Summary
Vi beskriver den prototypiska metod för att framställa mikroskop täckglas belagda med fluorescerande gelatin för att visualisera invadopodia-medierad matrisnedbrytning. Beräkningstekniker med tillgänglig programvara presenteras för att kvantifiera de resulterande nivåerna av matris proteolys av enskilda celler i en blandad befolkning och för flercelliga grupper som utövar hela mikroskopiska fält.
Abstract
Cellulär invasion till lokala vävnader är en process viktig för utveckling och homeostas. Malregulated invasion och efterföljande cellrörelse är karakteristisk för flera patologiska processer, inklusive inflammation, hjärt-kärlsjukdomar och tumörcellmetastas 1. Focalized proteolytisk nedbrytning av extracellulära matris (ECM) komponenter i det epiteliska eller endoteliala basalmembranet är ett kritiskt steg i att initiera cellulär invasion. I tumörceller har omfattande in vitro-analys fastställt att ECM-nedbrytning åstadkommes genom ventrala aktin-rika membran FRAMSKJUTANDE strukturer benämnda invadopodia 2,3. Invadopodia form i nära apposition till ECM, där de måttlig ECM nedbrytning genom verkan av metalloproteinaser (MMP). Förmågan hos tumörceller att bilda invadopodia korrelerar direkt med förmågan att invadera lokala in stroma och tillhörande vaskulära komponenter 3.
_content "> Visualisering av invadopodia-medierad ECM-nedbrytning av celler genom fluorescensmikroskopi med färgämnesmärkta matrisproteiner belagda på täckglas har blivit den vanligaste tekniken för att utvärdera graden av matris proteolys och cellulär invasiv potential 4,5. Här beskriver vi en version av standardmetoden för att generera fluorescensmärkta täckglas med användning av en kommersiellt tillgänglig Oregon Grön-488 gelatin konjugat. Denna metod är lätt skalas att snabbt framställa stora antal av belagda täckglas. Vi visar några av de vanligaste mikroskopiska artefakter som ofta påträffas under denna procedur och hur dessa kan undvikas. Slutligen beskriver vi standardiserade metoder med lättillgänglig programvara för att möjliggöra kvantifiering av märkt gelatin matrisnedbrytning medierad av enskilda celler och hela cellpopulationer. De beskrivna förfarandena ger möjlighet att exakt och reproducerbart övervaka invadopodiaaktivitet, och kan också fungera som en plattform för att utvärdera effekten av modulera proteinexpression eller testning av anti-invasiva föreningar på extracellulär matrisnedbrytning i enkel-och flercelliga inställningar.Protocol
1. Produktion av Oregon Grön 488-gelatinbelagda Täckglas
- Förbered en omärkt 5% (vikt / vikt) lager gelatin / sackaroslösning genom tillsats 1,25 g gelatin och 1,25 g sackaros i PBS till en slutlig volym av 50 ml. Värm beståndet gelatinlösningen till 37 ° C och se till att den är helt smält före användning. Förvara den slutliga blandningen vid 4 ° C.
- Clean 13 mm diameter # 1 täckglas genom att placera en individuell täckglas i varje brunn i en 24 väl plast vävnadsodlingsplatta. Lägg 500 pl 20% salpetersyra till varje brunn och inkubera under 30 min. Aspirera salpetersyralösningen och tvätta täckglas tre gånger med avjoniserat vatten.
- Coat täckglas med 500 pl av 50 pg / ml poly-L-lysin (framställd från 0,1% förrådslösning och späddes i avjoniserat vatten) till varje brunn under 20 minuter vid rumstemperatur. Aspirera lösningen och tvätta tre gånger med PBS. Poly-L-lysin beläggning underlättar jämn beläggning och bindning av den överliggande labeled gelatin.
- Lägg 500 pl 0,5% glutaraldehyd (gjort färskt före användning) till varje brunn och inkubera 24 brunnsplattor på is under 15 minuter. Aspirera och tvätta tre gånger med kall PBS. Var noga med att avlägsna alla spår av PBS före gelatin beläggning. Håll plattor på is under alla tvättar tills gelatinet tillsätts.
