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Biology

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

doi: 10.3791/4119 Published: August 27, 2012

Summary

우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.

Abstract

지역 조직에 세포 침공은 개발과 항상성에서 중요한 과정입니다. Malregulated 침공과 이후의 세포 운동은 염증, 심장 혈관 질환과 종양 세포 전이 등 여러 가지 병적 인 프로세스의 특징입니다. 상피 또는 내피 지하 막에서 세포 외 기질 (ECM)의 구성 요소 Focalized proteolytic 저하는 세포 침공을 시작으로 중요한 단계입니다. 종양 세포에서 체외 분석에 광범위한는 ECM 저하가 invadopodia 2,3를 칭했다 복부 고를 풍부한 막 밀어내는 구조에 의해 수행되는 결정을 내 렸습니다. 그들은 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)의 행동을 통해 ECM 분석을 검토 ECM에 가까운 동격의 Invadopodia 양식. invadopodia을 형성하는 종양 세포의 능력은 바로 지역의 기질 및 관련 혈관 구성 요소를 3으로 침입 할 수있는 능력과 함께 연결합니다.

_content는 "유리 coverslips에 코팅 염료 표시 매트릭스 단백질을 사용하여 형광 현미경에 의한 세포의 invadopodia로 인한 ECM 저하의> 시각화는 매트릭스 proteolysis 및 셀룰러 침해 가능성 4,5의 정도를 평가하기위한 가장 널리 기술로 떠오르고있다. 여기에 언급 된 상업적으로 이용 가능한 오레곤 그린 - 488 젤라틴의 공액을 활용 휘황 라벨이 표시된 유리 coverslips을 생성하기위한 표준 방법의 버전입니다.이 방법은 쉽게 빠르게 코팅 coverslips 많은 수의 생산 조정됩니다. 우리는 흔히 발생하는 일반적인 미세 유물의 일부를 보여 이 절차를 수행하는 동안 얼마나 이것들은 방지 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 개별 셀 의해 전체 휴대폰 인구에 의해 중재 표시 젤라틴 매트릭스 저하의 정량화 할 수 있도록 즉시 사용할 수 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 표준화 된 방법을 설명합니다. 설명 절차는 정확하고 reproducibly 모니터링 할 수있는 기능을 제공 invadopodia활동, 또한 변조 단백질의 발현 또는 단일 및 다세포 설정에서 세포 외 기질 저하에 반 침해 화합물의 테스트의 효능을 평가하기위한 플랫폼으로 제공 할 수 있습니다.

Protocol

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1. 오레곤 그린 생산은 488 - 젤라틴 코팅 Coverslips

