Summary
Se describe el método para producir prototípico cubreobjetos de microscopio recubiertos de gelatina fluorescente para visualizar invadopodios mediada por la degradación de la matriz. Técnicas computacionales utilizando software disponible se presentan para la cuantificación de los niveles resultantes de la proteólisis matriz por las células individuales dentro de una población mixta y para los grupos multicelulares que abarcan todo campos microscópicos.
Abstract
La invasión celular del tejido local es un proceso importante en el desarrollo y la homeostasis. Malregulated invasión y el movimiento celular subsiguiente es característica de varios procesos patológicos, incluyendo la inflamación, la enfermedad cardiovascular y la metástasis de células tumorales 1. La degradación proteolítica focalizada de la matriz extracelular (ECM) componentes de la membrana basal epitelial o endotelial es un paso crítico en la iniciación de la invasión celular. En las células tumorales, extensa en análisis in vitro ha determinado que la degradación de ECM se logra ventrales estructuras de membrana ricas en actina-protrusivos denominados invadopodios 2,3. Invadopodios forma en estrecha aposición a la ECM, donde moderada desglose ECM a través de la acción de las metaloproteinasas de matriz (MMP). La capacidad de las células tumorales para formar invadopodios se correlaciona directamente con la capacidad de invadir el estroma local y en los componentes vasculares asociadas 3.
_content "> Visualización de invadopodios mediada por la degradación de ECM de las células por microscopía de fluorescencia utilizando marcada con colorante de proteínas de la matriz recubiertos sobre cubreobjetos de vidrio se ha convertido en la técnica más frecuente para evaluar el grado de proteólisis de la matriz y potencial invasivo celular 4,5. Aquí se describe una versión del método estándar para generar fluorescente marcada con cubreobjetos de vidrio utilizando un comercialmente disponibles Oregon Green-488 conjugado de gelatina. Este método se puede ampliar fácilmente para producir rápidamente grandes cantidades de cubreobjetos recubiertos. Nos muestran algunos de los artefactos comunes microscópicas que se encuentran a menudo durante este procedimiento y cómo estos pueden ser evitados. Finalmente, se describen métodos normalizados utilizando el software de ordenador fácilmente disponibles para permitir la cuantificación de la degradación de la etiqueta matriz de gelatina mediada por células individuales y por completo poblaciones celulares. Los procedimientos descritos proporcionan la capacidad para controlar con precisión y de forma reproducible invadopodiosactividad, y también puede servir como una plataforma para la evaluación de la eficacia de la modulación de la expresión de proteínas o el ensayo de anti-invasivos compuestos sobre la degradación de la matriz extracelular en los ajustes individuales y multicelulares.Protocol
1. Producción de Oregon Green 488-cubreobjetos recubiertos de gelatina
- Preparar una etiqueta 5% (w / w) stock de gelatina / solución de sacarosa mediante la adición de 1,25 g de gelatina y 1,25 g de sacarosa en PBS hasta un volumen final de 50 ml. Se calienta la solución madre de gelatina a 37 ° C y asegurarse de que está totalmente derretido antes de su uso. La tienda de la mezcla final a 4 º C.
- Limpiar 13 mm de diámetro # 1 cubreobjetos de vidrio, colocando un cubreobjetos individuales en cada pocillo de una placa de 24 pocillos de plástico de cultivo de tejidos. Añadir 500 l de 20% de ácido nítrico a cada pocillo e incubar durante 30 min. Aspirar la solución de ácido nítrico y se lava cubreobjetos tres veces con agua desionizada.
- Cubreobjetos capa con 500 l de 50 mg / ml de poli-L-lisina (preparado a partir de 0,1% y la solución madre se diluye en agua desionizada) a cada pocillo durante 20 min a temperatura ambiente. Aspirar la solución y lavar tres veces con PBS. Poli-L-lisina recubrimiento facilita incluso la capa de unión y de la que recubre laBeled gelatina.
- Añadir 500 l de 0,5% de glutaraldehído (recién hecho antes del uso) a cada pocillo y se incuban las placas de 24 pocillos en hielo durante 15 min. Aspirar y lavar tres veces con PBS frío. Asegúrese de retirar todos los restos de PBS antes del recubrimiento de gelatina. Mantener las placas en hielo durante todos los lavados hasta que la gelatina se añade.