- Rekonstituera Oregon Grön 488-konjugerad gelatin enligt tillverkarens protokoll och värma den och den omärkta 5% gelatin / sackaroslösning från (1,1) till 37 ° C. Späd en del Oregon Grön 488 gelatin i åtta delar av omärkt gelatin / sackaros (dvs., 500 pl av Oregon Grön 488 gelatin i 4 ml 5% gelatin blandning). Pipettera 100 | il av den utspädda 488-gelatin blandningen (hölls vid 37 ° C) på varje täckglas, med tillräckligt gelatin för att belägga täckglas utan manuell spridning (vilket kan leda till ojämn beläggning täckglas, såsom visas i figur 3B). Det är viktigt att hålla den utspädda 488-gelatin blandningen vid 37 °, C under beläggningen förfarandet för att förhindra för tidig stelning. Från detta steg framåt täckglasen bör hållas i mörker så mycket som möjligt för att undvika eventuella fotoblekning. Andra ECM-proteiner konjugerade till olika fluoroforer kan användas i stället för Oregon Grön 488 gelatin (se Diskussion).
- När alla täckglas är belagda i en enda platta, håll 24 brunnars platta vid en vinkel och avlägsna överskott av gelatin från varje brunn genom vakuumsugning. Inkubera belagda täckglas i mörker under 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta täckglasen tre gånger med PBS, tillsätt sedan 500 | il av nyligen gjorda 5 mg / ml natriumborhydrid (NaBH 4) under 15 min vid rumstemperatur för att minska och inaktivera resterande glutaraldehyd. Natriumborhydrid är sprudlande och små bubblor kommer att framgå på och runt varje täckglas.
- Avlägsna NaBH 4 lösningen genom vakuumsugning med en snabb svepande rörelse runt utsidan av varje brunn. Se till att inte plocka upp några flytande täckglas som blev avskild från botten av vävnadsodlingsplatta under NaBH 4 behandlingen. Fristående täckglas som flyter upp kan försiktigt pressas tillbaka ner till brunnens botten, men man måste vara försiktig för att undvika skador på proteinet beläggning. Tvätta varje brunn tre gånger med PBS och sedan inkubera täckglas i 70% etanol under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Med steril teknik, överföra täckglas innehållande plattor till en typ IIA / B cellodling laminärt flöde huva och skölj täckglas tre gånger med steril PBS. Vid denna punkt täckglas kan lagras i PBS skyddas från ljus vid 4 ° C under minst två månader.
- Överför täckglas som skall användas för nedbrytning analyser för att en tom brunn i en ny 24-brunnsplatta genom noggrann borttagning med en steril nål och pincett. Jämvikt täckglas för 1-24 timmar med komplett medium lämpligt för den specifika celltypen som analyseras. Man måste vara försiktig inteatt invertera täckglas eller repa gelatinbeläggning (se figur 3B).
2. Plätering och bearbetning av celler på Oregon Grön 488-gelatinbelagda Täckglas att analysera ECM nedbrytning
- Seed 3-5x10 4 celler på ett täckglas inom varje brunn i platta med 24 brunnar.
- Genomföra en studie tidsförlopp för att bestämma optimala tider som krävs för invadopodia nedbrytning aktivitet för den speciella cellinje / typ av intresse. Mest invasiva celler kräver en tid mellan 4-24 h för nedbrytning att bli uppenbara, även om detta intervall kan variera inom vida gränser och bör bestämmas empiriskt. Att synkronisera invadopodia aktivitet, kan celler behandlas med MMP-inhibitorer (t ex GM 6001) för en önskad tidsperiod, sedan tvätta ut inhibitorn att låta invadopodia aktivitet fortsätta (se till exempel 6).
- Skölj täckglas tre gånger med PBS, sedan fixera celler med 500 pl 10% buffrad formalin fosfate under 15 min. Skölj tre gånger med PBS och permeabilisering under 4 min med 0,4% Triton X-100 i PBS. Skölj tre gånger med PBS för att avlägsna Triton X-100.
- Label celler använder någon standardprotokoll för immunofluorescensfärgning (se 7 till exempel) genom samtidig märkning celler med fluorescerande konjugerad falloidin att visualisera aktinfilament (F-aktin) och för en känd markörprotein som lokaliserar till invadopodia (t.ex., cortactin 5, TKS5 8, eller N-WASP 9). Kom ihåg att undvika att använda 488-märkta sekundära antikroppar eller GFP-märkta proteiner om du använder Oregon Grön 488 eller FITC-märkt gelatin för att förhindra signalstörningar.
