Summary
Vi beskriver den prototypiske fremgangsmåte for fremstilling mikroskop dekkglass belagt med fluorescerende gelatin for å visualisere invadopodia-mediert matrise nedbrytning. Beregningsorientert teknikker ved hjelp av tilgjengelig programvare presenteres for å tallfeste resulterende nivåer av matrix proteolyse av enkeltceller i en blandet befolkning og for flercellede grupper som omfatter hele mikroskopiske felt.
Abstract
Cellular invasjonen i lokale vev er en prosess viktig i utvikling og homeostase. Malregulated invasjon og påfølgende cellebevegelse er karakteristisk for flere patologiske prosesser, inkludert betennelse, kardiovaskulær sykdom og tumorcelle metastasering 1. Focalized proteolytisk nedbrytning av ekstracellulær matrix (ECM) komponenter i epiteliale eller endothelial basalmembran er et viktig skritt i å initiere cellulær invasjon. I kreftceller, har omfattende in vitro-analyse fastslått at ECM degradering oppnås ved ventrale aktin-rike membran protrusive strukturer betegnet invadopodia 2,3. Invadopodia skjema i nært apposisjon til ECM, hvor de modererer ECM sammenbrudd gjennom handling av matriksmetalloproteinaser (MMP). Muligheten av tumorceller til å danne invadopodia korrelerer direkte med evnen til å invadere i lokal stroma og tilhørende vaskulære komponenter 3.
_content "> Visualisering av invadopodia-mediert ECM nedbrytning av celler ved fluorescerende mikroskopi bruker dye-merket matriksproteiner belagt på glass dekkglass har dukket opp som den mest utbredte teknikken for å vurdere graden av matrix proteolyse og cellulære invasiv potensial 4,5. Her beskriver vi en versjon av standard metode for generering fluorescently-merket glass dekkglass utnytte en kommersielt tilgjengelig Oregon Grønn-488 gelatin konjugat. Denne metoden er enkelt skaleres raskt produsere store mengder belagte dekkglass. Vi viser noen av de vanligste mikroskopiske gjenstander som ofte oppstår løpet av denne prosedyren, og hvordan disse kan unngås. Endelig beskriver vi standardiserte metoder ved bruk av lett tilgjengelig datamaskin programvare for å tillate kvantifisering av merket gelatin matrise nedbrytning mediert av individuelle celler og ved hele cellulære populasjoner. De beskrevne prosedyrer gir evnen til å nøyaktig og reproduserbart overvåke invadopodiaaktivitet, og kan også tjene som en plattform for å evaluere effekten av modulerende protein ekspresjon eller testing av anti-invasive forbindelser på ekstracellulær matriks nedbrytning i enkelt-og flercellede innstillinger.Protocol
1. Produksjon av Oregon Grønn 488-gelatin Coated Dekkglass
- Forbered en umerket 5% (w / w) lager gelatin / sukrose-løsning ved å tilsette 1,25 g gelatin og 1,25 g sukrose i PBS til et sluttvolum på 50 ml. Varm bestanden gelatinoppløsning til 37 ° C og at den er helt smeltet før bruk. Oppbevar endelige blandingen ved 4 ° C.
- Rengjør 13 mm diameter # 1 glass dekkglass ved å plassere en individuell dekkglass i hver brønn av en 24 godt plastisk vevskulturplaten. Tilsett 500 ul av 20% salpetersyre til hver brønn og inkuber i 30 min. Aspirer salpetersyreoppløsning og vask dekkglass tre ganger med deionisert vann.
- Coat dekkglass med 500 pl av 50 pg / ml poly-L-lysin (fremstilt fra 0,1% stamløsning og fortynnet i avionisert vann) til hver brønn i 20 min ved romtemperatur. Aspirer løsningen og vask tre ganger med PBS. Poly-L-lysin belegg letter jevnt belegg og binding av den overliggende laBeled gelatin.
- Tilsett 500 ul av 0,5% glutaraldehyd (gjort frisk før bruk) til hver brønn og inkuber i 24 brønners plater på is i 15 min. Aspirer og vask tre ganger med kaldt PBS. Sørg for å fjerne alle spor av PBS før gelatin belegg. Hold platene på is under alle vasker til gelatinen er lagt til.