- Reconstituir el Oregon Green 488-conjugado de gelatina como por el protocolo del fabricante y deje que se caliente y la no marcada 5% de gelatina / solución de sacarosa a partir de (1,1) a 37 ° C. Diluir una parte Oregon Green 488 gelatina en ocho partes de la etiqueta de gelatina / sacarosa (es decir, 500 l de Oregon Green 488 gelatina en 4 ml de 5% de mezcla de gelatina). Pipetear 100 l de la solución diluida de 488-mezcla de gelatina (mantenido a 37 ° C) a cada cubreobjetos, utilizando suficiente gelatina para recubrir el cubreobjetos sin manual de propagación (que puede conducir a cubreobjetos recubrimiento desigual como se muestra en la Figura 3B). Es importante mantener el diluido 488-gelatina mezcla a 37 °; C durante el procedimiento de recubrimiento para evitar la solidificación prematura. A partir de este paso adelante los cubreobjetos se debe mantener en la oscuridad tanto como sea posible para evitar fotoblanqueo potencial. Otras proteínas ECM conjugados con diferentes fluoróforos pueden ser sustituidos por Oregon Green 488 de gelatina (véase la discusión).
- Una vez que todos los cubreobjetos se recubren en una sola placa, mantenga la placa de pocillos 24 en un ángulo y eliminar el exceso de gelatina a partir de cada pocillo por aspiración al vacío. Incubar cubreobjetos recubiertos en la oscuridad durante 10 min a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, a continuación, añadir 500 l de recién hecho borohidruro de sodio 5 mg / ml (NaBH 4) durante 15 minutos a temperatura ambiente para reducir e inactivar glutaraldehído residual. Borohidruro de sodio es efervescente, y pequeñas burbujas será evidente en y alrededor de cada cubreobjetos.
- Eliminar la solución NaBH 4 por aspiración al vacío con un movimiento rápido barrido alrededor de la parte exterior de cada pocillo. Tenga cuidado de no recoger los cubreobjetos flotantes que se habían desprendido de la parte inferior de la placa de cultivo de tejido durante NaBH 4 tratamiento. Cubreobjetos Independiente que flotan en la parte superior puede ser empujado suavemente hacia abajo hasta el fondo del pozo, pero se debe tener cuidado para no dañar la capa de proteína. Lavar los pocillos tres veces con PBS y luego incubar cubreobjetos en 70% de etanol durante 30 min a temperatura ambiente.
- Utilizando una técnica estéril, transferir las placas que contienen cubreobjetos a un tipo IIA / B campana de cultivo de células de flujo laminar y enjuague cubreobjetos tres veces con PBS estéril. En este punto, los cubreobjetos se pueden almacenar en PBS protegido de la luz a 4 º C durante al menos dos meses.
- Transferir cubreobjetos que se usa para los ensayos de degradación para un pocillo vacío de una nueva placa de 24 pocillos por eliminación cuidadosa con una aguja estéril y fórceps. Equilibrar cubreobjetos durante 1-24 hr con medios completos adecuados para el tipo específico de célula que se está ensayando. El cuidado debe ser tomado nopara invertir el cubreobjetos o rayar el revestimiento de gelatina (véase la Figura 3B).
2. Revestimiento y Tratamiento de celdas en Oregon Green 488-cubreobjetos recubiertos de gelatina a la degradación de ECM Ensayo
- Semilla 3-5x10 4 células sobre un cubreobjetos en cada pocillo de la placa de pocillos 24.
- Realizar un estudio de curso temporal para determinar los tiempos óptimos requeridos para la actividad de degradación invadopodios para la línea celular particular / tipo de interés. Mayoría de las células invasivas requieren un tiempo de entre 4-24 h para la degradación a ser evidente, aunque este intervalo puede variar ampliamente y debe ser determinada empíricamente. Para sincronizar la actividad invadopodios, las células pueden ser tratadas con inhibidores de MMP (por ejemplo, GM 6001) para un período de tiempo deseado, a continuación, lavar el inhibidor para permitir la actividad invadopodios para continuar (por ejemplo, véase 6).
- Enjuague cubreobjetos tres veces con PBS, y luego fijar las células con 500 l de 10% de formalina tamponada con fosfaTE durante 15 min. Enjuague tres veces con PBS y se permeabilizan durante 4 minutos con 0,4% Triton X-100 en PBS. Enjuague tres veces con PBS para eliminar el Triton X-100.
