Summary
Biz invadopodia aracılı matriks yıkımı görselleştirmek için floresan jelatin kaplı mikroskop lamelleri üretmek için prototip yöntem açıklanmaktadır. Mevcut yazılımını kullanarak hesaplama teknikleri karışık bir popülasyon içindeki ve bütün mikroskobik alanı kapsayan çok hücreli grupları için tek hücreler ile matris proteolizin sonuç seviyeleri ölçülmesi için sunulmuştur.
Abstract
Lokal doku içine hücresel istila gelişimi homeostazında ve önemli bir işlemdir. Malregulated işgali ve ardından hücre hareketi iltihabı, kalp-damar hastalıkları ve tümör hücrelerinin metastaz 1 de dahil olmak üzere birden fazla patolojik süreçler, özelliğidir. Epitelyal veya endotelyal bazal membranda ekstrasellüler matriks (ECM) bileşenlerinin Focalized proteolitik yıkımı hücresel invazyonu başlatmada kritik bir adımdır. Tümör hücreleri, in vitro analizi kapsamlı ECM yıkımı invadopodia 2,3 adlandırılan ventral aktin zengin membran çıkıntılı yapılar tarafından gerçekleştirilir olduğunu belirlemiştir. Onlar matriks metalloproteinazlar (MMP) ve eylem yoluyla ECM arıza orta ECM, yakın apozisyon yılında Invadopodia formu. Invadopodia oluşturmak için tümör hücrelerinin yeteneği doğrudan yerel stroma ve ilişkili vasküler bileşenleri 3 içine işgal yeteneği ile ilişkilidir.
_content "cam lameller üzerine kaplanmış boya etiketli matriks proteinleri kullanarak floresan mikroskobu ile hücrelerin invadopodia aracılı ECM yıkımı> Görselleştirme matrisi proteoliz ve hücresel invaziv potansiyeli 4,5 derecesini değerlendirmek için en yaygın yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Burada tarif piyasada bulunan Oregon Yeşil-488 jelatin eşlenik kullanan floresan-etiketli cam lamelleri oluşturmak için standart yöntem bir versiyonu. Bu yöntem kolaylıkla hızla kaplı lamelleri çok sayıda üretmek için ölçeklendirilir. Biz sık sık karşılaşılan yaygın mikroskobik eserlerin bazılarını göstermek Bu işlem sırasında ve bunların nasıl önlenebilir. Nihayet, biz tek tek hücreler tarafından ve tüm hücresel popülasyonlar aracılığıyla etiketli jelatin matriks yıkımı miktarının izin hazır bilgisayar yazılımı kullanılarak standardize yöntemleri açıklanmaktadır. açıklanan prosedürleri doğru ve tekrarlanabilir izleme olanağı sağlar invadopodiaaktivite ve ayrıca modüle protein ekspresyonu veya tek ve çok hücreli ayarları ekstrasellüler matriks yıkımı anti-invaziv bileşiklerin test etkinliğini değerlendirmek için bir platform olarak hizmet verebilir.Protocol
1. Oregon Yeşil Üretimi 488-jelatin Kaplı lameller
- 1.25 g, jelatin ve 50 ml'lik bir nihai hacim PBS içinde 1.25 g sükroz eklenmesi ile etiketlenmemiş bir% 5 (a / a) stok jelatin / sakaroz çözeltisi hazırlayın. 37 ° C ile stok solüsyonu jelatin sıcak ve tamamen kullanılmadan önce eritilir sağlar. 4 ° C'de depolayın nihai karışım
- Bir 24 çukurlu plastik doku kültürü plakasının her bir oyuğuna ayrı bir lamel yerleştirilmesi ile 13 mm arasında 1. cam lameller temizleyin. Her oyuğa% 20 nitrik asit 500 ul ilave edin ve 30 dakika süreyle inkübe edilir. Nitrik asit solüsyonu aspire ve deiyonize su ile lamelleri üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 20 dakika için her bir kuyucuğa 50 ug / ml poli-L-lisin (% 0.1 'lik stok çözeltiden hazırlanmış ve deiyonize su içinde seyreltilmiş), 500 ul lamelleri ile kaplayın. Çözüm aspire ve PBS ile üç kez yıkayın. Poly-L-lisin kaplama üstteki la bile kaplama ve yapıştırma kolaylaştırırjelatin Beled.
- Her kuyucuğa% 0,5 glutaraldehit 500 ul (kullanımdan önce taze yapılmış) ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde 24 kuyucuğu kuluçkaya yatmaktadır. Aspire ve soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Jelatin kaplama öncesi PBS tüm izlerini kaldırmak için emin olun. Jelatin eklenir kadar tüm yıkama boyunca buz üzerinde tabak tutun.