  1. 1.25 g 젤라틴 50 ML의 최종 볼륨에 PBS에 1.25 g의 자당을 추가하여 레이블이 지정되지 않은 5% (w / w) 주식 젤라틴 / 자당 솔루션을 준비합니다. 37 ° C에 주식 젤라틴 용액을 따뜻하게하고는 완전히 사용하기 전에 녹을 확인합니다. 4 ° C.에서 최종 혼합물을 저장
  2. 24 잘 플라스틱 조직 배양 플레이트의 각도에 개인 coverslip을 배치하여 13mm 직경 # 1 유리 coverslips를 청소합니다. 각도 20 % 질산 500 μl를 추가하고 30 분에 품다. 질산 솔루션을 기음과 탈 이온수로 coverslips을 세 번 씻는다.
  3. 실온에서 20 분 각도 50 μg / ML 폴리-L-라이신 (0.1 % 주식 솔루션에서 준비 탈 이온수에 희석) 500 μl와 코트의 coverslips. 솔루션을 기음과 PBS로 세 번 씻어. 폴리-L-라이신 코팅 놓인 라의도 코팅과 결합을 용이하게젤라틴을 beled.
  4. 각도에 0.5 % 글 루타 알데히드 500 μl를 (사용하기 전에 신선한 만든) 추가하고 15 분을위한 얼음에 24 잘 접시를 품다. 기음과 차가운 PBS로 세 번 씻어. 젤라틴 코팅하기 전에 PBS의 모든 흔적을 제거해야합니다. 젤라틴이 추가 될 때까지 모든 세차 동안 얼음 판세요.
  5. Reconstitute 37 ° C.까지의 당 제조업체의 프로토콜과를 따뜻하게하고 라벨이없는 5% 젤라틴 / 자당 솔루션 (1.1)과 같은 젤라틴 오레곤 그린 488 - 복합 라벨이없는 젤라틴 / 자당 중 여덟 부분 (; 5퍼센트 젤라틴 혼합물의 4 ML에 오레곤 그린 488 젤라틴 500 μl 예)에 한 부분 오레곤 그린 488 젤라틴을 희석. 수동 확산 (그림 3B와 같이 이는 울퉁불퉁 coverslip 코팅 될 수 있습니다)없이 코트 coverslip을 할 수있을만큼 젤라틴 사용하여 각 coverslip 위에 희석 488 - 젤라틴 혼합물 (37 ° C에서 보관)의 Pipet 100 μl. 그것은 37에 희석 488 - 젤라틴 혼합물을 유지하는 것이 중요합니다 °, 조기 응고를 방지하기 위해 코팅 절차를 수행하는 동안 C. 앞으로이 단계에서 coverslips는 잠재적 인 photobleaching을 피하기 위해 최대한 어둠 속에서 보관해야합니다. 다른 fluorophores에 복합 다른 ECM 단백질은 오레곤 그린 488 젤라틴 (토론 참조) 대체 할 수 있습니다.
  6. 모든 coverslips는 단일 플레이트에 코팅되면, 각도 24도 판을 열고, 진공 흡인하여 각 우물에서 초과 젤라틴을 제거합니다. 실온에서 10 분 동안 어둠 속에서 코팅 coverslips을 품다.
  7. coverslips에게 PBS로 세 번 씻어 후 잔류 글 루타 알데히드을 절감하고 비활성화 할 수 실온에서 15 분을위한 갓 만든 5 MG / ML 나트륨 borohydride (NaBH 4) 500 μl를 추가합니다. 나트륨 borohydride는 발포이며, 작은 거품은 각 coverslip와 주변 분명 될 것입니다.
  8. 각도의 바깥 주위에 빠른 한눈에 모션과 진공 흡인에 의해 NaBH 4 솔루션을 제거. NaBH 4 치료 기간 동안 조직 배양 플레이트의 하단에서 분리 된 모든 부동 coverslips을 데리러 않도록주의보십시오. 상단에 떠있는 단독 coverslips는 부드럽게 잘 아래로 내려 푸시 될 수 있지만주의 단백질 코팅 손상을 방지하기 위해 이동해야합니다. PBS 각도 세 번 씻어 후 상온에서 30 분에 70 %의 에탄올에 coverslips을 품다.
  9. 멸균 기술 사용 유형 IIA / B 세포 배양 층류 후드에 coverslip 함유 접시를 전송하고 멸균 PBS로 c​​overslips을 세 번 씻어. 이 시점에서 coverslips은 적어도 두 달 동안 4에 빛으로부터 보호 PBS ° C에 저장할 수 있습니다.
  10. 멸균 바늘과 집게를 사용하여 조심 제거하여 새 24 잘 접시의 빈 우물 열화 assays에 사용한다 coverslips을 전송합니다. 전체 미디어 assayed되는 특정 세포 유형에 맞는과 1-24 시간에 coverslips을 평형. 주의하지 않도록해야합니다coverslip로 바꾸거나 (그림 3B 참조) 젤라틴 코팅을 긁어합니다.

2. 검정 ECM 저하에 오레곤 그린에 도금 및 세포의 처리 488 - 젤라틴 코팅 Coverslips

  1. 24 잘 플레이트의 각도에서 coverslip 위에 씨앗 3 - 5x10 4 셀.
  2. 특정 셀 라인 / 관심 유형에 대한 invadopodia 저하 활동에 필요한 최적의 시간을 결정하기 위해 시간 코스 연구를 실시하고 있습니다. 대부분의 침입 세포는이 범위가 다양 할 수 있으며 경험적으로 결정해야하지만 저하에 대해 4-24 H 사이의 시간이 명백해질해야합니다. invadopodia 활동을 동기화하려면 셀이 원하는 기간에 대한 MMP 억제제 (예를 들어, GM 6,001)로 처리 할 수 있습니다 다음 (예를 들어, 6 참조) invadopodia 활동을 진행 할 수 있도록 억제제를 씻어.
  3. coverslips에게 PBS로 세 번 씻어 후 10 %의 500 μl로 세포를 고정 포르말린 phospha 버퍼15 분에 테. PBS로 세 번 씻어 0.4 % 튼과 4 분 PBS에서 X-100 permeabilize. 트리톤 X-100을 제거하는 PBS로 세 번 씻어.
  4. cortactin 5, TKS5, 고를의 필라멘트 (F-고를) 시각화하고 invadopodia에 localizes 알려진 마커 단백질에 대한 (예 할 형광 복합 phalloidin와 공동 라벨 세포에 의해 immunofluorescence 얼룩에 대한 표준 프로토콜 (예를 들면 7 참조)을 사용하여 레이블 셀 8 또는 N-WASP 9). 오레곤 그린 488 또는 신호 간섭을 방지하기 위해 젤라틴 FITC-라벨을 사용하는 경우 488-라벨 차 항체 또는 GFP-라벨 단백질을 사용하지 마십시오해야합니다.
  5. 신중하게 반전 coverslip에 의해 유리 현미경 슬라이드로 스테인드 coverslips를 탑재과 골드 antifade 또는 이와 유사한 시약을 연장 한 방울에 설치.
  6. 종래의 형광 또는 공 촛점 현미경을 사용하여 적절한 채널에 매트릭스 저하, 이미지 셀을 평가합니다. 젤라틴 저하형광 젤라틴의 proteolytic 제거 (그림 4A)에 의해 coverslip에 어두운 지역으로 시각화합니다. 고를 및 invadopodia 마커 단백질에 대한 세포의 라벨을 지정하면 병합 이미지의 매트릭스 저하의 사이트 (그림 4A)에서 invadopodia을 확인 할 수 있습니다.
  7. 열화 활동도 invadopodia 형성과 매트릭스 저하 5,10,11을 추적하는 형광 태그 재조합 단백질과 라이브 셀 이미징에 의해 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.