- Montera färgade täckglas på objektglas glasmikroskop genom att försiktigt vända täckglas och placera den på en droppe förlänga guld antifad eller liknande reagens.
- För att bedöma matrisnedbrytning, bild celler i lämpliga kanaler med en konventionell lysrör eller konfokalmikroskop. Gelatin nedbrytningvisualiseras som mörkare områden på täckglaset på grund av proteolytiskt avlägsnande av den fluorescerande gelatinet (figur 4A). Märkning av celler för aktin och ett invadopodia markörprotein medger bekräftelse av invadopodia vid ställen för matrisnedbrytning i sammanslagna bilder (figur 4A).
- Nedbrytning aktivitet kan också övervakas i realtid genom levande cell imaging med fluorescerande-märkta rekombinanta proteiner för att spåra invadopodia bildning och matrisnedbrytning 5,10,11.
3. Kvantifiering av fluorescerande Gelatin nedbrytning genom mätning Normaliserad matrisnedbrytning
Denna analys ger den normaliserade området matrisnedbrytning förhållande till området av celler eller antalet celler. Det är användbart för att analysera hela mikroskopiska synfält där flera celler är närvarande som tillsammans har behandlats med siRNA, tillväxtfaktorer eller terapeutiska medel. För detta analysis, bilder insamlade vid lägre förstoring är tillräckliga för att effektivt samla in information om populationer av celler.
- Öppna bilderna i ImageJ 12. ImageJ för mikroskopi kan laddas ner från http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- Kontrollera skalan informationen genom att välja menykommandot "Analysera / Set Scale." Denna information kommer att importera automatiskt med många filformat, men kan ställas in manuellt om det behövs. Korrekt skalning är nödvändigt att rapportera mätningar i mikron istället pixlar.
- Välj lämpliga mätningar för att spåra genom att välja "Analysera / Set Mätningar." Kontrollera området och Gräns för Threshold.
- Beräkna arean av nedbrytning med användning av den fluorescerande gelatinet bilden (figur 5A).
- Tröskelvärde bilden ("Bild / Justera / Threshold") för att ställa in övre och nedre pixel intensitetsvärden att välja områdena nedbrytning (markerade i rött, Figur 5B). I efterföljande bilder kan du använda Set-knappen i Threshold fönstret för att ställa in samma tröskel för alla bilder som ett mål innebär att välja nedbrytning område.
- I vissa fall, kan täckglaset inte helt plant när bilder förvärvas. Detta bringar intensiteten av gelatin för att ändra över bilden. Om denna variation skapar problem när tröskling av bilden, korrigera för ojämn belysning över gelatinet genom att subtrahera bakgrunden ("Process / Subtrahera Bakgrund") eller genom filtrering med ett bandpassfilter ("Process / FFT / bandpassfilter") eller en pseudo flatfield filter ("Process / Filter / Pseudo Flatfield") tills bakgrunden intensitet är enhetlig.
- Mät området matrisnedbrytning ("Analysera / analysera partiklar"). I analysera partiklar fönstret väljer du en partikelstorlek> 0 för att ta bort brus från than valet. Visa konturer för att identifiera områden av intresse (ROI). Kontrollera Visa resultat och sammanfatta att visa mätningar. Om ritningen har särskilt beskrivits alla de områden av nedbrytning (Figur 5C), kopiera den totala arean mätningen till ett kalkylblad. Om andra objekt valdes (såsom skräp), registrera endast de områden av den relevanta ROI.
- Beräkna cellområdet med falloidin färgade (F-aktin) bild (figur 5D).
- Tröskelvärde bilden ("Bild / Justera / Threshold") för att ställa in högsta och lägsta värde pixelintensiteten så att kanterna av cellerna är markerade (markerade i rött, figur 5E). I efterföljande bilder kan du använda Set-knappen i Threshold fönstret för att ställa in samma tröskel för alla bilder som ett mål innebär att välja cellområdet.