- Células etiqueta utilizando cualquier protocolo estándar para la tinción de inmunofluorescencia (véase, por ejemplo, 7) por las células co-etiquetado con fluorescente conjugado faloidina para visualizar los filamentos de actina (F-actina) y para una proteína marcadora conocida que se localiza en invadopodios (por ejemplo; cortactin 5, TKS5 8, o N-WASP 9). Recuerde evitar el uso de 488-anticuerpos secundarios marcados o GFP-etiquetados proteínas si se utiliza Oregon Green 488 marcado con FITC o gelatina para impedir la interferencia de la señal.
- Montar cubreobjetos teñidos en portaobjetos de microscopio de vidrio con cuidado invirtiendo el cubreobjetos y colocándolo sobre una gota de ProLong Antifade oro o reactivo similar.
- Para evaluar la degradación de la matriz, las células de la imagen en los canales apropiados utilizando un microscopio fluorescente convencional o confocal. La degradación de la gelatinase visualiza como las áreas más oscuras en el cubreobjetos debido a la eliminación proteolítica de la gelatina fluorescente (Figura 4A). El marcaje de células para la actina y una proteína marcadora invadopodios permite la confirmación de invadopodios en los sitios de degradación de la matriz en las imágenes fusionadas (Figura 4A).
- Actividad degradación también se puede controlar en tiempo real imágenes de células vivas con fluorescente de etiquetado proteínas recombinantes para el seguimiento de la formación y degradación de la matriz invadopodios 5,10,11.
3. La cuantificación de la degradación de la gelatina fluorescente mediante la medición de la degradación de matriz normalizada
Este análisis proporciona el área normalizada de degradación de la matriz con respecto a la superficie de las células o el número de células. Es útil para el análisis de los campos enteros de vista microscópico donde las células están presentes múltiples que han sido colectivamente tratados con factores de crecimiento, ARNsi o agentes terapéuticos. Por esta analysis, imágenes recogidas a menor magnificación son suficientes para recoger eficientemente la información sobre poblaciones de células.
- Abra las imágenes en ImageJ 12. ImageJ para la microscopía se puede descargar desde http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- Compruebe la información de escala seleccionando el comando de menú "Analyze / Set Scale." Esta información se importará automáticamente con muchos formatos de archivo, pero se puede introducir manualmente si es necesario. Escala adecuada es necesario informar de las medidas en micras en lugar de píxeles.
- Seleccione las medidas apropiadas para rastrear eligiendo "Analyze / Establecer las medidas." Comprobar área y Limitar a un umbral.
- Calcular el área de la degradación de la imagen fluorescente utilizando gelatina (Figura 5A).
- Umbral de la imagen ("Imagen / Ajustar / Umbral") para establecer el pi superior e inferiorxel valores de intensidad para seleccionar las zonas de degradación (resaltados en rojo; Figura 5B). En las imágenes siguientes, utilice el botón de ajuste de la ventana de umbral para establecer el umbral mismo de todas las imágenes como un medio objetivo para seleccionar el área de la degradación.
- En algunos casos, el cubreobjetos puede no ser perfectamente plana cuando las imágenes se adquieren. Esto hace que la intensidad de la gelatina para cambiar a través de la imagen. Si esta variación crea problemas al umbral de la imagen, corrección de iluminación desigual a través de la gelatina al restar el fondo ("Process / Restar Fondo") o por filtración con un filtro de paso de banda ("Process / APC / paso de banda filtro") o un pseudo flatfield filtro ("Process / Filtros / Pseudo Flatfield") hasta que la intensidad de fondo es uniforme.
- Mida el área de la degradación de la matriz ("Análisis / Analizar partículas"). En la ventana de analizar partículas, seleccione un tamaño de partícula> 0 para eliminar el ruido de tél selección. Mostrar esquemas para identificar regiones de interés (ROI). Compruebe Mostrar resultados Resumir y mostrar las mediciones. Si el dibujo se ha descrito específicamente todas las áreas de degradación (Figura 5C), copie la medida del área total en una hoja de cálculo. Si otros objetos fueron seleccionados (tales como escombros), registrar sólo las áreas de las ROIs pertinente.
- Calcular el área de la celda utilizando el manchado phalloidin (F-actina) imagen (Figura 5D).
- Umbral de la imagen ("Imagen / Ajustar / Umbral") para ajustar los valores de los píxeles superiores e inferiores de intensidad para que los bordes de las celdas seleccionadas (resaltadas en rojo; Figura 5E). En las imágenes siguientes, utilice el botón de ajuste de la ventana de umbral para establecer el umbral mismo de todas las imágenes como un medio objetivo para seleccionar el área celular.