- Rekonstituere Oregon Grønn 488-konjugert gelatin pr produsentens protokoll og varme den og den umerkede 5% gelatin / sukroseløsning fra (1,1) til 37 ° C. Fortynn en del Oregon Grønn 488 gelatin i åtte deler av umerket gelatin / sukrose (dvs., 500 ul Oregon Grønn 488 gelatin i 4 ml 5% gelatin blandingen). Pipet 100 ul av den fortynnede 488-gelatin blandingen (holdt ved 37 ° C) på hver dekkglasset, bruker nok gelatin til å belegge dekkglass uten manuell spredning (som kan føre til ujevn dekkglass belegg som vist i figur 3B). Det er viktig å holde den fortynnede 488-gelatin blandingen ved 37 °, C under belegget for å hindre at for tidlig størkning. Fra dette skritt fremover de dekkglass bør holdes i mørket så mye som mulig for å unngå potensiell fotobleking. Andre ECM proteiner konjugert til ulike fluoroforer kan erstatte Oregon Grønn 488 gelatin (se diskusjon).
- Når alle dekkglass er belagt i en enkelt plate, hold 24 brønnplate i vinkel og fjerne overflødig gelatin fra hver brønn ved vakuumaspirasjon. Inkuber belagt dekkglass i mørket i 10 minutter ved romtemperatur.
- Vask dekkglass tre ganger med PBS, og deretter legge 500 ul ferske 5 mg / ml natriumborhydrid (NaBH 4) i 15 minutter ved romtemperatur for å redusere og innaktivere gjenværende glutaraldehyd. Natriumborhydrid er sprudlende, og små bobler vil være tydelig på og rundt hver dekkglasset.
- Fjern NaBH 4 løsningen ved vakuumaspirasjon med en rask feiende bevegelse rundt utsiden av hver brønn. Pass på å ikke plukke opp noen flytende dekkglass som ble løsrevet fra bunnen av vevskulturplaten under NaBH 4 behandling. Enebolig dekkglass som flyter til toppen kan være forsiktig presset tilbake ned til brønnen bunnen, men forsiktighet må tas for å unngå å skade protein belegg. Vask hver brønn tre ganger med PBS og deretter inkuberes dekkglass i 70% etanol i 30 minutter ved romtemperatur.
- Ved hjelp av steril teknikk, overføre dekkglass-holdige platene til en type IIA / B cellekultur laminær hette og skyll dekkglass tre ganger med sterilt PBS. På dette punktet dekkglass kan lagres i PBS beskyttet mot lys ved 4 ° C i minst to måneder.
- Overføre dekkglass som skal brukes for nedbrytningsproduktene analyser til en tom brønn av en ny 24 brønn plate ved forsiktig fjerning ved hjelp av en steril nål og tang. Stabilisere dekkglass for 1-24 timer med komplett media som passer til den spesifikke celletype som analyseres. Care må tas ikkeå invertere dekkglass eller riper i gelatin belegg (se figur 3B).
2. Plating og behandling av Celler på Oregon Grønn 488-gelatin Coated Dekkglass til Assay ECM Degradation
- Seed 3-5x10 4 celler bort på et dekkglass innenfor hver brønn av 24 brønn plate.
- Gjennomføre en tid selvfølgelig studie for å fastslå optimale ganger kreves for invadopodia degradering aktivitet for den enkelte celle linje / type interesse. Mest invasive celler krever en tid mellom 4-24 h for nedbrytning for å bli tydelig, selv om dette området kan variere mye, og bør empirisk bestemt. Å synkronisere invadopodia aktivitet, kan celler behandles med MMP-inhibitorer (f.eks, 6001 GM) for en ønsket tidsperiode, og deretter vaske ut inhibitor å tillate invadopodia aktiviteten for å fortsette (se for eksempel 6).
- Skyll dekkglass tre ganger med PBS, deretter fikse celler med 500 pl 10% buffret formalin fosfatasete i 15 min. Skyll tre ganger med PBS og permeabilize etter 4 min med 0,4% Triton X-100 i PBS. Skyll tre ganger med PBS for å fjerne Triton X-100.
- Label celler ved hjelp av noen standard protokoll for immunfluorescens flekker (se 7 for eksempel) ved samtidig merking celler med fluorescerende konjugert phalloidin å visualisere actin filamenter (F-aktin) og for en kjent markør protein som lokaliserer til invadopodia (f. eks cortactin 5, TKS5 8, eller N-veps 9). Husk å unngå å bruke 488-merkede sekundære antistoffer eller GFP-merkede proteiner ved bruk Oregon Grønn 488 eller FITC-merket gelatin unngå signalforstyrrelser.
