine nombre total de cellules.
4. La quantification de la dégradation des Fluorescent gélatine par des cellules individuelles dans une population mixte cellulaire Pour évaluer dégradation de la matrice résultant de cellules spécifiques dans une population à part des autres cellules dans le domaine (par exemple, transfectées par rapport à des cellules non transfectées), la procédure de l'article 3 peut être modifié pour mesurer la surface de la dégradation dans des cellules individuelles. Un canal supplémentaire fluorescente est nécessaire pour marquer les cellules transfectées. Dans ce cas, les images agrandissement supérieur et bien séparés les cellules sont plus faciles à quantifier.
- Vérifiez les informations d'échelle en choisissant la commande de menu "Analyze / Définit la balance». Sélectionner les mesures appropriées pour suivre en choisissant «Analyser / Définir des mesures." Vérifiez la zone et limiter au Seuil.
- Pour les cellules individuelles qui ne touchent pas, d'identifier chaque cellule en utilisant l'image de F-actine (figure 6A). Seuil de l'image (voir 3,9) (figure 6B). Il est important de saisir les bords des cellules, mais il peut y avoir trous à l'intérieur qui ne sont pas inclus dans le seuil. Utilisez les valeurs d'intensité à travers les mêmes images pour sélectionner les limites des cellules.
- Pour mesurer la surface des cellules, utilisez "Analyser / analyser des particules." Dans la fenêtre Analyser particules, choisissez une taille> 0 (pour éliminer le bruit) Contours Show, et vérifiez Résultats d'affichage, Ajouter à Manager et comportent des trous (pour enregistrer toute la zone à l'intérieur du contour). Cliquez sur OK et enregistrez la zone pour chaque cellule de la fenêtre des résultats.
- Identifier les cellules sont transfectées (figure 6C).
- Identifier les zones de dégradation en utilisant l'image fluorescente gélatine (figure 6D). Si nécessaire, filtrer l'image gélatine à même intensité de fond (voir 3.6). Seuil pour sélectionner les zones de dégradation, prenant note des réglages de seuil (figure 6E). Sur les images suivantes, utilisez ces mêmes valeurs d'intensité supérieure et inférieure (en utilisant le jeu debouton dans la fenêtre Seuil) pour une sélection objective des zones de dégradation.
- Mesurer les domaines de la dégradation dans les cellules. Sur l'image seuillée gélatine fluorescente, montrer un aperçu des cellules en sélectionnant ROI dans la fenêtre Gestionnaire ROI et sélectionner Mesure (figure 6F). Enregistrer les résultats et calculer l'aire normalisée de la dégradation / cellule ou zone de cellule.
5. Les résultats représentatifs
Le schéma d'ensemble de la procédure est représentée sur la figure 1. La procédure implique la préparation de lamelles de verre et le revêtement de fluorescence conjugué gélatine, le placage de cellules sur les lamelles de revêtement pour permettre aux cellules de dégrader la gélatine, de fixation et de marquage des cellules pour analyse au microscope à fluorescence, l'imagerie de la matrice fluorescente pour évaluer l'intégrité de matrice, et la quantification objective du degré de dégradation de la matrice de gélatine en utilisant l'ordinateur software.
Figure 1. Schéma global mettant en évidence les principales étapes de revêtement fluorescent placage cellule de gélatine, en fixant et immunomarquage, et évaluation de la protéolyse de la matrice.
Les principales étapes de la procédure de préparation et de lamelles de verre de revêtement sont décrits dans la figure 2.
Figure 2. Schéma montrant les différentes étapes de la préparation des lamelles de verre pour le revêtement de matrice de gélatine. Étapes effectuées à la lumière (ampoule allumée), sur la glace (cubes) et dans le noir (non lumineux ampoule) sont indiquées bande dessinée. Étapes effectuées dans l'aide sombre éviter photoblanchiment des matrices fluorescentes.
Lorsqu'il est correctement effectuée, lamelles sont uniformément recouvert de Oregon Green 488-conjugué gelatin, affichant une fluorescence homogène lorsque visualisé par microscopie (figure 3A). Artefacts typiques qui peuvent survenir suite à une mauvaise revêtement, la manutention, le stockage et l'utilisation de lamelles recouvertes sont présentés dans la figure 3B.