- 10 Medida de la superficie de las células ("Analyze / analizar partículas"). En el Parti Analizarculos ventana, seleccione un tamaño de partícula> 0 para eliminar el ruido de la selección. Mostrar esquemas para identificar las regiones para el análisis (Figura 5F). Compruebe Mostrar resultados Resumir y mostrar las mediciones del área. No comprobar incluir agujeros si hay espacios entre las células en un clúster de modo que los píxeles no seleccionados dentro del clúster no se incluirá en el cálculo del área celular. Haga clic en Aceptar.
- Copie los resultados de área para regiones de interés relevante en una hoja de cálculo.
- Calcular el área de la degradación de la gelatina por la superficie total de las células 13.
- Un enfoque alternativo sería informar de la zona de la degradación por número de células de recuento núcleos (Figura 5G). Esto es necesario si manipulaciones alterar el área de célula entre diferentes grupos de tratamiento en comparación. Conteo automático funciona mejor si los núcleos están bien separados, uniforme en intensidad y redondo. Automáticamente contar nuclei ("Plugins / Análisis de Partículas / Contador Núcleo"). Elija un tamaño de partícula menor y mayor, de un método de umbral y el método de suavizado. Compruebe Reste fondo, filtro de Cuencas, añadir partículas al Administrador de retorno de la inversión y resumen Show (Figura 5H).
- Si los núcleos se solapan ampliamente o tener una forma irregular o la textura, el conteo automático puede no producir un recuento exacto (Figura 5H, las flechas a la derecha). En este caso, el conteo manual puede ser facilitada mediante la herramienta contador de células ("Plugins / análisis de partículas / contador de células"). Esto evitará que se cuentan como las células se marcan durante un conteo manual (Figura 5I).
- Copiar el número de células (núcleos) en una hoja de cálculo. Calcular el área de la degradación de la gelatina por número total de células.
4. La cuantificación de la degradación de la gelatina fluorescente por las células individuales en una población celular mixta Para evaluar la degradación de la matriz resultante de células específicas en una población aparte de otras células dentro del campo (por ejemplo, transfectadas versus no transfectadas las células), el procedimiento en la sección 3 puede ser modificado para medir el área de la degradación en las células individuales. Un canal fluorescente adicional que se necesita para marcar las células transfectadas. En este caso, las imágenes de mayor magnificación y células bien separadas son más fáciles de cuantificar.
- Compruebe la información de escala seleccionando el comando de menú "Analyze / Set Scale." Seleccionar las medidas apropiadas para rastrear eligiendo "Analyze / Establecer las medidas." Comprobar área y Limitar a un umbral.
- Para las células individuales que no están en contacto, identificar cada celda utilizando la imagen de F-actina (Figura 6A). Umbral de la imagen (ver 3,9) (Figura 6B). Es importante para capturar los bordes de las células, pero no puede haber agujeros en el interior que no están incluidos en el umbral. Utilice los mismos valores de intensidad a través de imágenes para seleccionar límites de las celdas.
- Para medir el área de las celdas, utilice "Análisis / Análisis de Partículas." En la ventana Analizar partículas, elija un tamaño> 0 (para eliminar el ruido), esquemas Mostrar y compruebe Mostrar resultados, Añadir al Gerente y disponen de orificios (para grabar toda el área dentro del contorno). Haga clic en Aceptar y registrar el área de cada celda de la ventana de resultados.
- Identificar qué células son transfectadas (Figura 6C).
- Identificar las áreas de degradación utilizando la imagen fluorescente de gelatina (Figura 6D). Si es necesario, se filtra la imagen gelatina para igualar la intensidad de fondo (ver 3.6). Umbral para seleccionar las zonas de degradación, tomando nota de los ajustes de umbral (Figura 6E). En las imágenes posteriores, utilice estos mismos valores de intensidad superiores e inferiores (utilizando el Setbotón en la ventana de umbral) para una selección objetiva de zonas de degradación.
- Medir las áreas de la degradación en las células. En la imagen thresholded gelatina fluorescente, muestran un resumen de las celdas seleccionando ROIs en la ventana del Administrador de retorno de la inversión y la selección de Medida (Figura 6F). Anotar los resultados y calcular el área normalizada de degradación / célula o área de la celda.