- Monter farget dekkglass på glass objektglass ved forsiktig å invertere dekkglass og plassere den på en dråpe forlenge Gold antifade eller lignende reagens.
- Å vurdere matrise degradering, bildet celler i riktige kanaler ved hjelp av en konvensjonell fluorescerende eller confocal mikroskop. Gelatin degraderinger visualisert som mørkere områder på dekkglasset grunnet proteolytisk fjerning av fluorescerende gelatin (figur 4A). Merking av celler for aktin og en invadopodia markør protein gir bekreftelse på invadopodia på webområder for matrise nedbrytning i sammenslåtte bilder (figur 4A).
- Nedbrytningsaktiviteten kan også overvåkes i sanntid av levende celle bildebehandling med fluorescerende-merket rekombinante proteiner for å spore invadopodia dannelse og matrise degradering 5,10,11.
3. Kvantifisering av Fluorescent Gelatin Degradation ved å måle Normalisert Matrix Degradation
Denne analysen gir den normaliserte området matrise nedbrytning i forhold til området av cellene eller antall celler. Det er nyttig for å analysere hele mikroskopiske synsfelt hvor flere celler er tilstede som har blitt behandlet med kollektivt siRNA, vekstfaktorer eller terapeutiske midler. For denne analysis, bilder samlet på lavere forstørrelse er tilstrekkelig til å effektivt samle informasjon om populasjoner av celler.
- Åpne bildene i ImageJ 12. ImageJ for mikroskopi kan lastes ned fra http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- Sjekk skalaen informasjon ved å velge menykommandoen "Analyze / Set Scale." Denne informasjonen blir automatisk importert med mange filformater, men kan legges inn manuelt om nødvendig. Riktig skalering er nødvendig å rapportere målinger i mikron i stedet for piksler.
- Velg de riktige målinger for å spore ved å velge "Analyze / Set målinger." Sjekk område og Begrens til Threshold.
- Beregne arealet av degradering ved hjelp av fluorescerende gelatin bilde (figur 5A).
- Terskel bilde ("Image / Tilpass / Threshold") for å angi øvre og nedre pixel intensitetsverdier å velge de områdene av nedbrytning (uthevet i rødt, figur 5B). I etterfølgende bilder, bruker du Set-knappen i Threshold vinduet til å angi den samme terskelen for alle bilder som en objektiv betyr å velge nedbrytning området.
- I noen tilfeller kan dekkglass ikke være helt flat når bildene blir kjøpt. Dette fører til at intensiteten av gelatinen å endre over bildet. Hvis denne variasjonen skaper problemer når terskelverdier bildet, riktig for ujevn belysning over gelatin ved å subtrahere bakgrunnen ("Process / trekke Bakgrunn") eller ved filtrering med et båndpassfilter ("Process / FFT / båndpassfilter") eller en pseudo flatfield filter ("Prosess / Filter / Pseudo Flatfield") til bakgrunnen intensiteten er jevn.
- Måle området av matrix nedbrytning ("Analysere / analyser Partikler"). I Analyser Partikler vinduet velger en partikkelstørrelse> 0 for å fjerne støy fra than valget. Vis Outlines å identifisere områder av interesse (ROIs). Sjekk vise resultater, og Oppsummer å vise mål. Hvis tegningen har spesielt skissert alle områdene nedbrytning (figur 5C), kopiere Bruttoareal måling i et regneark. Hvis andre objekter ble valgt (som rusk), registrere bare de områder av det relevante Rois.
- Beregn cellen området ved hjelp av phalloidin farget (F-aktin) bilde (Figur 5D).
- Terskel bilde ("Image / Tilpass / Threshold") for å angi de øvre og nedre pikselintensiteten verdiene slik at kantene på cellene er valgt (markert i rødt, figur 5E). I etterfølgende bilder, bruker du Set-knappen i Threshold vinduet til å angi den samme terskelen for alle bilder som en objektiv betyr å velge celleområdet.