3. 정규화 된 매트릭스 저하를 측정하여 형광 젤리 저하의 정량화

이 분석은 세포의 지역 또는 셀의 수를 기준으로 매트릭스 저하의 정규화 된 영역을 제공합니다. 그것은 여러 세포가 총체적으로 siRNA, 성장 요인이나 치료 요원과 치료 된 것으로 존재 뷰의 전체 미세 분야를 분석하는 데 유용합니다. 이 analysi에 대한초, 낮은 배율에서 수집 이미지를 효율적으로 세포의 인구에 대한 정보를 수집하기에 충분합니다.

  1. ImageJ 12 이미지를 엽니 다. 현미경에 대한 ImageJ은에서 다운로드 할 수 있습니다 http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
  2. "규모를 설정 / 분석."이 정보는 다양한 파일 형식을 자동으로 가져옵니다 메뉴 명령을 선택하여 규모의 정보를 확인하지만, 필요할 경우 수동으로 입력 할 수 있습니다. 적절한 스케일링 오히려 픽셀보다 미크론에서 측정을 신고 할 필요가 있습니다.
  3. 선택하여 추적 할 수있는 적절한 측정을 선택하고 '설정 / 분석 측정을. " 지역을 선택하고 임계 값을 초과 할 수 없습니다.
  4. 형광 젤라틴 이미지 (그림 5A)를 사용하여 저하의 면적을 계산합니다.
  5. 임계 값 이미지 ( "이미지 / 액 / 조정") 상부 및 하부 파이를 설정하는 방법xel 강도 값은 저하의 영역을 (; 그림 5B 빨간색으로 강조)을 선택합니다. 다음 이미지에서, 목표는 열화 영역을 선택 수단으로 모든 이미지에 대해 동일한 임계 값을 설정하려면 임계 값 창에서 설정 버튼을 사용하십시오.
  6. 이미지가 인수하는 경우 어떤 경우에는, coverslip 완벽하게 평면되지 않을 수 있습니다. 이 이미지에서 변경 젤라틴의 강도가 발생합니다. 배경을 차감하여 젤라틴에서 고르지 조명에 대한 정확한 이미지 ( "프로세스 / 배경을 제거") 또는 대역 통과 필터로 필터링하여 ( "공정 / FFT / 밴드 패스 필터") 또는 의사 flatfield을 임계 값 때이 변화는 문제가 발생하는 경우 필터 ( "공정 / 필터 / 의사 Flatfield")의 배경 농도가 균일 할 때까지.
  7. 매트릭스 저하 ( "입자를 분석 / 분석")의 영역을 측정합니다. 분석 입자 창에서 t에서 잡음을 제거하는 입자 크기주세요> 0을 선택그는 선택합니다. 쇼는 관심 영역 (ROIs)을 식별 할 설명합니다. 디스플레이 결과를 확인하고 측정을 표시 할 요약. 그림이 특별히 저하 등의 분야 (그림 5C)을 설명 한 경우 스프레드 시트로 총 면적 측정을 복사합니다. 다른 개체 (예 파편 등)을 선택 된 경우, 해당 ROIs 만 영역을 기록합니다.
  8. phalloidin 스테인드 (F-고를) 이미지를 (그림 5D)를 사용하여 셀 영역을 계산합니다.
  9. 임계 값 셀의 가장자리가 (빨간색으로 강조, 그림 5E 호야)을 선택되도록 상부 및 하부 픽셀 강도 값을 설정하는 이미지 ( "이미지 / 조정 / 임계 값"). 다음 이미지에서, 목표는 셀 영역을 선택 수단으로 모든 이미지에 대해 동일한 임계 값을 설정하려면 임계 값 창에서 설정 버튼을 사용하십시오.
  10. 10 측정 셀의 영역 ( "입자를 분석 / 분석"). 분석 이상적 상대에cles 창, 선택에서 소음을 제거하기 위해 입자 크기주세요> 0을 선택합니다. 쇼는 분석 (그림 5 층)의 영역을 식별 할 개요. 디스플레이 결과를 확인하고 지역의 측정을 표시 할 요약. 클러스터 내에서 선택되지 않은 픽셀 셀 영역 계산에 포함되지 않습니다 있도록 클러스터의 세포 사이에 공백이있는 경우 구멍을 포함 체크하지 마십시오. OK를 선택합니다.
  11. 스프레드 시트에 관련 ROIs에 대한 지역 결과를 복사합니다.
  12. (13)의 총 면적 당 젤라틴 저하의 면적을 계산합니다.
  13. 다른 접근 방식은 핵 (그림 5G)를 계산에서 셀의 개수에 따라 저하의 영역을보고하는 것이다. 조작이 다른 비교 치료 그룹 사이의 셀 영역을 변경하는 경우이 필요합니다. 핵이 잘 강도 및 라운드에서 유니폼을 분리하는 경우 자동 계산가 최상의 상태로 작동합니다. 자동 nucle를 계산내가 ( "플러그인 / 입자 분석 / 핵 카운터"). 최소 및 최대 입자 크기, 임계 값 방법과 케어 방법을 선택합니다. 투자 수익 (ROI) 관리자표시 요약 (그림 5H)로 입자를 추가, 배경 유역 필터를 빼기 확인합니다.
  14. 핵이 광범위하게 중복되거나 불규칙한 모양이나 질감이있는 경우, 자동 계산 정확한 숫자는 (그림 5H, 오른쪽에있는 화살표)을 생성 할 수 없습니다. 이 경우, 수동 계수는 ( "플러그인 / 입자 분석 / 셀 카운터") 셀 카운터 도구를 사용하여 용이하게 할 수 있습니다. 세포가 수동 카운트 (그림 5I)에 표시됩니다으로이 카운트를 유지합니다.
  15. 스프레드 시트에 셀의 수 (핵)를 복사합니다. 셀의 총 당 젤라틴 저하의 면적을 계산합니다.