5. Los resultados representativos
El esquema general para el procedimiento se muestra en la figura 1. El procedimiento implica la preparación de cubreobjetos de vidrio y revestimiento con fluorescente conjugado con gelatina, el recubrimiento de las células sobre los cubreobjetos recubiertos para permitir que las células para degradar la gelatina, la fijación y el etiquetado de las células para el análisis microscópico de fluorescencia, imágenes de la matriz fluorescente para evaluar la integridad de la matriz, y cuantificar objetivamente el grado de degradación de la matriz de gelatina que usa el ordenador software.
Figura 1. Esquemático general destacando los pasos clave en el enchapado de células fluorescentes gelatina recubrimiento, fijación y immunolabeling y evaluación de la proteólisis de la matriz.
Los pasos clave del procedimiento de elaboración y cubreobjetos de vidrio de revestimiento se describe en la Figura 2.
Figura 2. Esquema que demuestra los pasos individuales en la preparación de cubreobjetos de vidrio para el recubrimiento de matriz de gelatina. Los pasos realizados en la luz (lámpara encendida), en hielo (cubitos) y en la oscuridad (sin iluminación bombilla) son dibujos animados indicado. Los pasos realizados en la ayuda oscuro prevenir photobleaching de las matrices fluorescentes.
Cuando se realiza correctamente, los cubreobjetos son uniformemente recubiertos con Oregon Green 488-conjugado gelatin, mostrando fluorescencia homogénea cuando se visualizaron por microscopía (Figura 3A). Artefactos típicos que pueden surgir debido al revestimiento inadecuado, manipulación, almacenamiento y uso de cubreobjetos recubiertos se muestran en la Figura 3B.
Ejemplos Figura 3. De artefactos encontrados durante la preparación de gelatina recubierto cubreobjetos y manejo. A. vista ortogonal de un confocal z-stack mostrando el color y la consistencia de un verde Oregon 488-conjugado cubreobjetos recubierto de gelatina producida con el protocolo establecido. Los cubreobjetos deben tener un recubrimiento homogéneo ~ 1-2 m de espesor, como se muestra en la XZ (parte inferior) y YZ (derecha) planos confocal B. Artefactos que pueden ocurrir durante el recubrimiento y el procesamiento de gelatina cubreobjetos recubiertos incluyen:. Recubrimiento inadecuado de la cubreobjetos durante el proceso de recubrimiento debidoa la solidificación de mezcla pobre, manual de propagación o parcial de la mezcla de gelatina (revestimiento irregular), la eliminación de la matriz recubierta de anotar con agujas o fórceps durante el manejo (raspadura), el secado de la superficie de cubreobjetos durante periodos prolongados de almacenamiento, lo que resulta en un adoquín " "apariencia (deshidratado) y photobleaching de la superficie fluorescente gelatina durante la imagen debido a la exposición prolongada o la intensidad de luz alta (blanqueo). Flecha blanca indica el área que abarca una blanqueada cabeza OSC19 plateado y cuello de células escamosas carcinoma. El Oregon Green 488-conjugado gelatina se pseudocoloreada blanco para mejorar el contraste de la imagen. Bar, 10 micras.
Las matrices resultantes delgadas producidas durante este procedimiento proporcionan un medio sensible para evaluar la capacidad de las células para degradar ECM. Figura 4 muestra un ejemplo de la actividad de una célula invadopodios OSC19 sembraron en un Oregon Green-488 cubreobjetos gelatina conjugaday imágenes de microscopía confocal convencional, así como por el volumen de llenado de representación de la imagen después de tres deconvolución dimensional.