- Sulandırın 37 ° C'ye gelen başına üreticinin protokolü ve ısınmak ve etiketsiz% 5 jelatin / sakaroz çözeltisini (1.1) olarak jelatin Oregon Yeşil 488-konjuge Etiketsiz jelatin / sakaroz sekiz bölümden (;% 5 jelatin karışımı 4 ml içine Oregon Yeşil 488 jelatin 500 ul yani) içine bir parçası Oregon Yeşil 488 jelatin seyreltin. Manuel yayılımları (Şekil 3B 'de gösterildiği gibi olan düz olmayan lamel kaplama neden olabilir) olmadan kat lamel için yeterli jelatin kullanarak her bir lamel üzerine seyreltilmiş 488-jelatin karışımı (37 ° C'de tutulan) bir Pipet 100 ul,. Bu 37 seyreltilmiş 488-jelatin karışımı tutmak önemlidir °; Erken katılaşma önlemek için kaplama işlemi sırasında C. Bu adımı itibaren lamelleri potansiyel photobleaching önlemek için mümkün olduğu kadar karanlıkta muhafaza edilmelidir. Farklı floroforlar konjuge Diğer ECM proteinleri Oregon Yeşil 488 jelatin (Tartışma bakın) ikame edilebilir.
- Tüm lamelleri tek bir levha ile kaplı sonra, bir açıyla 24 plaka tutun ve vakum aspirasyon ile her kuyudan aşırı jelatin kaldırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta kaplı lamelleri inkübe edin.
- Lamelleri PBS ile üç kez yıkanır, daha sonra kalıntı glutaraldehid azaltmak ve inaktive etmek için oda sıcaklığında 15 dakika için taze 5 mg / ml sodyum borohidrid (NaBH4) 500 ul ilave edin. Sodyum borohidrid efervesan olan ve küçük kabarcıklar her bir lamel üzerine ve etrafına belirgin olacaktır.
- Her kuyunun dışında etrafında hızlı bir süpürme hareketi ile vakum aspirasyon ile NaBH4 çözüm Kaldır. NaBH4 tedavi sırasında doku kültürü plaka alt koparılmış oldu herhangi bir kayan lamelleri almaya dikkat edin. Üst şamandıra Müstakil lamelleri hafifçe de altına geri itilmiş olabilir, ancak bakım protein kaplama zarar vermemek için alınmalıdır. PBS ile üç kez her oyuğa yıkanır ve daha sonra da oda sıcaklığında 30 dakika için% 70 etanol içinde lamelleri inkübe edilir.
- Steril tekniği kullanarak, bir tip IIA / B hücre kültürü laminer akış kaputu lamel içeren plakalar aktarmak ve steril PBS ile lamelleri üç kez yıkayın. Bu noktada lamelleri en azından iki ay için 4 ışıktan korunmuş PBS ° C de muhafaza edilebilir.
- Steril bir iğne ve forseps kullanılarak dikkatli kaldırılması suretiyle, yeni bir 24 gözlü plaka boş bir kuyucuğa bozulması deneyleri için kullanılmak üzere lamelleri aktarın. Tam medya tahlil ediliyor belirli bir hücre tipi için uygun olan 1-24 saat boyunca lamelleri dengelemek. Bakım olmamasına dikkat edilmelidirlamel invert veya (Şekil 3B bakın) jelatin kaplama kazıyın.
2. Assay ECM Yaşlanmasına Oregon Green Kaplama ve Hücre İşleme 488-jelatin Kaplı lameller
- 24 gözlü plakanın her içinde bir lamel üzerine tohum 3-5x10 4 hücreler.
- Özellikle hücre hattı / ilgi türü için invadopodia bozulması aktivitesi için gerekli optimum kere belirlemek için bir süre ders çalışma yürütün. Çoğu invaziv hücreler bu aralıkta değişkenlik gösterebilir ve ampirik olarak tespit edilmelidir rağmen bozulması için 4-24 saat arasında bir zaman, belirgin hale gelmesi gerekir. Invadopodia etkinlik senkronize etmek için, hücrelerin istenen bir süre için MMP inhibitörleri (ör., GM, 6001) ile muamele edilir, daha sonra (örneğin, 6 ya bakınız) invadopodia aktivitesi devam edebilmesi için önleyici yıkayın.