4. 혼합 세포 인구의 개별 셀의 형광 젤리 저하의 정량화 떨어져 분야에서 다른 세포 (예, 비 transfected 세포 비해 transfected)에서 인구의 특정 세포에 의한 매트릭스 저하를 평가하기 위해 제 3의 절차는 개별 셀에 따라 저하의 영역을 측정하기 위해 수정할 수 있습니다. 추가 형광 채널이 transfected 세포를 표시 필요합니다. 이 경우, 높은 배율의 이미지 및 잘 구분 세포는 quantitate 쉽게합니다.

  1. "규모를 설정 / 분석."를 선택하여 추적 할 수있는 적절한 측정을 선택 메뉴 명령을 선택하여 크기 정보를 확인 "설정 / 분석 측정을." 지역을 선택하고 임계 값을 초과 할 수 없습니다.
  2. 터치하지 않는 개별 셀은 F-고를 이미지를 (그림 6A)를 사용하여 각 셀을 식별합니다. 임계 이미지 (3.9 참조) (그림 6B). 그것은 세포의 가장자리를 캡처하는 것이 중요하지만, 구멍이있을 수 있습니다내부의이 임계 값에 포함되지 않습니다. 셀 경계를 선택 이미지에 동일한 강도 값을 사용합니다.
  3. 셀의 영역을 측정하려면, "입자를 분석 / 분석합니다."를 사용하여 분석 입자 창에서 크기> 0 (노이즈를 제거하기 위해), 표시 외곽선을 선택하고 디스플레이 결과를 확인 관리자에 추가하고 (레코드에 구멍을 포함 개요 내부의 전체 면적). OK를 선택하고 결과 창에서 각 셀에 대한 영역을 기록합니다.
  4. 어떤 세포 (그림 6C) transfected 아르 확인합니다.
  5. 형광 젤라틴 이미지를 (그림 6D)를 사용하여 저하의 영역을 식별합니다. 필요한 경우 (3.6 참조) 배경 강도를도 할 수있는 젤라틴 이미지를 필터링합니다. 임계 값 저하의 영역을 선택하고, 임계 설정 (그림 6E)의주의를 갖추고 있습니다. 다음 이미지에서 다음과 같은 상부 및 하부 강도 값 (설정을 사용하여를 사용하여열화의 영역의 목표 선택에 대한 임계 값 창에서 버튼).
  6. 세포에서 저하의 영역을 측정합니다. thresholded 형광 젤라틴 이미지에서 투자 수익 (ROI) 관리자 창에서 ROIs를 선택하고 측정을합니다 (그림 6 층)를 선택하여 셀의 개요를 보여줍니다. 결과를 기록하고 저하 / 셀 또는 셀 영역의 정규화 된 영역을 계산합니다.

5. 대표 결과

절차에 대한 전체적인 구조도는 그림 1에 표시됩니다. 절차는, 세포 젤라틴을 저하 할 수 있도록 코팅 coverslips로 세포의 도금 수정 및 이미징은 매트릭스의 무결성을 평가하기 위해, 형광 현미경 분석을 위해 세포의 형광 매트릭스 라벨, 휘황 - 복합 젤라틴과 유리 coverslips와 코팅의 준비를 수반 그리고 객관적으로 컴퓨터 softwar를 사용하여 젤라틴 매트릭스 저하의 정도를 정량화5.

그림 1
그림 1. 고정 및 immunolabeling, 그리고 매트릭스 proteolysis를 평가, 형광등 젤라틴 코팅, 세포 도금과 관련된 주요 단계를 강조 전체 설계도.

준비 및 코팅 유리 coverslips에 참여 키 절차 단계는 그림 2에 설명되어 있습니다.