- 10 måle området av cellene ("Analyser / analyser Partikler"). I Analyser Particles vinduet, velg en partikkelstørrelse> 0 for å fjerne støy fra utvalget. Vis Outlines å identifisere områder for analyse (figur 5F). Sjekk vise resultater, og Oppsummer å vise området målinger. Ikke kontroller Inkluder hull hvis det er mellomrom mellom cellene i en klynge slik de ikke-utvalgte punkter i klyngen ikke vil være inkludert i cellen arealberegning. Velg OK.
- Kopiere området for relevante ROIs inn i et regneark.
- Beregne arealet av gelatin nedbrytning per totalt areal av celler 13.
- En alternativ tilnærming er å rapportere området nedbrytning pr antall celler fra telling atomkjerner (Figur 5G). Dette er nødvendig dersom manipulasjoner endrer celleområdet mellom ulike sammenlignet behandlingsgruppene. Automatisk telling fungerer best hvis kjerner er godt atskilt, uniform i intensitet og runde. Automatisk telle NUCLEi ("Plugins / partikkel analyse / Nucleus Counter"). Velg minste og største partikkelstørrelse, en terskel Metode og Utjevning metode. Sjekk Trekk Bakgrunn, Watershed Filter, Legg Partikler til avkastning Manager og Show Summary (figur 5H).
- Hvis kjerner overlapper mye eller har en uregelmessig form eller tekstur, kan automatisk telling ikke produsere en nøyaktig telling (figur 5H, piler på høyre). I dette tilfellet, kan manuell telling lettes ved hjelp celleteller verktøyet ("Plugins / partikkel analyse / celleteller"). Dette vil holde teller som cellene er merket under en manuell telling (figur 5I).
- Kopiere antall celler (kjerner) til et regneark. Beregne arealet av gelatin nedbrytning per totalt antall celler.
4. Kvantifisering av Fluorescent Gelatin Nedbryting ved enkeltceller i en blandet Cellular Befolkning For å evaluere matrise degradering som følge bestemte celler i en populasjon bortsett fra andre celler i feltet (f.eks transfektert versus ikke-transfekterte celler), kan fremgangsmåten i avsnitt 3 modifiseres for å måle arealet av nedbrytning under individuelle celler. En ekstra fluorescerende kanal er nødvendig for å markere transfekterte celler. I dette tilfellet, høyere forstørrelse bilder og godt separerte celler er lettere å kvantifisere.
- Sjekk skalaen informasjon ved å velge menykommandoen "Analyze / Set Scale." Velg de riktige målinger for å spore ved å velge "Analyze / Set målinger." Sjekk område og Begrens til Threshold.
- For individuelle celler som ikke berører, identifisere hver celle ved hjelp av F-aktin bilde (figur 6A). Terskel bildet (se 3.9) (Figur 6B). Det er viktig å fange kantene av cellene, men det kan være hulls innsiden som ikke er inkludert i terskelen. Bruk de samme intensitet verdier over bildene for å velge cellegrensene.
- For å måle arealet av cellene, bruk "Analyser / Analyser Partikler." I Analyser Partikler vinduet, velg en størrelse> 0 (for å eliminere støy), viser Outlines, og sjekk Vis resultat, Legg til Manager og Inkluder Holes (for å spille hele området innenfor omrisset). Velg OK og opptak av området for hver celle fra resultatene vinduet.
- Identifisere hvilke celler transfektert (figur 6C).
- Identifiser områdene nedbrytning ved hjelp fluorescerende gelatin bilde (figur 6D). Hvis det er nødvendig, filtrere gelatin bilde til selv bakgrunn intensitet (se 3.6). Terskel for å velge områdene nedbrytning, noe som gjør oppmerksom på terskelinnstillinger (figur 6E). På etterfølgende bilder, bruker de samme øvre og nedre intensitet verdier (ved hjelp av Setknappen i Terskel vinduet) for en objektiv over utvalgte områder av nedbrytning.
- Mål områdene nedbrytning under cellene. På thresholded fluorescerende gelatin bilde, viser en oversikt over de cellene ved å velge ROIs i ROI-vinduet og velge Mål (figur 6F). Registrere resultatene og beregne normalisert området nedbrytning / celle eller celle-området.
5. Representant Resultater
Den generelle skjematiske for prosedyren er vist i figur 1. Fremgangsmåten medfører fremstilling av glass dekkglass og belegg med fluorescensmerket-konjugert gelatin, plating av cellene på den belagte dekkglass å tillate celler å degradere gelatin, feste og merking av celler for fluorescens mikroskopisk analyse, den fluorescerende matrise imaging å vurdere matrisen integritet, og objektivt kvantifisere graden av gelatin matrise degradering ved hjelp av datamaskin software.