Exemples Figure 3. D'artefacts rencontrés lors de la préparation lamelle enduite de gélatine et de manutention. A. Vue orthogonale d'un confocale z-pile montrant la couleur typique et la cohérence d'un vert Oregon 488-conjugué lamelle gélatine revêtu produit en utilisant le protocole prescrit. Lamelles couvre devrait avoir un revêtement homogène ~ 1-2 microns d'épaisseur comme indiqué dans le XZ (en bas) et YZ (à droite) avions confocale Artefacts B. qui peuvent survenir lors de l'enduction et le traitement des lamelles recouvertes de gélatine comprennent:. Couverture inadéquate de la lamelle pendant le processus de revêtement en raisonà un mauvais mélange, la solidification étalement manuel ou partielle du mélange de gélatine (revêtement irrégulier), l'enlèvement de la matrice de revêtement en marquant avec des aiguilles ou des pinces lors de la manutention (gratter), le séchage de la surface de la lamelle pendant les périodes de stockage prolongées, entraînant un pavé " "apparence (déshydraté) et de photoblanchiment de la surface de la gélatine lors de l'imagerie fluorescente due à une exposition prolongée ou intensité lumineuse élevée (blanchiment). Flèche blanche indique la zone englobant une tête blanchie OSC19 plaqué et carcinome épidermoïde du cou. L'Oregon Green 488-conjugué gélatine est pseudocolored blanc pour accentuer le contraste d'image. Bar, 10 pm.
Les matrices résultantes minces produites au cours de cette procédure fournir un moyen sensible pour évaluer la capacité des cellules à se dégrader ECM. La figure 4 montre un exemple d'activité invadopodes partir d'une cellule OSC19 étalées sur un Oregon Green-488 conjugué lamelle de gélatineet imagée par microscopie confocale classique aussi bien que par le volume de remplissage de rendu d'image suivant trois dimensions déconvolution.
Figure 4. Exemples représentatifs de l'activité invadopodes dégradation de la matrice. A. Visualisation des invadopodes et correspondant protéolyse de la matrice de gélatine. OSC19 cellules étalées sur Oregon Green 488-conjugués lamelles de gélatine pour 10 heures ont été fixées et marquées avec de la rhodamine-phalloïdine conjugué (F-actine) et d'anticorps anti-cortactine (visualisée avec un Alexa Fluor 647 anticorps secondaire et pseudocolored vert). Invadopodes sont évidents comme focaux concentrations cytoplasmiques de F-actine et cortactine qui chevauchent les domaines de la gélatine de compensation (trous sombres dans la matrice) dans l'image fusionnée. Régions encadrées contenant des pointes de flèche indiquent invadopodes individuel et les zones de protéolyse de la matrice focale comme indiqué dans le re élargierégions ci-dessous. Bar, 10 pm. B. Volume remplir la visualisation de pénétration invadopodes dans l'ECM. OSC19 cellules plaqué et colorées comme dans (A) ont été restitué visuellement par l'obtention de 23 um optiques successifs 0,32 z tranches totalisant 7,04 um pour la rhodamine-phalloïdine conjugué et Oregon Green 488-conjugué gélatine. Le fichier LSM natif fixé pour chaque canal a été ouvert en AutoQuant X2.2 logiciel et une déconvolution aveugle 3D de chaque pile d'images a été réalisée en utilisant les paramètres recommandés (10 itérations, le bruit moyen). Les images traitées ont été enregistrées comme des piles TIFF qui ont ensuite été ouverts dans les Éléments des NEI et affichée comme un volume avec vue alpha blending. Les LUT ont été ajustés, et un sous-volume a été créé pour montrer un bord intérieur de la cellule où invadopodes sont présents. Dorsale de pointe démontre vue invadopodes (rouge, flèches) inséré dans le sous-jacent de gélatine (vert). Ventrale de pointe vue montre invadopodes protrusion et de la dégradation des zones de gélatine sous la lamellecomme des régions présent rouge dans la matrice verte (flèches). Le champ de l'image est recadrée total présenté à 77 x 65 um, la cellule est d'environ 60 x 40 um.