그림 2
그림 2. 젤라틴 매트릭스 코팅 유리 coverslips를 준비에 관련된 각 단계를 보여주는 도식. 얼음 (조각)의 빛 (조명 전구)과 어둠 (비 조명 전구)에 실시 단계 만화는 표시됩니다. 어두운 도움이 실시 단계 형광 매트릭스의 photobleaching 금지합니다.

제대로 수행하면, coverslips는 균일 오레곤 그린 488 - 복합 g로 코팅되어elatin, 균일 한 형광을 표시 할 때 현미경으로 시각화 (그림 3A). 부적절한 코팅으로 인해 발생할 수 있습니다 전형적인 유물은, 취급, 저장 및 코팅 coverslips의 사용은 그림 3B에 표시됩니다.

그림 3
유물의 그림 3. 예를 들면 젤라틴 코팅 coverslip 준비 및 처리하는 동안 발생했습니다. 공 촛점 Z-스택의 A. 직교 뷰가 488 - 복합 젤라틴 코팅 coverslip는 소정의 프로토콜을 사용하여 제작 오레곤 그린의 전형적인 색상과 일관성을 보여주고 있습니다. XZ (아래)와 YZ (오른쪽) 공 촛점 비행기에 도시 된 바와 같이 Coverslips은 ~ 1-2 μm 두께의 균일 한 코팅이 있어야합니다 젤라틴 코팅 coverslips의 코팅 및 처리하는 동안 발생할 수 있습니다 B. 아티팩트은 다음과 같습니다.의 부적절한 덮개를 인해 코팅 과정 coverslip"조약돌의 결과로 젤라틴 혼합물 (고르지 코팅), 장시간 저장 기간 동안 coverslip 표면의 건조, 취급 (흠집) 동안 바늘이나 집게로 골을하여 코팅 매트릭스의 제거의 가난한 혼합, 확산 설명서 또는 일부 응고에 "모양 (건조) 및 장시간 또는 높은 강도의 빛에 노출 (표백)로 인해 이미지 중에 형광 젤라틴 표면의 photobleaching. 화이트 화살표 도금 OSC19의 머리와 목 편평​​ 암종 세포를 포함한 표백 영역을 나타냅니다. 오레곤 그린 488 - 복합 젤라틴은 이미지 대비를 향상시키기 위해 흰색을 pseudocolored 있습니다. 바, 10 μm.

이 절차를 수행하는 동안 발생하는 결과 얇은 매트릭스는 ECM을 저하하는 세포의 능력을 평가하는 중요한 수단을 제공합니다. 그림 4는 오레곤 그린 - 488 복합 젤라틴 coverslip에 도금 OSC19 셀에서 invadopodia 활동의 예를 보여줍니다그리고 종래의 공 촛점 현미경에 의해뿐만 아니라 입체 deconvolution에 따라 볼륨 채우기 이미지 렌더링의 이미징.

그림 4
그림 4. invadopodia 매트릭스 저하 활동의 대표 사례.. invadopodia 및 해당 젤라틴 매트릭스 proteolysis의 시각화. 도금 오레곤 그린 10 488 - 복합 젤라틴 coverslips에 OSC19 세포는 시간이 고정되어 rhodamine-복합 phalloidin (F-고를) 및 안티 cortactin 항체 (알렉사 형석 647 차 항체와 pseudocolored 녹색과 시각화)로 분류되었습니다. Invadopodia은 병합 이미지 내의 젤라틴 소요 (매트릭스의 어두운 홀)의 영역과 중복 F-고를 및 cortactin의 초점 세포질 농도로 분명합니다. 확대 재와 같이 화살촉을 포함하는 박스 지역은 초점 매트릭스 proteolysis의 개별 invadopodia과 영역을 나타냅니다아래 gions. 바, 10 μm. B. 볼륨은 ECM에 invadopodia 침투의 시각화를 채 웁니다. 도금과 스테인드 (A)에서와 같이 OSC19 세포는 시각적으로 rhodamine - 복합 phalloidin와 오레곤 그린 488 - 복합 젤라틴을위한 7.04 μm에 달하는 Z-슬라이스 광학 23 연속 0.32 μm를 얻어 렌더링되었습니다. 각 채널에 대해 설정된 기본 LSM 파일은 AutoQuant X2.2 소프트웨어에 오픈되었으며, 각 이미지 스택의 3D 맹인 deconvolution은 권장 설정을 (10 반복, 중간 소음)를 사용하여 수행되었습니다. 처리 이미지는 다음 NIS 요소에 문을 열었으며 알파 블렌딩과 볼륨 뷰 렌더링 된 TIFF 스택으로 저장되었습니다. LUTs가 조정되었고, subvolume는 invadopodia이 존재하는 세포 내부 가장자리를 표시하기 위해 만들어졌습니다. 등쪽 - 에지보기 기본 젤라틴 (녹색)에 삽입 invadopodia을 (빨강, 화살표)을 보여줍니다. 복부 에지보기 coverslip 아래에 젤라틴 저하의 밀어내는 invadopodia과 영역을 보여줍니다녹색 매트릭스 (화살촉)에서 붉은 현재의 영역으로. 제시 총 이미지 필드는 77 X 65 μm로 자른되며 셀 ~ 60 X 40 μm이다.