Figur 1. Totalt skjematisk fremheve de viktigste trinnene involvert i fluoriserende gelatin belegg, celle plating, fikse og immunolabeling, og evaluere matrise proteolyse.
De viktigste rettslige skritt involvert i forberedelsene og belegg glass dekkglass er skissert i figur 2.
Figur 2. Skjematisk viser de enkelte trinnene involvert i forberedelsene glass dekkglass for gelatin matrise belegg. Trinnene utført i (lyser pære), på is (kuber) og i mørke (ikke-belyste lyspære) er tegnefilm indikert. Trinn gjennomført i mørket hjelp hindre photobleaching av fluorescerende matriser.
Når riktig utført, er dekkglass jevnt belagt med Oregon Grønn 488-konjugert gelatin, viser homogen fluorescens når visualisert ved mikroskopi (Figur 3A). Typiske gjenstander som kan oppstå på grunn av feilaktig belegg, håndtering, lagring og bruk av belagte dekkglass vist i figur 3B.
Figur 3. Eksempler på gjenstander oppstått under gelatin belagt dekkglass forberedelse og håndtering. A. Ortogonale visning av en confocal z-stack som viser typisk farge og konsistens av en Oregon Grønn 488-konjugert gelatin belagt dekkglass produsert ved hjelp av den foreskrevne protokollen. Dekkglass bør ha en homogen belegg ~ 1-2 um tykt som vist i XZ (bunn) og YZ (høyre) confocal flyene B. artefakter som kan oppstå under belegget og prosessering av gelatin-belagte dekkglass omfatter:. Feilaktig tildekking av dekkglass under belegningsprosessen grunntil dårlig blanding, manuell spredning eller delvis stivning av gelatin blandingen (ujevn belegg), fjerning av den belagte matrisen ved scoring med nåler eller tang under håndtering (skrape), tørking av dekkglasset overflaten under lengre lagringsperioder, resulterer i en "cobblestone "utseende (dehydrert) og photobleaching av fluorescerende gelatin overflaten under bildebehandling på grunn av langvarig eller høy intensitet lys eksponering (bleking). Hvit pil viser bleket område som omfatter en belagt OSC19 hode og nakke squamous carcinoma celle. The Oregon Grønn 488-konjugert gelatin er pseudocolored hvitt for å forbedre kontrasten i bildet. Bar, 10 mikrometer.
De resulterende tynne matriser produsert i løpet av denne prosedyren gi en følsom måte å vurdere muligheten av celler til å degradere ECM. Figur 4 viser et eksempel på invadopodia aktivitet fra en OSC19 celle belagt på en Oregon Grønn-488 konjugert gelatin dekkglassetog avbildes ved konvensjonell konfokalmikroskopi samt ved volum-fill bildegjengivelse etter tredimensjonal dekonvolusjon.
Figur 4. Representative eksempler på invadopodia matrise nedbrytning aktivitet. A. Visualisering av invadopodia og tilsvarende gelatin matrise proteolyse. OSC19 celler belagt på Oregon Grønn 488-konjugerte gelatin dekkglass for 10 t ble fikset og merket med rhodamine-konjugert phalloidin (F-aktin) og anti-cortactin antistoffer (visualisert med en Alexa Fluor 647 sekundært antistoff og pseudocolored grønn). Invadopodia er tydelig som fokale cytoplasmatiske konsentrasjoner av F-aktin og cortactin som overlapper med deler av gelatin clearing (mørke hull i matrisen) innenfor det sammenslåtte bildet. Boxed regioner inneholdende pilspisser indikerer individuell invadopodia og områder av fokal matrise proteolyse som vist i den forstørrede regions nedenfor. Bar, 10 mikrometer. B. Volum fylle visualisering av invadopodia penetrasjon inn i ECM. OSC19 celler belagt og farget som i (A) ble visuelt gjengitt ved å skaffe 23 suksessive 0,32 mikrometer optiske z-skiver til sammen 7,04 mikrometer for rhodamine-konjugert phalloidin og Oregon Grønn 488-konjugert gelatin. De innfødte LSM filsett for hver kanal ble åpnet i AutoQuant X2.2 programvare og en 3D blind dekonvolusjon av hver bildestakk ble utført ved hjelp av anbefalte innstillinger (10 gjentakelser, middels støy). De behandlede bildene ble lagret som TIFF stabler som ble deretter åpnet i NIS Elements og gjengis som et volum visning med alpha blending. Oppslagstabellene ble justert, og en subvolume ble opprettet for å vise en kant inne i cellen der invadopodia er til stede. Dorsal-kantriss demonstrerer invadopodia (rød, piler) innsatt i underliggende gelatin (grønn). Ventrale-edge viser protrusive invadopodia og områder av gelatin nedbrytning under dekkglassetsom regioner av rød tilstede i den grønne matrise (pilhoder). Den totale bildefeltet presenteres er beskåret til 77 x 65 mikrometer, cellen er ~ 60 x 40 mikrometer.