- 10 Mät området hos cellerna ("Analysera / analysera partiklar"). I Analysera Partiartiklarna fönstret väljer du en partikelstorlek> 0 för att ta bort brus från markeringen. Visa konturer för att identifiera områden för analys (Figur 5F). Kontrollera Visa resultat och sammanfatta att visa området mätningar. Markera inte Inkludera hål om det finns mellanrum mellan celler i ett kluster så omarkerade pixlar inom klustret inte kommer att ingå i cellområdet beräkningen. Välj OK.
- Kopiera Area för relevanta ROI i ett kalkylblad.
- Beräkna arean av gelatin nedbrytning per total yta av celler 13.
- Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att rapportera området nedbrytning per antal celler från räkna kärnor (figur 5G). Detta är nödvändigt om manipulationer ändra cellområdet mellan olika jämfört behandlingsgrupperna. Automatisk räkning fungerar bäst om kärnor är väl åtskilda, enhetlig intensitet och runda. Automatiskt räkna NucleI ("Plugins / partikelanalys / Nucleus Counter"). Välj minsta och största partikelstorlek en tröskel metod och en Utjämning metod. Kontrollera Subtrahera bakgrund, Watershed filter, Lägg partiklar ROI Manager och Show Sammanfattning (Figur 5H).
- Om kärnor överlappar omfattande eller har en oregelbunden form eller struktur, får automatisk räkning ger inte en exakt räkning (Figur 5H, pilar på höger). I detta fall, kan manuell räkning underlättas med hjälp av verktyget cellräknare ("Plugins / partikelanalys / cell Counter"). Detta kommer att hålla räknas som celler markeras under en manuell räkning (figur 5I).
- Kopiera antalet celler (kärnor) i ett kalkylblad. Beräkna arean av gelatin nedbrytning per totalt antal celler.
4. Kvantifiering av fluorescerande Gelatin nedbrytning av enskilda celler i en blandad Cellulär Befolkning Att utvärdera matrisnedbrytning följd av specifika celler i en population från andra celler inom området (t.ex., transfekterade kontra icke-transfekterade celler), kan proceduren i avsnitt 3 modifieras för att mäta området för nedbrytning under individuella celler. En ytterligare fluorescerande kanalen behövs för att markera transfekterade celler. I detta fall högre förstoring bilder och väl separerade celler är lättare att kvantifiera.
- Kontrollera skalan informationen genom att välja menykommandot "Analysera / Set Scale." Välj lämpliga mätningar för att spåra genom att välja "Analysera / Set Mätningar." Kontrollera området och Gräns för Threshold.
- För enskilda celler som inte vidrör, identifiera varje cell som använder F-aktin bild (figur 6A). Tröskelvärde bilden (se 3,9) (Figur 6B). Det är viktigt att fånga kanterna hos cellerna, men det kan finnas håls insidan som inte ingår i tröskeln. Använd samma intensitetsvärdena över bilden för att välja cell gränser.
- För att mäta området av cellerna, använd "Analysera / analysera partiklar." I analysera partiklar fönstret genom att välja en storlek> 0 (för att eliminera brus), Visa konturer och kontrollera Visa resultat, Lägg till Manager och Inkludera hål (för att spela in hela området innanför konturerna). Välj OK och spela området för varje cell från fönstret Resultat.
- Identifiera vilka celler transfekteras (fig. 6C).
- Identifiera de områden av nedbrytning med hjälp av fluorescerande gelatin bilden (Figur 6D). Vid behov, filtrera gelatin bilden för att jämna bakgrunden intensitet (se 3,6). Tröskel att välja områdena nedbrytning, vilket gör notera tröskelvärdet inställningar (Figur 6E). På efterföljande bilder, använda samma övre och nedre intensitetsvärden (med hjälp av Setknappen i Tröskelvärde fönster) för en objektiv val av områden av nedbrytning.
- Mät områdena nedbrytning under cellerna. På tröskeljämförd fluorescerande gelatinet bild visar en översikt av cellerna genom att välja ROI i ROI Manager och välja Mått (figur 6F). Registrera resultaten och beräkna normaliserade området nedbrytning / cell eller område.