La figure 5 montre quelques-unes des étapes importantes pour la quantification de la dégradation de la matrice normalisée de la gélatine comme décrit à l'étape 3 du protocole. Cette procédure est conçue pour permettre une quantification objective de la dégradation de la gélatine dans un champ de vision, et est adapté pour dégradation de la matrice attribué à de nombreuses cellules dans le champ.
Images Figure 5. De capture d'écran montrant les principales étapes de calcul assisté par la quantification de la dégradation de la gélatine normalisées pour les cellules à l'intérieur d'une image entière microscopique tel que décrit à l'étape du protocole 3. Toutes les images fluorescentes ont été converties en niveaux de gris pour mieux afficher le seuillage rouge et marquages retour sur investissement. A. Iml'âge de l'Oregon Green 488 conjugué à la gélatine, montrant les zones sombres ("trous") où la dégradation a eu lieu (étape 3.4). B. seuillée l'image gélatine mettant en évidence les zones de dégradation en rouge (étape 3.5). Dessin C. montrant ROI mesurée pour la zone de dégradation (étape 3,7). D. Rhodamine phalloïdine coloration de la F-actine (étape 3,8). E. seuillée d'image mettant en évidence l'actine cellulaire totale en zone rouge (étape 3,9). schéma montrant F. zones de cellules à mesurer (étape 3,10) . G. images de noyaux de cellules DAPI teinté (étape 3.13). H. Rouge présente les résultats montrent des noyaux de comptage automatique (étape 3.13). Le filtre du bassin versant a le potentiel de noyaux séparés qui se touchent (flèche blanche). Si les noyaux se chevauchent largement, ils ne peuvent être séparés en différents objets (flèche rouge). Si un noyau a une forme irrégulière, il peut être séparé en plusieurs objets (flèche jaune). I. </ Strong> Résultats de marquage des noyaux au cours d'un comptage manuel en utilisant l'outil de compteur de cellules (étape 3.14).
Figure 6. démontre les étapes de sélection impliqués dans la dégradation de la gélatine fluorescente quantifier par des cellules individuelles dans une population mixte cellulaire comme décrit à l'étape du protocole 4. Ici, la dégradation de la matrice par des cellules transfectées peuvent être analysées dans une population mixte de cellules transfectées et non transfectées.
Figure 6. Capture d'écran des images d'étapes impliquées dans la dégradation de la gélatine à partir de quantification individuelles cellules transfectées sein d'une population de cellules. Quantification d'une seule cellule transfectée surexprimant cortactine OSC19 recombinante fusionnée à l'étiquette d'épitope FLAG est montré comme un exemple. Toutes les images fluorescentes ont été converties en niveaux de gris pour mieux afficher le seuillage rouge et marquages jaunes ROI. A. B. zone cellulaire totale basée sur la F-actine coloration après l'application du seuil et Analyser des fonctions Particules (étape 4.2-3). C. confocal l'image des anti-FLAG immunomarquage de la population de cellules démontrant une seule cellule exprimant FLAG-étiqueté cortactine (marqués par un *) (étape 4.4). D. Image de l'Oregon Green 488-conjugué gélatine, montrant les zones sombres ("trous") où la dégradation a eu lieu (étape 4.5) E. seuillée l'image gélatine soulignant les zones sombres de la dégradation en rouge (étape 4.5). F. seuillée superposition d'images avec des contours cellulaires gélatine à partir du panneau B (étape 4.6). Notez que seuls les pixels seuillées dans les grandes cellules sont comptées dans l'analyse. Les zones de dégradation en dehors de l'emplacement de cellule actuelle (flèche blanche) résultent de la migration des cellules dans les feuilles de gélatine dans le temps et ne sont pas included dans l'analyse.