- Lamelleri üç kere PBS ile durulayın, sonra,% 10, 500 ul hücre düzeltmek fosfataz tamponlu formalin15 dakika için te. PBS ile üç kez yıkayın ve% 0.4 Triton ile 4 dakika PBS içerisinde X-100 için geçirgen. Triton X-100 uzaklaştırmak için PBS ile üç kez yıkayın.
- Cortactin 5, TKS5; aktin filamentleri (F-aktin) görselleştirmek ve invadopodia lokalize bilinen bir işaretleyici protein (örneğin floresan konjuge phalloidin ile birlikte etiketleme hücreleri tarafından immünfloresan boyama için herhangi bir standart protokol (örneğin 7) kullanarak Etiket hücreleri 8, ya da N-yaban arısı 9). Oregon Green 488 ya da parazit sinyali engellemek için jelatin FITC-etiketli kullanıldığında, 488-etiketlenmiş sekonder antikor ya da GFP-etiketli proteinleri kullanarak kaçının.
- Dikkatlice ters lamel tarafından cam mikroskop Slaytlarınıza lekeli lamelleri Dağı ve Altın antifade veya benzeri reaktif uzatan bir damla üzerine yerleştirerek.
- Geleneksel floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak uygun kanallar matriks yıkımı, görüntü hücreleri değerlendirmek. Jelatin bozulmasıfloresan jelatin proteolitik çıkarılması (Şekil 4A) nedeniyle lamel üzerinde koyu alanlar olarak görüntülenmiştir. Aktin ve bir invadopodia işaretleyici protein için hücrelerin etiketlenmesi birleştirilmiş görüntü içinde matris bozulmasının sitesi (Şekil 4A) de invadopodia doğrulanması için olanak sağlar.
- Parçalanma aktivitesi invadopodia oluşumu ve matriks yıkımı 5,10,11 izlemek için floresan etiketli rekombinant proteinler ile canlı hücre görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak izlenebilir.
3. Normalize Matrix Degradasyon Ölçüm tarafından Floresan Jelatin Parçalanabilirliklerinin Niceleme
Bu analiz, hücre alan veya hücre sayısına oranla matris bozulması normalleştirilmiş bir alan sağlar. Birden fazla hücre topluca siRNA, büyüme faktörleri ve tedavi ajanları ile tedavi edildiğini mevcut görünümünün tüm mikroskopik alanlar analiz için yararlıdır. Bu analysi içinler, düşük büyütmede toplanan görüntülerin etkin hücre popülasyonları hakkında bilgi toplamak için yeterlidir.
- ImageJ 12 görüntüleri açın. Mikroskopi için ImageJ indirebilirsiniz http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- "Ölçek Seti / Analyze." Bu bilgiler birçok dosya formatını otomatik olarak içe olacak menü komutunu seçerek ölçek bilgilerini kontrol edin, ancak gerekirse elle girilebilir. Uygun ölçekleme yerine piksel mikrondan ölçümler rapor etmek gereklidir.
- Seçerek izlemek için uygun ölçümleri seçin "Set / Analiz Ölçümleri." Alan kontrol edin ve Eşik sınırlandırın.
- Floresan jelatin görüntü (Şekil 5A) kullanarak bozulma alanı hesaplayın.
- Eşik görüntü ("Resim / Eşik / Adjust") üst ve alt pi ayarlamak içinxel yoğunluk değerlerinin bozulması alanlarında (; Şekil 5B kırmızı olarak vurgulanan) seçmek için. Sonraki görüntülerde objektif bir bozulma alanı seçmek için araç olarak tüm görüntüler için aynı eşik ayarlamak için Eşik penceresinde Ayarla düğmesini kullanın.
- Görüntüleri elde edildiğinde, bazı durumlarda, lamel tamamen düz olmayabilir. Bu görüntü boyunca değiştirmek için jelatin yoğunluk neden olur. Plan çıkarılarak jelatin çapında düzensiz aydınlatma için doğru görüntü, ("Süreç / Arkaplan Çıkarma") veya bir bant geçiren filtre ile filtre ederek ("Süreç / FFT / Bant Filtre") ya da bir sözde flatfield eşikleme zaman bu değişiklikleri sorunlarını oluşturursa filtre ("İşlem / Filtreler / Sözde Flatfield") plan yoğunluğu üniforma kadar.
- Matriks bozulması ("Partikülleri Analiz / Analyze") alanında ölçün. Çözümle Parçacıklar penceresinde, t gürültü kaldırmak için bir partikül boyutu> 0 seçinO seçimi. Göster ilgi alanları (ROI) belirlemek için Outlines. Ekran Sonuçlar kontrol ve ölçümleri göstermek için özetleyin. Çizim özellikle bozulması alanlarında (Şekil 5C) tüm hatlarıyla varsa, bir elektronik tabloya Toplam Alan ölçümü kopyalayın. Diğer nesnelerin (örneğin enkaz gibi) seçilmişse, ilgili ROI'leri sadece alanlar kaydedin.