Figur 5 viser noen av de viktigste trinnene for kvantifisering av normalisert gelatin matrise degradering som beskrevet i trinn 3 i protokollen. Denne prosedyren er laget for å tillate Objektive kvantifisering av gelatin nedbrytning i et hele synsfeltet, og er egnet for matriks nedbrytning tilskrives mange celler innenfor feltet.
Figur 5. Screen ta bilder som viser viktige skritt i beregningsorientert-assistert kvantifisering av normalisert gelatin nedbrytning for celler i en hel mikroskopisk bilde som beskrevet i protokollen trinn 3. Alle fluorescerende bildene er konvertert til gråtoner for å bedre vise den røde thresholding og avkastning tegninger. A. Imalder av Oregon Grønn 488-konjugert gelatin, viser mørke områder ("hull") der degradering har oppstått (trinn 3.4). B. Thresholded gelatin bilde synliggjøre områder av nedbrytning i rødt (trinn 3.5). C. Tegning viser ROIs målt for området av nedbrytning (trinn 3.7). D. Rhodamine phalloidin farging av F-aktin (trinn 3.8). E. Thresholded aktin bilde utheving total celle området i rødt (trinn 3.9). F. Tegning viser celle områder som skal måles (trinn 3.10) . G. Bilde av DAPI-farget cellekjerner (trinn 3.13). H. Red skisserer utstillingsresultater fra automatisk kjerner telling (trinn 3.13). Den Watershed filter har potensial til å skille kjerner som berører (hvit pil). Hvis kjerner overlapper mye, kan de ikke skilles i individuelle objekter (rød pil). Hvis en kjerne har en uregelmessig form, kan den bli separert i flere objekter (gul pil). I. </ Strong> Resultater fra merking kjerner under en manuell telling ved hjelp av celleteller verktøyet (trinn 3.14).
Figur 6. demonstrerer velger trinn involvert i kvantifisere fluorescerende gelatin degradering av individuelle celler innenfor et blandet cellulær populasjon som beskrevet i protokoll trinn 4. Her kan matrise nedbrytning ved transfekterte celler analyseres innen en blandet populasjon av transfekterte og ikke-transfekterte celler.
Figur 6. Screen ta bilder av trinnene involvert i å kvantifisere gelatin degradering fra individuelle transfekterte celler i en celle befolkning. Kvantifisering av en enkelt transfekterte OSC19 celle overekspresjon rekombinant cortactin smeltet til FLAG epitop tag vises som et eksempel. Alle fluorescerende bildene er konvertert til gråtoner for å bedre vise den røde thresholding og gule avkastning tegninger. A. B. Tegning av totalt celle område basert på F-aktin farging etter påføring av terskel og Analyze Partikler funksjoner (trinn 4,2 til 3). C. Confocal image av anti-FLAG immunolabeling av cellen befolkningen viser en enkelt celle uttrykker FLAG-merket cortactin (merket med *) (trinn 4.4). D. Bilde av Oregon Grønn 488-konjugert gelatin, viser mørke områder ("hull") der degradering har skjedde (trinn 4.5) E. Thresholded gelatin bilde fremheve mørke områder av nedbrytning i rødt (trinn 4.5). F. Thresholded gelatin bilde overlappet celle skisserer fra panel B (trinn 4.6). Vær oppmerksom på at bare de thresholded piksler i cellen skisserer telles i analysen. Områder av nedbrytning utenfor gjeldende celle plassering (hvit pil) resultat fra celle migrasjon over gelatin over tid og er ikke included i analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til å visualisere celler nedverdigende den ekstracellulære matrix har hjulpet i å oppdage de molekylære mekanismene ansatt i de tidlige trinnene av celle invasjon. Utviklet av Wen-Tien Chen i tidlige 1980-tallet 4,14,15, har belegg fluorescensmerkede ekstracellulære proteiner på glass dekkglass for