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Discussion
La possibilité de visualiser les cellules dégradant la matrice extracellulaire a aidé à découvrir les mécanismes moléculaires utilisés dans les étapes précoces de l'invasion cellulaire. Mis au point par Wen-Chen Tien dans le début des années 1980 4,14,15, revêtement marquées par fluorescence des protéines extracellulaires sur des lamelles de verre pour analyse microscopique ultérieur est apparue comme la principale technique dans l'évaluation de la fonction invadopodes dans un large éventail de types de cellules. Le protocole prescrit illustre la méthode de base utilisée pour la préparation des lamelles recouvertes de gélatine qui forment une couche de collagène moins de 2 microns d'épaisseur adaptée à la détection de la dégradation de la matrice extracellulaire par les cellules les plus classiques microscopes à fluorescence et confocale 11,16-18, similaires à ce qui a été décrit précédemment 19-21. Ces propriétés permettent de produire rapidement des lamelles recouvertes capables de détecter l'apparition initiale de dégradation de la matrice. La sensibilité offerte par ee mince résultant matrice de gélatine dures sous-jacentes sur les aides de surface de verre susceptibles de favoriser la formation invadopodes en réponse à la rigidité intrinsèque du milieu matrice globale 22. Cependant, ces matrices ne sont pas bien adaptée à l'analyse de l'allongement invadopodes ou supplémentaires évaluation morphologique qui a été réalisé en utilisant épais (30-100 um) couches de gélatine avec une méthodologie similaire, transwells enrobés ou microscopie électronique 20,23,24.
Nous avons constaté que les pré-conjugué produit commercialement Oregon Green 488 gélatine permet de dispositif expérimental rapide et des résultats cohérents et reproductibles. Cependant, la conjugaison de borate alcalin de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) à la gélatine sans étiquette demeure une méthode populaire et bon marché pour produire fluorescents conjugués de gélatine 20. La fibronectine est également utilisé comme une protéine de la matrice alternative pour l'étiquetage et la lamelle revêtement 4,9, et dans certains cas,investigateurs ont utilisé la fibronectine marquée en couches sur des lamelles recouvertes de gélatine sans étiquette pour créer des matrices denses 11,25. D'autres matrices peuvent être utilisées, en fonction des spécificités du type de cellule. En plus des colorants dans le Green 488 nm du spectre, une large gamme de fluorophores ont également été utilisés avec des méthodes de couplage manuel de générer des lamelles avec des spectres de fluorescence différente, y compris la rhodamine 21,26, Alexa Fluor 350 24, 546 21, 568 5,11 , 594 27 et 647 5 colorants. De tels conjugués sont facilement adaptables pour une utilisation dans le protocole prescrit, en offrant la souplesse pour l'utilisation des protéines spécifiques ECM colorant combinaisons appropriées de jeu de toute l'imagerie filtre plus.
Les techniques décrites ici indiquent les étapes détaillées nécessaires pour utiliser ImageJ pour quantifier la dégradation de matrice de gélatine attribués à des cellules individuelles dans une population hétérogène de cellules ou à des groupes entiers telle que publiée diffiously 6,28. Le logiciel propriétaire a également été utilisée avec succès dans le même but 5,25. Dans ce protocole, la zone de dégradation de la matrice est normalisée par rapport à la surface totale, soit des cellules ou le nombre total de cellules (noyaux) dans le champ. En règle générale, les deux options pour la normalisation donnera le même résultat (ELW, données non présentées). Toutefois, si différentes lignées cellulaires ayant des cellules de taille sont comparés ou si le traitement expérimental provoque des cellules pour modifier la taille, il peut être plus précis pour normaliser au nombre de cellules. D'un autre côté, de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses ont un pourcentage élevé de multi-nucléés, dans ce cas, zone cellulaire total peut être un paramètre plus précis pour la normalisation. En outre, si une partie seulement d'une cellule est capturé dans une image (figure 6), il peut être préférable de normaliser la zone de la cellule plutôt que de sous-estimer le potentiel de dégradation d'une cellule individuelle. Il est important d'optimiser l'analyse d'image pour le meilleur costumeles caractéristiques et les nuances de l'installation expérimentale spécifique.
Pour déterminer le nombre de cellules dans un domaine encombré, le comptage des noyaux est souvent la méthode de choix. ImageJ est un plugin compteur de noyaux de comptage automatique. Une option de cet outil est le filtre du bassin versant. Ce filtre vous aidera noyaux séparés qui se touchent en les isolant dans des objets individuels (figure 5H, flèche blanche). Cependant, ce filtre peut ne pas être en mesure de noyaux séparés qui se chevauchent largement (figure 5H, flèche rouge). En outre, si un noyau a une forme irrégulière et de grandes variations de l'intensité, le filtre peut séparer un noyau unique en plusieurs objets (figure 5H, flèche jaune). Par conséquent, il est important d'essayer différentes méthodes de seuillage et de lissage de ce plugin pour déterminer les meilleurs paramètres pour l'analyse. Si le comptage automatique ne produisent pas de chiffres précis, le plugin compteur de cellules peut faci litate comptage manuel des cellules ou de noyaux.