그림 5는 프로토콜의 3 단계에 설명 된대로 정규화 된 젤라틴 매트릭스 저하의 정량화를위한 ​​중요한 단계 중 일부를 보여줍니다. 이 절차는 뷰의 전체 분야에서 젤라틴 저하의 편견 quantitation 수 있도록 설계되었으며 현장에서 여러 셀에 기인 매트릭스 저하에 적합합니다.

그림 5
프로토콜 3 단계에 설명 된대로 전체 현미경 이미지 내의 셀에 대한 정규화 된 젤라틴 저하의 전산를 이용한 정량화의 주요 단계를 보여주는 그림 5. 화면 캡처 이미지. 모든 형광 이미지는 더 붉은 임계 값 및 투자 수익 (ROI) 표시를 표시하는 그레이 스케일로 변환되었습니다. A. 임은오레곤 그린 저하가 발생했습니다 어두운 부분을 보여주는 488 - 복합 젤라틴 ( "구멍")의 나이 (단계 3.4). B. 빨간색 (단계 3.5)에 저하의 영역을 강조 젤라틴 이미지를 Thresholded. C. 드로잉이 지역에 대해 측정 ROIs를 표시 열화의 (단계 3.7). F-고를 (단계 3.8)의 D. Rhodamine phalloidin의 착색이 있습니다. E. 빨간색 (단계 3.9)의 총 셀 영역을 강조 고를 이미지를 Thresholded. F. 드로잉은 (단계 3.10) 측정 할 셀 영역을 표시 DAPI - 스테인드 세포 핵의. G. 이미지 (단계 3.13). H. 레드는 자동 핵 계산 (단계 3.13)에서 쇼 결과를 설명합니다. 유역 필터는 수중 별도의 핵 (흰색 화살표)로 가능성이 있습니다. 핵이 광범위하게 겹치는 경우는 개별 개체 (빨간색 화살표)로 분리되지 않을 수 있습니다. 핵은 불규칙한 모양을 가지고 있다면, 그것은 여러 객체 (노란색 화살표)로 구분 될 수 있습니다. I.는 </ 셀 카운터 도구 (단계 3.14)를 사용하여 수동으로 카운트하는 동안 핵을 표시에서 strong>을 결과.

6 그림. 프로토콜 4 단계에 설명 된대로 혼합 세포의 인구는 개별 세포 형광 젤라틴 저하를 정량화에 관련된 선택 단계를 보여줍니다. 여기 transfected 세포 매트릭스 저하는 transfected 및 비 transfected 세포의 혼합 인구에서 분석 할 수 있습니다.

그림 6
그림 6. 화면이 세포 인구 개별 transfected 세포로부터 젤라틴 저하를 정량화에 관련된 단계의 이미지를 캡처합니다. 국기 에피토프 태그에 융합 한 transfected OSC19 셀 overexpressing 재조합 cortactin의 정량화는 예를 들어로 표시됩니다. 모든 형광 이미지는 더 붉은 임계 값과 노란색 투자 수익 (ROI) 표시를 표시하는 그레이 스케일로 변환되었습니다. A. B. 드로잉은 임계 값의 적용에 따라와 입자 기능 (단계 4.2-3)를 분석합니다. C. 공 촛점 이미지 열화가 가진 어두운 부분을 ( "구멍") 표시, 오레곤 그린 488 - 복합 젤라틴의 국기 태그 cortactin (*로 표시) (단계 4.4). D. 이미지를 표현 하나의 셀을 시연 세포 인구의 반 플래그 immunolabeling의 발생 (단계 4.5) E. 빨간색의 저하의 어두운 부분 (단계 4.5) 강조 젤라틴 이미지를 Thresholded. F.는 패널 B (단계 4.6)에서 셀 외곽선과 젤라틴 이미지 겹쳐을 Thresholded. 셀 외곽선 내에 만 thresholded 픽셀이 분석에 포함됩니다 있습니다. 현재 셀 위치 (흰색 화살표) 시간의 경과에 젤라틴에서 세포의 이동에 따른 외부 저하의 영역과는 inclu 없습니다분석 ded.

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세포 외 기질 굴욕 세포를 시각화 할 수있는 능력은 세포 침략의 초기 단계에서 사용 된 분자 메커니즘을 발견에서 도왔습니다. 1980 년대 초 4,14,15에 웬 - 티엔 첸에 의해 개척 이후 미세 분석을위한 유리 coverslips에 코팅 휘황 표시 세포 단백질은 세포 유형의 다양한 범위에 걸쳐 invadopodia 기능을 평가의 기본 기술로 떠오르고있다. 소정의 프로토콜이 일에 비슷한 기존의 형광 및 공 촛점 현미경 11,16-18에서 세포 세포 외 기질 저하의 감지에 적합 미만 2 μm 두께 collagenous 층을 형성 젤라틴 코팅 coverslips를 준비에 사용되는 기본 방법을 보여줍니다 이전에 19-21을 설명하고. 이 속성은 매트릭스 저하의 초기 발병을 감지 할 수있는 코팅 coverslips의 빠른 생산 수 있습니다. 일에 의해 부여 감도전자 전체 매트릭스 환경 (22)의 높은 고유의 강성에 대한 응답으로 invadopodia 형성을 증진 기본 하드 유리 표면 가능성이 보조에 얇은 젤라틴 매트릭스를 가져온다. 그러나, 이러한 매트릭스가 잘 invadopodia 신장 또는 그와 유사한 방법론, 코팅 transwells 또는 전자 현미경 20,23,24과 (30-100 μm) 젤라틴 층을 두껍게을 사용하여 달성 된 추가 형태학의 평가 분석에 적합하지 않습니다.