Figura 4. Ejemplos representativos de actividad invadopodios degradación de la matriz. Una. Visualización de invadopodios y proteólisis correspondiente matriz de gelatina. OSC19 células chapada en Oregon Green 488-conjugados cubreobjetos de gelatina para 10 hr se fijaron y se marcaron con rodamina conjugada con faloidina (F-actina) y anticuerpos anti-cortactin (visualizaron con un Alexa Fluor 647 y el anticuerpo secundario pseudocoloreada verde). Invadopodios son evidentes como focales concentraciones citoplasmáticas de F-actina y cortactin que se superponen con zonas de gelatina de compensación (agujeros oscuros en la matriz) dentro de la imagen combinada. Regiones encuadradas contienen puntas de flecha indican invadopodios individual y áreas de proteólisis matriz focal como se muestra en la re ampliadaregiones inferiores. Bar, a 10 m. B. Volumen de llenado visualización de penetración invadopodios en el ECM. OSC19 células chapados y se tiñeron como en (A) se representan visualmente mediante la obtención de 23 sucesivos 0,32 micras ópticos z rebanadas por un total de 7,04 micras para rodamina conjugada con faloidina y Verde Oregon 488-conjugado de gelatina. El archivo de LSM nativo fijado para cada canal fue abierto en AutoQuant X2.2 software y una deconvolución ciega 3D de cada pila de imágenes se realizó utilizando la configuración recomendada (10 iteraciones, el ruido medio). Las imágenes procesadas se guardan como TIFF pilas que se abrieron entonces en los Elementos de los NEI y representa como una vista de volumen con mezcla alfa. Las LUTs se ajustaron, y un volumen secundario se ha creado para mostrar un borde interior de la célula donde invadopodios están presentes. Dorsal de punta vista demuestra invadopodios (rojo, flechas) insertado en el subyacente gelatina (verde). Ventral de punta vista muestra invadopodios protrusiva y zonas de degradación de la gelatina debajo del cubreobjetoscomo regiones de la actual red de la matriz verde (puntas de flecha). El campo total de la imagen presentada se recorta a 77 x 65 m, la célula es de ~ 60 x 40 m.
La Figura 5 muestra algunos de los pasos importantes para la cuantificación de la degradación normalizado matriz de gelatina, como se describe en el paso 3 del protocolo. Este procedimiento está diseñado para permitir la cuantificación insesgada de degradación de la gelatina en un campo de visión, y es adecuado para la degradación de la matriz atribuirse a muchas células dentro del campo.
Figura 5. Imágenes de captura de pantalla que muestran pasos clave en computacional asistida por cuantificación de la degradación de la gelatina normalizadas de las células dentro de una imagen microscópica completa como se describe en el paso 3 del protocolo. Todas las imágenes fluorescentes han sido convertidos a escala de grises para mostrar mejor la umbralización de rojo y las marcas de ROI. A. Imedad de Oregon Green 488-conjugado gelatina, mostrando las zonas oscuras ("agujeros") donde se ha producido la degradación (paso 3.4). B. thresholded imagen gelatina resaltar las áreas de degradación en rojo (paso 3.5). C. Dibujo mostrando ROI mide por área de degradación (paso 3,7). D. rodamina phalloidin tinción de actina F (paso 3,8). E. thresholded imagen actina destacando área total de células en rojo (paso 3,9). Dibujo F. mostrando áreas de celda a medir (paso 3,10) . G. Imagen de núcleos de células DAPI-manchado (paso 3,13). H. Red delinea mostrar resultados de conteo de núcleos automático (paso 3,13). El filtro de Cuenca tiene el potencial de núcleos separados que están en contacto (flecha blanca). Si los núcleos se solapan ampliamente, no se puede separar en objetos individuales (flecha roja). Si un núcleo tiene una forma irregular, puede ser separada en múltiples objetos (flecha amarilla). I. </ Strong> Resultados de la marca núcleos durante un conteo manual utilizando la herramienta de contador de células (paso 3,14).
Figura 6. demuestra pasos SELECT involucradas en la cuantificación fluorescente degradación de la gelatina por las células individuales dentro de una población celular mixta como se describe en el paso 4 protocolo. Aquí, la degradación de la matriz por las células transfectadas se pueden analizar en una población mixta de células transfectadas y no transfectadas.
Figura 6. Pantalla capturar imágenes de los pasos involucrados en la cuantificación de la degradación de la gelatina de las células transfectadas individuales dentro de una población celular. La cuantificación de una sola célula transfectada cortactin OSC19 overexpressing recombinante fusionado a la etiqueta de epítopo FLAG se muestra como un ejemplo. Todas las imágenes fluorescentes han sido convertidos a escala de grises para mostrar mejor la umbralización rojo y marcas amarillas ROI. A. B. Dibujo del área total de células basado en la tinción de F-actina después de la aplicación de los umbrales y analizar las funciones de las partículas (paso 4,2-3). C. imagen confocal de inmunomarcación anti-FLAG de la población de células que demuestra una sola célula que expresa la bandera de etiquetado cortactin (marcados con *) (paso 4.4). D. Imagen de Oregon Green 488-conjugado con gelatina, que muestra las zonas oscuras ("agujeros") donde la degradación tiene ocurrido (paso 4.5) E. thresholded imagen gelatina destacando las áreas oscuras de la degradación en rojo (paso 4.5). F. thresholded imagen superpuesta gelatina con contornos celulares de panel B (paso 4.6). Tenga en cuenta que sólo los píxeles thresholded dentro de los contornos celulares se cuentan en el análisis. Áreas de degradación fuera de la ubicación actual de la celda (flecha blanca) son resultado de la migración de células a través de la gelatina con el tiempo y no son incluDED en el análisis.