- Phalloidin lekeli (F-aktin) görüntü (Şekil 5D) kullanılarak hücre alanı hesaplayın.
- Eşik hücrelerin kenarları (kırmızı renkte vurgulanır; Şekil 5E) seçilir, böylece üst ve alt piksel yoğunluğu değerleri ayarlamak için görüntü ("Görüntü ayarla / / Eşik"). Sonraki görüntülerde objektif bir hücre alanını seçmek için bir araç olarak tüm görüntüler için aynı eşik ayarlamak için Eşik penceresinde Ayarla düğmesini kullanın.
- 10. Ölçüm hücre alanı ("Parçacık Analiz / Analiz"). Analiz Parti olarakCLES penceresinde, seçimi gürültü kaldırmak için bir partikül boyutu> 0 seçin. Göster analizi (Şekil 5F) için bölgeleri tanımlamak için Outlines. Ekran Sonuçlar kontrol ve alan ölçümleri göstermek için özetleyin. Küme içinde seçili olmayan pikseller hücre alanı hesaplamasına dahil olmayacak şekilde bir küme hücreleri arasındaki boşluklar varsa delikler dahil kontrol etmeyin. Tamam'ı seçin.
- Bir elektronik tabloya alakalı ROI'ler için Alan sonuçlar kopyalayın.
- Hücreler 13 toplam alanı başına jelatin bozulma alanı hesaplayın.
- Alternatif bir yaklaşım, çekirdeğin (Şekil 5G) sayma bir hücre sayısı, her bir bozulma alan rapor olacaktır. Manipülasyonlar farklı karşılaştırıldığında tedavi grupları arasında hücre alanı değiştirirsek bu gereklidir. Çekirdekler iyi yoğunluğu ve yuvarlak, düzgün ayrılmış eğer Otomatik sayma iyi çalışır. Otomatik Nükleofilik saymaki ("Eklentiler / Parçacık Analiz / Nucleus Sayaç"). En küçük ve En Büyük Tane Büyüklüğü, bir Eşik Yöntem ve Düzeltici Yöntem seçin. YG Müdürü ve göster Özeti (Şekil 5H) için partiküller ekle, Arkaplan, Havza Filtre çıkarma edin.
- Çekirdekleri yoğun örtüştüğü veya düzensiz bir şekil veya doku varsa, otomatik sayma doğru bir sayıya (Şekil 5H, sağ oklar) üretmek olmayabilir. Bu durumda, manuel sayma ("Eklentiler / Parçacık Analiz / Hücre Sayacı") hücre sayacı aracı kullanılarak kolaylaştırılabilir. Hücreler bir manuel sayım (Şekil 5I) sırasında işaretlenir gibi bu sayımı devam edecektir.
- Bir elektronik tabloya hücre sayısı (çekirdekleri) kopyalayın. Hücrelerinin toplam sayısı başına jelatin bozulma alanı hesaplayın.
4. Karma Hücresel Nüfus Bireysel Hücreler tarafından Floresan Jelatin Parçalanabilirliklerinin Niceleme Ayrı alan içinde diğer hücreler (örnek olarak, transfekte edilmiş hücreler karşı transfekte edilmiş) bir nüfus içinde belirli hücrelerde ortaya çıkan matris bozulması değerlendirmek için, Bölüm 3, işlem tek tek hücrelerin altında bozulma alanı ölçmek için modifiye edilebilir. Ek bir floresan kanal transfekte edilmiş hücreleri işaretlemek için gereklidir. Bu durumda, daha yüksek büyütme görüntüleri ve iyi ayrılmış hücreleri ölçmek için kolaydır.
- "Ölçek Seti / Analyze." Seçerek izlemek için uygun ölçümleri seçin menü komutunu seçerek ölçek bilgileri denetleyin "Set / Analiz Ölçümleri." Alan kontrol edin ve Eşik sınırlandırın.
- Değmiyor bireysel hücrelerin için, F-aktin görüntü (Şekil 6A) kullanarak her hücre tanımlamak. Eşik görüntü (3.9) (Şekil 6B). Bu, hücrelerin kenarları elde etmek için önemlidir, fakat delik olabiliriçinde s eşik dahil değildir. Hücre sınırları seçmek için görüntüleri karşısında aynı yoğunluk değerlerini kullanın.