5. Representativa resultat
Den övergripande schema för förfarandet visas i figur 1. Förfarandet innebär framställning av täckglas och beläggning med fluorescent konjugerad gelatin, plätering av celler på de belagda täckglas att tillåta celler att degradera gelatinet, fixering och märkning av celler för mikroskopisk fluorescens analys, den fluorescerande matrisen avbildning för att bedöma integriteten matrisen, och objektivt kvantifiera graden av gelatin matrisnedbrytning med dator software.
Figur 1. Total schema belyser de viktigaste stegen i fluorescerande gelatinbeläggning, cell plätering, fixering och immunomärkning, och utvärdera matris proteolys.
De viktigaste stegen i förfarandet är involverade i att förbereda och beläggning täckglas glas beskrivs i figur 2.
Figur 2. Schematisk visar de individuella stegen i att förbereda täckglas för gelatin matris beläggning. Steg som utförs i ljuset (tänd lampa), på is (kuber) och i mörker (icke-belysta lampa) är tecknad anges. Steg genomförts i den mörka bidra till att förhindra fotoblekning av de fluorescerande matriser.
När korrekt utförd, är täckglas jämnt belagda med Oregon Grön 488-konjugerad gelatin, visar homogen fluorescens när visualiseras genom mikroskopi (figur 3A). Typiska artefakter som kan uppstå på grund av felaktig beläggning är hantering, lagring och användning av belagda täckglas visas i figur 3B.
Figur 3. Exempel på artefakter uppstår under gelatin belagda täckglas beredning och hantering. A. ortogonal vy av en konfokal z-stack som visar den typiska färg och konsistens en Oregon Grön 488-konjugerad gelatin belagda täckglas produceras med den föreskrivna protokollet. Täckglas bör ha en homogen beläggning ~ 1-2 | im tjock, såsom visas i XZ (botten) och YZ (höger) konfokala plan B. artefakter som kan inträffa under beläggningen och bearbetning av gelatin-belagda täckglas inkluderar:. Felaktig övertäckning av täckglas under beläggningsförfarandet på grundtill dålig blandning, manuell spridning eller partiell stelning av gelatin blandningen (ojämn beläggning), avlägsnande av den belagda matrisen genom poängsättning med nålar eller pincett vid hantering (skrapa), torkning av täckglaset ytan under längre lagringsperioder, vilket resulterar i en "gatsten "utseende (uttorkad) och fotoblekning av fluorescerande gelatin ytan under avbildning på grund av långvarig eller hög intensitet ljusexponering (blekning). Vita pilen indikerar blekt område som omfattar en pläterad OSC19 huvud och hals skivepitelcancer cancer cell. Oregon Grön 488-konjugerad gelatin pseudocolored vit för att förbättra bildens kontrast. Bar, 10 um.
De resulterande tunna matriser som bildas under detta förfarande ger ett känsligt medel för att utvärdera förmågan hos celler att bryta ned ECM. Figur 4 visar ett exempel på invadopodia aktivitet från en cell OSC19 stryks ut på en Oregon Grön-488 konjugerad gelatin täckglasoch avbildas genom konventionell konfokal mikroskopi liksom av volym-fill bildåtergivning efter tredimensionell avfaltning.
Figur 4. Representativa exempel på invadopodia matrisnedbrytning aktivitet. En. Visualisering av invadopodia och motsvarande gelatin matris proteolys. OSC19 celler pläterade om Oregon Grön 488-konjugerade gelatin täckglas för 10 timmar fixerades och märktes med rodamin-konjugerat falloidin (F-aktin) och anti-cortactin antikroppar (visualiseras med en Alexa Fluor 647 sekundär antikropp och pseudocolored grön). Invadopodia är tydliga som fokala cytoplasmiska koncentrationer av F-aktin och cortactin som överlappar med områden av gelatin clearing (mörka hål i matrisen) inom den sammanslagna bilden. Inramade regioner innehåller pilspetsar indikerar individuell invadopodia och områden av fokal matris proteolys som visas i den förstorade reregioner nedan. Bar, 10 um. B. Volym fylla visualisering av invadopodia inträngning i ECM. OSC19 celler pläterade och färgades såsom i (A) var visuellt återges genom att erhålla 23 successiva 0,32 um optisk z-skivor totalt 7,04 um för rodamin-konjugerat falloidin och Oregon Grön 488-konjugerad gelatin. Den naturliga LSM-fil för varje kanal öppnades i AutoQuant X2.2 mjukvara och en 3D blinda dekonvolution av varje bild stack utfördes med de rekommenderade inställningarna (10 iterationer, medelhög buller). De bearbetade bilderna sparas som TIFF stackar som sedan öppnades i NIS Elements och återges som en volym vy med alfablandning. De LUT justerades, och en undervolym skapades för att visa en kant inuti cellen där invadopodia är närvarande. Dorsal-kantvy visar invadopodia (röd, pilar) in i underliggande gelatin (grön). Ventral kant vy visar FRAMSKJUTANDE invadopodia och områden av gelatin nedbrytning under täckglasetsom regioner av röd närvarande i gröna matrisen (pilspetsar). Den totala bildfältet som presenteras är beskuren till 77 x 65 um, cellen är ~ 60 x 40 um.