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Discussion
La capacidad de visualizar las células que degradan la matriz extracelular ha ayudado en el descubrimiento de los mecanismos moleculares empleados en los pasos tempranos de la invasión celular. Por primera vez por Wen-Tien Chen en el 1980 principios de 4,14,15, revestimiento de la etiqueta fluorescente proteínas extracelulares en cubreobjetos de vidrio para análisis microscópico posterior se ha convertido en la principal técnica para evaluar la función invadopodios a través de una amplia gama de tipos de células. El protocolo prescrito muestra el método básico que se utiliza para la preparación de gelatina cubreobjetos recubiertos que forman una capa de colágeno a menos de 2 m de espesor adecuado para la detección de la degradación de la matriz extracelular por las células en microscopios de fluorescencia confocal y más convencionales 11,16-18, similar a lo que tiene ha descrito previamente 19-21. Estas propiedades permiten una rápida producción de cubreobjetos recubiertos capaces de detectar la aparición inicial de la degradación de la matriz. La sensibilidad conferida por the resultante matriz de gelatina fina sobre las ayudas subyacentes duros superficie de cristal probables en la promoción de la formación de invadopodios como una respuesta a la alta rigidez inherente del ambiente de la matriz general 22. Sin embargo, estas matrices no son muy adecuadas para el análisis de la elongación invadopodios o evaluación morfológica adicional que se ha logrado usando más grueso (30-100 micras) capas de gelatina con metodología similar, transwells recubiertos o microscopía electrónica 20,23,24.
Hemos encontrado que la pre-conjugado producido comercialmente Oregon Green 488 gelatina permite para el grupo experimental rápido y resultados consistentes y reproducibles. Sin embargo, la conjugación borato alcalino de isotiocianato de fluoresceína (FITC) a no marcado gelatina sigue siendo un método popular y económico para producir conjugados fluorescentes de gelatina 20. La fibronectina también se utiliza como una proteína de matriz alternativa para el etiquetado y el cubreobjetos de recubrimiento 4,9, y en algunos casos envestigators han usado fibronectina marcada en capas sobre cubreobjetos recubiertos de gelatina sin etiqueta para crear matrices densas 11,25. Otras matrices pueden utilizarse, dependiendo de la especificidad del tipo celular. Además de los tintes en el espectro verde 488 nm, una amplia variedad de fluoróforos se han utilizado también con métodos de acoplamiento manuales para generar cubreobjetos con espectros de fluorescencia diferente, incluyendo rodamina 21,26, Alexa Fluor 350 24, 546 21, 568 5,11 , 594 27 y 647 tintes 5. Tales conjugados son fácilmente adaptables para su uso en el protocolo prescrito, proporcionando la flexibilidad para la utilización de colorantes específicos ECM proteínas combinaciones adecuadas para la mayoría de cualquier imagen de conjunto de filtros.
Las técnicas descritas en este documento proporcionan los pasos necesarios para la utilización de ImageJ detalladas para cuantificar la degradación de matriz de gelatina atribuido a las células individuales en una población heterogénea o para grupos de células enteras como se publicó previamente 6,28. El software propietario también se ha empleado con éxito para el mismo propósito 5,25. En este protocolo, el área de la degradación de la matriz se normaliza a ya sea la superficie total de las células o el número total de células (núcleos) en el campo. En general, las dos opciones para la normalización dará el mismo resultado (ELW, datos no mostrados). Sin embargo, si las diferentes líneas celulares con diferentes células de tamaño están siendo comparados o si el tratamiento experimental hace que las células para cambiar el tamaño, entonces puede ser más preciso para normalizar el número de células. Por otro lado, muchas líneas de células cancerosas tienen un alto porcentaje de células multinucleadas, en cuyo caso área total de la célula puede ser un parámetro más preciso para la normalización. También, si solamente una parte de una célula se capturado en una imagen (Figura 6), que puede ser mejor para normalizar a área de la célula en lugar de subestimar el potencial para la degradación de una célula individual. Es importante optimizar el análisis de imágenes para mejor trajelas características y los matices de la configuración experimental específico.