우리는 사전에 복합 상업적으로 생산 오레곤 그린 488 젤라틴 빠른 실험 세트까지하고 일관성, 재현 결과를 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 그러나, 라벨이없는 젤라틴에 fluorescein isothiocyanate의 (FITC)의 알칼리성 borate의 활용은 형광 젤라틴 conjugates 20를 생산하기위한 인기있는 저렴한 방법 남아 있습니다. Fibronectin은 라벨과 coverslip 코팅 4,9에 대한 대안 매트릭스 단백질로와의 경우에 사용됩니다vestigators는 고밀도 매트릭스에게 11,25을 만들 라벨이없는 젤라틴 코팅 coverslips에 층을 표시 fibronectin을 사용했습니다. 다른 매트릭스는 세포 유형의 세부 사항에 따라 사용할 수 있습니다. 녹색 488 nm의 스펙트럼의 염료뿐만 아니라, fluorophores의 다양한도 rhodamine 21,26, 알렉사 형석 350 24 546 21 568 5,11 포함한 다양한 형광 스펙트럼과 coverslips을 생성하기 위해 수동 커플 링 방법으로 사용되어왔다 , 594 27 647 5 염료. 이러한 conjugates는 대부분의 모든 이미지 필터 세트에 적합한 특정 ECM 단백질 염색 조합을 활용을위한 유연성을 제공, 소정의 프로토콜에 사용하기 위해 쉽게 적응합니다.

기술은 이전 발표로 본 이기종 인구 또는 전체 셀 그룹에 개별 셀에 귀속 젤라틴 매트릭스 저하를 수량화 할 수 ImageJ를 이용에 필요한 자세한 단계를 제공합니다 설명iously 6,28. 독점 소프트웨어는 성공적으로 같은 목적 5,25 고용되었습니다. 이 프로토콜에서 매트릭스 저하의 영역은 셀의 전체 영역 또는 분야에서 세포의 총 수 (핵) 중 하나에 표준화되어 있습니다. 일반적으로 정규화에 대한 두 옵션은 (ELW, 데이터가 표시되지 않음) 동일한 결과를 제공합니다. 그러나 다른 크기의 셀을 갖는 다른 셀 라인 비교되고 또는 실험적 치료의 크기를 변경하려면 셀을 일으키는 경우,이 휴대폰 번호를 정상화 더 정확 될 수 있습니다. 한편, 많은 암 세포 라인은 총 셀 영역은 정규화에 대한보다 정확한 매개 변수가 될 수있는 경우에, 다중 nucleated 세포의 높은 비율을 갖추고 있습니다. 셀의 일부만이 이미지 (그림 6)에서 캡처하는 경우 또한,이 셀 영역에 정상화보다는 개별 셀의 열화 가능성을 과소 평가하는 것이 더있을 수 있습니다. 그것은 좋은 옷에 이미지 분석을 최적화하는 것이 중요합니다특정 실험 설정의 특성과 뉘앙스.

사람들이 많은 분야에서 전화 번호를 결정하는 경우, 핵을 계산하는 것은 자주 선택하는 방법입니다. ImageJ 자동 계산을위한 핵 카운터 플러그인이 있습니다. 이 도구의 하나 옵션은 분수령 필터입니다. 이 필터는 개별 개체 (그림 5H, 흰색 화살표)로를 segregating하여 수중 별도의 핵을 도움이 될 것입니다. 그러나,이 필터는 (그림 5H, 빨간색 화살표) 광범위하게 겹쳐 별도의 핵 할 수 없습니다. 핵은 불규칙한 모양과 강도의 큰 변화가있는 경우 또한, 필터는 여러 개체 (그림 5H, 노란색 화살표)에 하나의 핵을 분리 할 수 있습니다. 따라서 분석을위한 최적의 매개 변수를 결정하기 위해이 플러그인의 여러 임계 값과 스무딩 방법을 시도하는 것이 중요합니다. 자동 계산 정확한 숫자를 생성하지 않는 경우, 셀 카운터 플러그인은 faci 수 셀 또는 핵의 수동 계산을 litate.