Figur 5 visar några av de viktiga stegen för kvantifiering av normaliserad gelatin matrisnedbrytning som beskrivs i steg 3 i protokollet. Detta förfarande är utformat för att möjliggöra objektiv kvantifiering av gelatin nedbrytning i en hela synfältet, och är lämplig för matrisnedbrytning tillskrivas många celler inom området.
Figur 5. Skärmdumpsbilder visar viktiga steg i beräkningsbiologi-assisterad kvantifiering av normaliserad gelatin nedbrytning för celler i en hel mikroskopisk bild som beskrivs i protokoll steg 3. Alla fluorescerande bilder har omvandlats till gråskala för att bättre visa röda tröskling och märkning ROI. A. Imålder Oregon Grön 488-konjugerad gelatin, som visar mörka områden ("hål") där nedbrytningen har uppstått (steg 3,4). B. tröskeljämförd gelatin bild belysa de områden av nedbrytning i rött (steg 3,5). C. Ritning ROI mäts för området av nedbrytning (steg 3,7). D. Rhodamine falloidin färgning av F-aktin (steg 3,8). E. tröskeljämförd aktin bild belyser den totala cellområde i rött (steg 3,9). F. Ritning cellområden ska mätas (steg 3,10) . G. Bild av DAPI-färgade cellkärnor (steg 3,13). H. Röd beskriver utställningsresultat från automatisk kärnor räkna (steg 3,13). Vattendelaren filtret har potential att separera kärnor som rör (vit pil). Om kärnor överlappar i stor utsträckning kan de inte separeras till enskilda objekt (röd pil). Om en kärna har en oregelbunden form, kan den delas in i flera objekt (gul pil). I. </ Strong> Resultat från markering kärnor under en manuell räkning med hjälp av verktyget cellräknare (steg 3,14).
Figur 6. visar utvalda steg i kvantifiera fluorescerande gelatin nedbrytning av enskilda celler i en blandad cellulär population som beskrivs i protokoll steg 4. Här kan matrisnedbrytning av transfekterade celler kan analyseras inom en blandad population av transfekterade och icke-transfekterade celler.
Figur 6. Skärm ta bilder av stegen i kvantifiera gelatin nedbrytning från enskilda transfekterade celler i en cellpopulation. Kvantifiering av en enda transfekterad OSC19 cell överuttrycker rekombinant cortactin fuserad till FLAG-epitopen taggen visas som ett exempel. Alla fluorescerande bilder har omvandlats till gråskala för att bättre visa röda tröskling och gula markeringar ROI. A. B. Ritning av totalt cell-område grundat på F-aktin färgning efter applicering av tröskeln och analysera partiklar funktioner (steg 4,2-3). C. Confocal bild av anti-FLAG immunomärkning av cellpopulationen visar en enda cell som uttrycker FLAG-märkt cortactin (markerade med *) (steg 4,4). D. Bild av Oregon Grön 488-konjugerad gelatin, som visar mörka områden ("hål") där nedbrytningen har förekommit (steg 4,5) E. tröskeljämförd gelatin bild belyser mörka områden av nedbrytning i rött (steg 4,5). F. tröskeljämförd gelatin bild övertäckt med cell konturer från panel B (steg 4,6). Observera att endast de tröskelbehandlade pixlarna i cellen konturerna räknas i analysen. Områden av nedbrytning utanför den aktuella cellen plats (vit pil) resultat från cell migration över gelatinet över tid och är inte inkluded i analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att visualisera celler bryter ned den extracellulära matrisen har hjälpt att upptäcka de molekylära mekanismerna som används i de tidiga stegen av cellinvasion. Uppfunnen av Wen-Tien Chen i början av 1980-talet 4,14,15, har beläggning fluorescensmärkta extracellulära proteiner på täckglas för efterföljande mikroskopisk analys fram