påfølgende mikroskopisk analyse dukket opp som den primære teknikk i å vurdere invadopodia funksjon over et bredt spekter av celletyper. Den foreskrevne protokollen demonstrerer grunnleggende metode for fremstilling av gelatin-belagte dekkglass som danner en collagenous lag mindre enn 2 mikrometer tykk egnet for påvisning av ekstracellulær matriks nedbrytning av celler i de fleste konvensjonelle fluorescerende og confocal mikroskoper 11,16-18, lik det som har er tidligere beskrevet 19-21. Disse egenskaper tillater rask produksjon av belagte dekkglass dedekterer første utbruddet av matrise nedbrytning. Følsomheten by av the resulterende tynne gelatin matrise på de underliggende harde glassoverflate sannsynlige hjelpemidler i fremme invadopodia formasjon som en respons til den høye iboende stivhet av den samlede matrisemiljø 22. Imidlertid er disse matriser ikke godt egnet for analyse av invadopodia forlengelse eller ekstra morfologiske evaluering som er oppnådd ved hjelp av tykkere (30-100 uM) gelatin lag med tilsvarende metodikk, belagte transwells eller elektronmikroskopi 20,23,24.
Vi har funnet ut at pre-konjugert kommersielt produsert Oregon Grønn 488 gelatin muliggjør rask eksperimentelle oppsett og konsistente, reproduserbare resultater. Forblir imidlertid alkalisk borat konjugering av fluorescein isothiocyanat (FITC) til umerket gelatin en populær og billig metode for fremstilling av fluorescerende gelatin konjugater 20. Fibronectin er også brukt som en alternativ matrixprotein for merking og dekkglass 4,9 belegg, og i noen tilfeller ivestigators har brukt merket fibronektin lagvis på umerkede gelatin belagt dekkglass å skape tettere matriser 11,25. Andre matrikser kan brukes, avhengig av de nærmere detaljer av celletype. I tillegg til fargestoffer i den grønne 488 nm spektrum, har et bredt spekter av fluoroforer også vært brukt med manuelle koblingssystemer metoder for å generere dekkglass med ulik fluorescensspektra inkludert 21,26 rhodamin, Alexa Fluor 350 24, 546 21, 568 5,11 , 594 27 og 647 5 fargestoffer. Slike konjugater kan enkelt tilpasses for bruk i den foreskrevne protokollen, og gir fleksibiliteten for utnyttelse spesifikke ECM protein-dye kombinasjoner egnet for de fleste enhver avbildning filtersettet.
Teknikkene beskrevet gi de nødvendige detaljert fremgangsmåte for å utnytte ImageJ å kvantifisere gelatin matrise degradering tilskrives enkeltceller i en heterogen befolkning eller hele cellegrupper som publiseres forrigeiously 6,28. Proprietær programvare har også blitt ansatt for samme formål 5,25. I denne protokollen, er det området av matrisen degradering normalisert til enten det totale arealet av cellene eller det totale antall celler (kjerner) i feltet. Vanligvis vil begge alternativer for normalisering gi samme resultat (ELW, data ikke vist). Men hvis forskjellige cellelinjer som har forskjellige størrelser celler blir sammenlignet eller om den eksperimentelle behandlingen fører celler til å endre størrelse, så kan det være mer riktig å normalisere til celle nummer. På den annen side, mange kreftcellelinjer har en høy prosentandel av multi-kjerneholdige celler, i hvilket tilfelle totalt celle området kan være en mer nøyaktig parameter for normalisering. Også, hvis bare en del av en celle er fanget i et bilde (figur 6), kan det være bedre å normalisere til celle-området i stedet undervurdere degradering potensialet for en enkelt celle. Det er viktig å optimalisere bildeanalyse å best dressegenskaper og nyanser fra den spesifikke eksperimentelle oppsettet.