Dans ce cas en utilisant la transfection transitoire, les images contiennent souvent un mélange de cellules exprimant ou n'exprimant pas une protéine d'intérêt (figure 6). Dans ce scénario, il n'est pas toujours évident dont les cellules ont été responsables de la création de zones de dégradation de la matrice. Cela est particulièrement vrai si les cellules migrent à travers la gélatine. Pour être cohérent dans l'analyse, il est important de mesurer que les zones dégradées directement en dessous de chaque cellule. Par seuillage pour sélectionner les zones sombres dans la matrice et en utilisant l'actine pour produire des contours cellulaires, seules les zones dégradées dans les cellules seront quantifiées. Cette procédure va exclure les zones dégradées en dehors des limites de la cellule de l'analyse (figure 6F, flèche). L'essai peut exiger d'optimisation pour sélectionner un point dans le temps qui laisse suffisamment de temps pour la dégradation avant que les cellules aient eu une chance de se déplacer.
"De nombreuses méthodes> ont été développées pour quantifier la formation invadopodes et la fonction. En plus de dégradation de la matrice, d'autres paramètres fréquemment signalés comprennent la détermination du nombre de invadopodes par cellule, le pourcentage de cellules présentant invadopodes dans une population donnée, et le nombre de« immature »ou« pré »non dégradantes invadopodes par rapport à« mature »capables de dégrader l'ECM 11,13,25,26 invadopodes. La méthode (s) de choix pour invadopodes évaluation dépendent des caractéristiques propres à chaque type de cellule. Par exemple, compter le nombre de invadopodes par cellule ou la détermination du pourcentage de cellules contenant invadopodes est une approche simple qui fonctionne bien si les cellules analysées contiennent juste un peu invadopodes important, mais devient plus difficile dans les cellules qui ont des dizaines de invadopodes ou lorsque invadopodes peut-être petit et difficiles à détecter. utilisant le dosage dégradation permet de calculer le pourcentage de pré-invadopodes vs. invadopodes matures dans des cellules individuelles ou dans une population en comparant le nombre total de cellules avec invadopodes au pourcentage que représente la matrice sont dégradants. S'il ya un écart, où moins de cellules sont dégradants matrice par rapport à des cellules présentant invadopodes, cela peut indiquer que ces cellules forment des pré-invadopodes qui étaient incapables de dégradation de la matrice au moment où les cellules ont été fixées.Quelle que soit la combinaison de la méthode choisie pour l'analyse, il est important de quantifier les caractéristiques souhaitées invadopodes aussi objectivement que possible. Lors de la collecte des images sur le microscope, choisir les champs en consultant d'actine des cellules (), plutôt que la matrice fluorescente, pour éviter les biais de sélection des zones de préférence avec des niveaux élevés de dégradation. Plusieurs images doivent être acquises pour assurer une représentation équitable de la population cellulaire. Les images doivent aussi être acquise à un grossissement approprié. Pour les populations uniformes de cellules, faible grossissement peutêtre utilisé pour recueillir davantage de cellules tant que les zones de dégradation peuvent encore être résolus. Images agrandies plus élevés sont préférables pour mesurer les zones relevant des cellules individuelles et de résoudre invadopodes individu. Lorsque zones est quantifiée, sur la base d'un seuil d'intensité des images est plus objectif de choisir manuellement la zone de la matrice de mesure. Dans tous les cas, un nombre suffisant de cellules provenant de plusieurs expériences indépendantes devraient être analysées pour donner statistiquement significatives, des résultats reproductibles.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds de dotation de l'Université West Virginia Mary Babb Randolph Cancer Center. Nous remercions Susette Mueller (Georgetown University) et Laura Kelley pour obtenir des conseils et de l'aide au début. L'utilisation de la facilité de West Virginia University Imaging Microscopy (soutenu par le Mary Babb Randolph Cancer Center, et des subventions du NIH P20 RR16440, P30 et P30 RR032138 GM103488) est grandement appréciée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
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