som den primära tekniken för att utvärdera invadopodia funktion inom ett brett spektrum av celltyper. Den föreskrivna protokollet visar den grundläggande metoden som används för framställning av gelatinbelagda täckglas som bildar ett skikt kollagen mindre än 2 pm tjockt lämplig för detektering av extracellulär matris nedbrytning av celler i de flesta konventionella lysrör och konfokalt mikroskop 11,16-18, liknande vad som tidigare beskrivits 19-21. Dessa egenskaper möjliggör en snabb produktion av belagda täckglas som kan detektera den initiala igångsättningen av matrisnedbrytning. Känsligheten ges genom the resulterande tunna gelatin matris på de underliggande hårda sannolika glasytan hjälpmedel för att främja invadopodia bildning som ett svar på den höga inneboende styvheten hos den totala matrisen miljön 22. Men dessa matriser inte väl lämpade för analys av invadopodia förlängning eller ytterligare morfologisk utvärdering som har uppnåtts med hjälp tjockare (30-100 nm) gelatinskikten med liknande metodik, belagda transwells eller elektronmikroskopi 20,23,24.
Vi har funnit att pre-konjugerad kommersiellt Oregon Grön 488 gelatin möjliggör snabb experimentell uppsättning upp och konsekventa, reproducerbara resultat. Emellertid förblir alkalisk borat konjugering av fluoresceinisotiocyanat (FITC) till omärkt gelatin en populär och billig metod för framställning av fluorescerande gelatin konjugat 20. Fibronektin används också som ett alternativ matrisprotein för märkning och täckglas beläggning 4,9, och i vissa fall ivestigators har använt märkt fibronektin skiktas på omärkta gelatinbelagda täckglas för att skapa tätare matriser 11,25. Andra matriser kan användas, beroende på detaljerna i celltypen. Förutom färgämnen i den gröna 488 nm spektrum, har ett brett spektrum av fluoroforer också använts med manuella kopplingsmetoder för att generera täckglas med olika fluorescens spektra, inklusive rodamin 21,26, Alexa Fluor 350 24, 546 21, 568 5,11 , 594 27 och 647 5 färgämnen. Sådana konjugat är lätt att anpassa för användning i föreskriven protokollet, vilket ger flexibilitet för att använda specifika ECM-protein-dye kombinationer lämpliga för de flesta någon avbildning filter set.
De tekniker som beskrivs häri ger de nödvändiga detaljerade steg för att utnyttja ImageJ att kvantifiera gelatin matrisnedbrytning kopplade till enskilda celler i en heterogen population eller till hela cellgrupper som publiceras föregåendeiously 6,28. Proprietär programvara har också framgångsrikt använts för samma ändamål 5,25. I detta protokoll är området matrisnedbrytning normaliserad till antingen den totala ytan av cellerna eller det totala antalet celler (kärnor) i fältet. Generellt kommer båda alternativen för normalisering ger samma resultat (ELW, data ej visade). Men, om det finns olika cellinjer med olika storlek celler jämförs eller om den experimentella behandlingen gör att cellerna ändra storlek, kan det vara mer korrekt att normalisera till cellantalet. Å andra sidan, många cancercellinjer har en hög andel av multi-kärnförsedda celler, i vilket fall den totala cellytan kan vara en mer korrekt parameter för normalisering. Dessutom, om endast en del av en cell fångas i en bild (figur 6), kan det vara bättre att normalisera till cell område snarare än underskatta nedbrytning potentialen för en individuell cell. Det är viktigt att optimera bildanalys till bäst passaregenskaper och nyanserna i den specifika experimentuppställning.