For å bestemme celle tall i en overfylt felt, telle kjerner er ofte metoden for valg. ImageJ har en kjerne teller plugin for automatisk telling. Ett alternativ i dette verktøyet er Watershed filter. Dette filteret vil hjelpe separat kjerner som berører ved segregerende dem i individuelle objekter (Figur 5H, hvit pil). Imidlertid kan dette filteret ikke være i stand til separat atomkjerner som overlapper omfattende (figur 5H, rød pil). I tillegg, hvis en kjerne har en uregelmessig form og store variasjoner i intensitet, kan filteret separere en enkelt kjerne i flere objekter (Figur 5H, gul pil). Derfor er det viktig å prøve forskjellige terskelverdier og jevne metodene i denne plugin for å finne de beste parametrene for analyse. Hvis den automatiske opptellingen ikke gi nøyaktige tall, celleteller plugin kan faci litate manuell telling av celler eller kjerner.
I tilfeller som benytter forbigående transfeksjon vil bilder inneholder ofte en blanding av celler som uttrykker eller ikke uttrykker et protein av interesse (figur 6). I dette scenariet er det ikke alltid åpenbar hvilke celler var ansvarlig for å lage deler av matrix degradering. Dette gjelder spesielt hvis cellene migrerer over gelatin. Å være konsekvent i analysen, er det viktig å bare måle det degraderte områder direkte under hver celle. Ved terskelverdier for å velge de mørke områdene i matrisen og bruke aktin å generere celle skisserer, vil bare de degraderte områder under cellene kvantifiseres. Denne prosedyren vil ekskludere degradert områder utenfor cellegrensene fra analyse (figur 6F, pil). Analysen kan kreve optimalisering for å velge et tidspunkt som gjør at tilstrekkelig tid for nedbrytning før cellene har hatt en sjanse til å flytte.
"> Tallrike metoder har blitt utviklet for å kvantifisere invadopodia dannelse og funksjon. I tillegg til matriks nedbrytning, andre hyppig rapporterte parametrene inkluderer bestemme antall invadopodia per celle, prosentandelen av celler som viser invadopodia innenfor en gitt populasjon, og antallet av" umoden "eller" pre "non-nedverdigende invadopodia sammenlignet med" modne "invadopodia kan nedbryte ECM 11,13,25,26. metoden (e) valg for invadopodia evaluering avhenge iboende egenskaper av hver celletype. Eksempelvis telle antallet invadopodia per celle eller bestemme prosentandelen av celler inneholdende invadopodia er en grei måte som fungerer godt dersom de analyserte celler inneholder bare noen fremtredende invadopodia, men blir vanskeligere i celler som har titalls invadopodia eller der invadopodia kan være liten og vanskelig å oppdage. Bruke nedbrytning analysen gjør det mulig å beregne hvor stor andel av pre-invadopodia vs. modne invadopodia i enkeltceller eller i en populasjon ved å sammenligne det totale antall celler med invadopodia til andelen som er nedverdigende matrise. Hvis det er et avvik der færre celler er nedverdigende matrise sammenlignet med celler vis invadopodia, kan det tyde på at disse celler er forming før invadopodia som var ute av stand til matrise nedbrytning på det tidspunkt cellene ble løst.Uansett hvilken metode kombinasjonen er valgt for analyse, er det viktig å kvantifisere de ønskede invadopodia karakteristika så objektivt som mulig. Ved innsamling bilder på mikroskopet, velger felt ved å se på celler (aktin), snarere enn den fluorescerende matrise, for å unngå skjevhet fra fortrinnsvis velge områder med høye nivåer av nedbrytning. Spøkelsesbilde bør anskaffes å sikre en rettferdig representasjon av cellepopulasjonen. Bilder bør også ervervet på en passende forstørrelse. For ensartede populasjoner av celler, lavere forstørrelse kanbrukes til å samle flere celler så lenge områdene nedbrytning kan fortsatt løses. Høyere forstørrelse bildene foretrukket å måle områder under individuelle celler og for å løse enkelte invadopodia. Når områder blir kvantifisert, terskelverdier bilder basert på intensiteten er mer objektivt enn manuelt velge området av matrisen å måle. I alle tilfeller bør et tilstrekkelig antall celler fra flere uavhengige eksperimenter bli analysert for å gi statistisk meningsfulle, reproduserbare resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av legat midler fra West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Vi takker Susette Mueller (Georgetown University) og Laura Kelley for tidlig råd og hjelp. Bruken av West Virginia University Mikroskopi Imaging Facility (støttet av Mary Babb Randolph Cancer Center og NIH tilskudd P20 RR16440, P30 RR032138 og P30 GM103488) er takknemlig anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