Para determinar el número de células en un campo apretado, contando núcleos es a menudo el método de elección. ImageJ tiene un plugin contador de núcleos para el conteo automático. Una de las opciones de esta herramienta es el filtro de Cuencas. Este filtro puede ayudar núcleos separados que están en contacto mediante la segregación en objetos individuales (Figura 5H, flecha blanca). Sin embargo, este filtro no puede ser capaz de núcleos separados que se solapan ampliamente (Figura 5H, flecha roja). Además, si un núcleo tiene una forma irregular y grandes variaciones en intensidad, el filtro puede separar un único núcleo en múltiples objetos (Figura 5H, flecha amarilla). Por lo tanto, es importante tratar diferentes métodos de umbralización y alisado en este plugin para determinar los mejores parámetros para el análisis. Si el conteo automático no produce números exactos, el plugin contador de células puede faci litate recuento manual de las células o núcleos.
En los casos que utilizan la transfección transitoria, las imágenes a menudo contienen una mezcla de células que expresan o que no expresan una proteína de interés (Figura 6). En este escenario, no siempre es evidente que las células eran responsables de la creación de áreas de degradación de la matriz. Esto es especialmente cierto si las células a migrar a través de la gelatina. Para ser consistente en el análisis, es importante medir solamente las áreas degradadas directamente debajo de cada célula. Por umbralización para seleccionar las zonas oscuras en la matriz y el uso de la actina para generar contornos celulares, sólo las áreas degradadas en las células se cuantificaron. Este procedimiento se excluyen las zonas degradadas fuera de los límites de celda de análisis (Figura 6F flecha). El ensayo puede requerir optimización para seleccionar un punto de tiempo que permite el tiempo suficiente para la degradación antes de que las células hayan tenido la oportunidad de mover.
"> Métodos se han desarrollado numerosos para cuantificar la formación invadopodios y función. Además de la degradación de la matriz, otros parámetros frecuentemente reportados incluyen la determinación del número de invadopodios por célula, el porcentaje de células que muestran invadopodios dentro de una población dada, y el número de" inmaduro "o" pre "no degrada invadopodios comparación con" madura "capaz de degradar el ECM 11,13,25,26 invadopodios. El método (s) de elección para la evaluación invadopodios depender de las características inherentes a cada tipo de célula. Por ejemplo, contando el número de invadopodios por célula o la determinación del porcentaje de células que contienen invadopodios es un enfoque sencillo que funciona bien si las células analizadas contienen sólo un invadopodios prominente pocos, pero se hace más difícil en las células que tienen docenas de invadopodios o donde invadopodios puede ser pequeña y difícil de detectar. Usando el ensayo de degradación hace que sea posible calcular el porcentaje de pre-invadopodios vs. invadopodios madura en células individuales o en una población mediante la comparación del número total de células con invadopodios al porcentaje que son degradar la matriz. Si hay una discrepancia en menor cantidad de células que degradan la matriz en comparación con las células que presentan invadopodios, se puede indicar que estas células están formando pre-invadopodios que eran incapaces de degradación de la matriz en el momento las células se fijaron.Sea cual sea el método elegido combinación de análisis, es importante cuantificar las características deseadas invadopodios la forma más objetiva posible. Al recoger imágenes en el microscopio, elegir campos al observar las células (actina), en lugar de la matriz fluorescente, para evitar el sesgo de la selección de áreas preferentemente con altos niveles de degradación. Las imágenes múltiples se deben adquirir para asegurar una representación justa de la población celular. Las imágenes también deben ser adquiridas a un aumento apropiado. Para las poblaciones de células uniformes, menor aumento posibleser utilizado para recoger más células, siempre y cuando las áreas de degradación todavía se puede resolver. Las imágenes de mayor magnificación son los preferidos para medir las áreas bajo las células individuales y para resolver invadopodios individual. Cuando las áreas se cuantificó, umbralización imágenes basada en la intensidad es más objetivo que elegir manualmente el área de la matriz de medir. En todos los casos, un número suficiente de células de múltiples experimentos independientes deben ser analizados para dar estadísticamente significativas y resultados reproducibles.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de dotación de la Universidad de West Virginia María Babb Randolph Cancer Center. Damos las gracias a Susette Mueller (Georgetown University) y Laura Kelley para asesoramiento y una asistencia. La utilización del Fondo para la Universidad de West Virginia imágenes Microscopía (apoyado por el Mary Babb Randolph Cancer Center y subvenciones NIH P20 RR16440, RR032138 P30 y P30 GM103488) Se agradece.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
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