과도 transfection을 이용한 경우, 이미지는 종종 표현 세포의 혼합물을 포함하거나 관심 (그림 6)의 단백질을 표현하지 않습니다. 이 시나리오에서는 세포가 매트릭스 저하의 영역을 만들기위한 책임이있는 항상 명백하지 않습니다. 세포 젤라틴에서 마이그레이션하는 경우 특히 유용합니다. 분석에 일치하도록, 단지 직접 각 셀 아래의 저하 영역을 측정하는 것이 중요합니다. 매트릭스의 어두운 부분을 선택 임계 값과 셀 개요를 생성 할 고를를 사용하여 셀 아래에서만 저하 영역 quantitated 될 것입니다. 이 절차는 분석에서 셀 경계 (그림 6 층, 화살표) 이외의 저하 지역을 제외합니다. 분석은 세포가 이동하는 기회가 전에 저하위한 충분한 시간을 허용하는 시점을 선택 최적화가 필요할 수 있습니다.

"> 많은 방법이 invadopodia 형성과 기능을 quantitate하기 위해 개발되었습니다. 매트릭스 저하뿐만 아니라, 다른 자주보고되는 매개 변수는 셀 당 invadopodia의 수, 주어진 인구에서 invadopodia를 표시하는 세포의 비율과 수를 결정하는 등 '미숙을 "또는"사전 저하 ECM 11,13,25,26 수있는 성숙 'invadopodia "비 굴욕 invadopodia는 비교". invadopodia 평가를위한 선택의 방법 (들) 각 셀 형식의 고유 특성에 따라 달라집니다. 예를 들어, 셀 당 invadopodia의 수를 계산하거나 invadopodia를 포함하는 세포의 비율을 결정하는 것은 분석 세포가 몇 눈에 띄는 invadopodia가 포함 된 경우 잘 작동하는 간단한 방법이지만, invadopodia 수십 또는 위치를 invadopodia 작은 수 있습니다이 세포에 더 어려워지고 어려운 감지합니다. 열화 분석을 사용하면이 가능 사전 invadopodia V의 비율을 계산 할 수 있습니다s입니다. 저하 매트릭스있는 비율 invadopodia과 세포의 총 수를 비교하여 단일 세포 또는 인구의 성숙 invadopodia. 적은 세포가 invadopodia를 표시 세포에 비해 저하 매트릭스 아르 차이가있는 경우, 이러한 세포는 세포가 해결 된 시간에 매트릭스 저하 수없는있었습니다 사전 invadopodia을 형성하고 있음을 나타냅니다 할 수 있습니다.

분석을 위해 선택되어이든 방법을 조합, 그건은 객관적으로 가능한 한 원하는 invadopodia 특성을 수량화하는 것이 중요합니다. 현미경에 이미지를 수집 할 때 우선적으로 저하 높은 수준의와 지역을 선택할 편견을 피하기 위해 오히려 형광 매트릭스보다 세포 (고를),보고 필드를 선택합니다. 다중 이미지는 세포 인구의 공정한 표현을 보장하기 위해 취득해야합니다. 이미지는 적절한 배율로 취득해야합니다. 세포의 균일 한 인구를 들어, 낮은 배율 수저하 등의 분야는 여전히 해결 될 수하는 한 더 많은 세포를 수집하는 데 사용할 수. 높은 배율 이미지는 개별 셀에서 영역을 측정하고 개별 invadopodia를 해결​​하는 데 좋습니다. 영역이 quantitated되는 경우, 강도에 따라 이미지를 임계 값은 수동으로 측정 할 수있는 매트릭스의 영역을 선택보다 더 객관적이다. 모든 경우에, 여러 독립적 인 실험에서 세포의 충분한 숫자 통계적으로 의미, 재현 결과를 제공하는 분석해야합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 웨스트 버지니아 대학의 메리 Babb 랜돌프 암 센터에서 기금 기금에 의해 지원되었다. 우리는 초기 조언과 도움을 Susette 뮐러 (조지 타운 대학교 (Georgetown University))와 로라 켈리 감사드립니다. 웨스트 버지니아 대학 현미경 영상 시설의 사용은 (메리 Babb 랜돌프 암 센터 및 NIH 보조금 P20 RR16440, P30 RR032138와 P30 GM103488에서 지원) 굉장히 인정하고 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gelatin Sigma G1890 Porcine skin
sucrose Fisher BP220
12 mm coverslips Fisher 50-121-5159
24 well plates Fisher 08-772-1 BD Falcon
nitric acid Ricca R5326000 20% solution
poly-L-lysine Electron Microscopy Sciences 19320-B 0.1% solution
glutaraldehyde Sigma G7526 8% solution
Oregon Green 488-conjugated gelatin Invitrogen G-13186
sodium borohydride Sigma 213462
Triton X-100 Fisher BP151
rhodamine-phalloidin Invitrogen R415
anti-cortactin (clone 4F11) Millipore 05-180
Anti-FLAG antibody Millipore MAB3118
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A21235
ProLong Gold antifade Invitrogen P36930
LSM 510 Confocal Microscope Zeiss
ImageJ software Public domain http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
AutoQuant X2.2 software Media Cybernetics
NIS Elements software Nikon

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References

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단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정
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Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts . J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).More

Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts . J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).

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