För bestämning cellantal i en fullsatt område, räknar kärnor är ofta den metod som föredras. ImageJ har en plugin kärna disk för automatisk räkning. Ett alternativ i detta verktyg är vattendelaren filtret. Detta filter hjälper separat kärnor som vidrör genom segregerande dem i enskilda objekt (Figur 5H, vit pil). Dock kan detta filter inte kan separat kärnor som överlappar i stor utsträckning (figur 5H, röd pil). Dessutom, om en kärna har en oregelbunden form och stora variationer i intensitet, kan filtret separera en enda kärna i flera objekt (Figur 5H, gul pil). Därför är det viktigt att prova olika tröskling och utjämning metoder i denna plugin för att fastställa de bästa parametrarna för analys. Om den automatiska räkningen inte ger korrekta siffror, det cellräknare plugin kan faci litate manuell räkning av celler eller kärnor.
I fall använder övergående transfektion, kommer bilderna innehåller ofta en blandning av celler som uttrycker eller inte uttrycker ett protein av intresse (Figur 6). I detta scenario är det inte alltid uppenbart vilka celler var ansvarig för att skapa områden med matrisnedbrytning. Detta är speciellt sant om cellerna migrerar över gelatinet. För att vara konsekvent i analysen, är det viktigt att bara mäta förstörda områden direkt nedanför varje cell. Genom tröskling att välja de mörka områdena i matrisen och använda aktin att generera cell konturerna kommer endast de skadade områdena under cellerna kvantifieras. Detta förfarande utesluter förstörda områden utanför cellgränserna från analys (Figur 6F, pil). Analysen kan kräva optimering för att välja en tidpunkt som ger tillräckligt med tid för nedbrytning innan cellerna har haft en chans att flytta.
"> Många metoder har utvecklats för att kvantifiera invadopodia bildning och funktion. Förutom matrisnedbrytning, andra frekvent rapporterade parametrar innefatta bestämning av antalet invadopodia per cell, den procentuella andelen celler som uppvisar invadopodia inom en given population, och antalet" omogna "eller" pre "icke-nedbrytande invadopodia jämfört med" mogna "invadopodia förmåga att bryta ned ECM 11,13,25,26. Metoden (er) i valet för invadopodia utvärdering beroende på inneboende egenskaper hos varje celltyp. Till exempel räkna antalet invadopodia per cell eller bestämma andelen celler som innehåller invadopodia är en enkel metod som fungerar bra om de analyserade cellerna innehåller några framstående invadopodia, men blir svårare i celler som har dussintals invadopodia eller där invadopodia kan vara liten och svåra att upptäcka. Med nedbrytningen analysen gör det möjligt att beräkna den procentuella för-invadopodia vs.. mogen invadopodia i enskilda celler eller i en population genom att jämföra det totala antalet celler med invadopodia den procentsats som är förnedrande matris. Om det finns en diskrepans där färre celler förnedrande matris jämfört med celler som uppvisar invadopodia, kan det tyda på att dessa celler bildar före invadopodia som var oförmögna att matrisnedbrytning när cellerna fixerades.Oavsett vilken metod skall väljas för analys, är det viktigt att kvantifiera de önskade invadopodia egenskaper så objektivt som möjligt. Vid insamling bilder på mikroskopet, välj fält genom att titta på celler (aktin), snarare än den fluorescerande matrisen, för att undvika en snedvridning av företrädesvis välja områden med höga halter av nedbrytning. Flera bilder bör förvärvas för att säkerställa en rättvis representation av cellpopulationen. Bilder bör förvärvas vid en lämplig förstoring. Enhetliga populationer av celler, lägre förstoring kananvändas för att samla fler celler så länge som områdena nedbrytning kan fortfarande lösas. Högre förstoring bilder är att föredra för att mäta arealer enskilda celler och att lösa individuella invadopodia. När områden håller kvantifieras, tröskling bilder baserade på intensiteten är mer objektiv än att manuellt välja det område av matrisen för att mäta. I samtliga fall bör ett tillräckligt antal celler från flera oberoende experiment analyseras för att ge statistiskt meningsfulla, reproducerbara resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av kapitalförsäkringar medel från West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Vi tackar Susette Mueller (Georgetown University) och Laura Kelley för tidig rådgivning och hjälp. Användningen av West Virginia University Mikroskopi Imaging Facility (stöds av Mary Babb Randolph Cancer Center och NIH bidrag P20 RR16440, P30 RR032138 och P30 GM103488) tas tacksamt erkänt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