- Hücrelerin alanı ölçmek için, "parçacıklar Çözümle / Analyze" kullanın. Çözümle Parçacıklar penceresinde, bir büyüklüğü> 0 (gürültü ortadan kaldırmak için), Show Anahatlar seçin ve Ekran Sonuçlar kontrol Yöneticisi ekle ve (kaydetmek için delikler dahil çerçeveyle tüm alanı). Tamam seçin ve Sonuçları penceresinden her hücre için Alan kaydedin.
- Hangi hücrelerin (Şekil 6C) transfekte edilir belirleyin.
- Floresan jelatin görüntü (Şekil 6D) kullanarak bozulma alanlarını tanımlayın. Gerekirse, (3.6) arka plan yoğunluğu bile jelatin görüntü filtre. Eşik bozulma alanları seçmek için, eşik ayarlarını (Şekil 6E) not verme. Sonraki görüntülerde, bu aynı üst ve alt yoğunluk değerleri (Set kullanarak kullanabilirsinizbozulması alanlarında objektif seçimi için Eşik penceresinde düğme).
- Hücrelerin altında bozulma alanları ölçülür. Eşiklenir floresan jelatin resim üzerinde ROI Manager penceresinde ROI'ler seçerek ve Ölçü (Şekil 6F) seçerek hücre anahat gösterir. Sonuçları kaydedin ve bozunma / hücre veya hücre alanının normalleştirilmiş alanı hesaplamak.
5. Temsilcisi Sonuçlar
İşlem için genel olarak Şekil 1'de şematik olarak gösterilmektedir. Bu prosedür, hücreler jelatin düşmesine izin vermek için kaplanmış lamelleri üzerine hücre kaplama tespit ve görüntüleme matris bütünlüğü değerlendirmek için, floresan mikroskobik analiz için hücre floresan matris etiketleme, floresan-konjuge jelatin ile cam lameller ve kaplamanın hazırlanması gerektirir ve nesnel bilgisayar softwar kullanarak jelatin matriks yıkımı derecesini ölçene.
Şekil 1. Sabitleme ve immün ve matriks proteoliz değerlendirerek, floresan jelatin kaplama, hücre kaplama dahil kilit adımları vurgulayarak Genel şematik.
Hazırlanması ve kaplama cam lameller yer alan anahtar prosedür adımları Şekil 2 de özetlenmiştir.
Şekil 2. Jelatin matris kaplama cam lameller hazırlanmasında yer alan bireysel adımları gösteren şematik. Buz (küp) üzerinde ışık (LED ampul), ve karanlık (ışıksız ampul) gerçekleştirilen Adımlar karikatür gösterilir vardır. Karanlık yardım yapılan Adımlar floresan matrislerin photobleaching engeller.
Uygun şekilde yapıldığında, lamelleri eşit olarak Oregon Green 488-konjuge g ile kaplanırelatin, homojen floresans gösterirken mikroskobu ile görüntülenmiştir (Şekil 3A). Yanlış kaplama nedeniyle çıkan tipik eserler, taşıma, depolama ve kaplamalı lamelleri kullanımı Şekil 3B gösterilmiştir.
Eserler Şekil 3. Örnekler jelatin kaplı lamel hazırlama ve işleme sırasında karşılaştı. Konfokal z-yığını A. Ortogonal görünümü 488-konjuge jelatin kaplı lamel öngörülen protokolü kullanılarak üretilen bir Oregon Green tipik renk ve tutarlılık gösteren. XZ (alt) ve YZ (sağda) konfokal uçaklar gösterildiği gibi lameller ~ 1-2 mikron kalınlığında homojen bir kaplama olmalıdır jelatin kaplı lamelleri arasında kaplama ve işleme sırasında oluşabilir B. Eserleri şunlardır:. Yanlış kaplama bağlı olarak kaplama işlemi sırasında lamelBir "Arnavut kaldırımı yol jelatin karışımı (düzensiz kaplama), uzun süreli depolama dönemlerinde lamel yüzey kurutma, işleme (kazıma) sırasında iğne veya forseps ile puanlama kaplamalı matrisinin çıkarılması, kötü karıştırma, yayılma kılavuzu veya kısmi katılaşma "görünümü (susuz) ve uzun süreli veya yüksek yoğunlukta ışık pozlama (bleaching) nedeniyle görüntüleme sırasında floresan jelatin yüzey photobleaching. Beyaz ok kaplama OSC19 baş ve boyun skuamöz karsinom hücre kapsayan ağartılmış bölgeyi gösterir. Oregon Yeşil 488-konjuge jelatin görüntü kontrastı artırmak için beyaz yalancı edilir. Bar, 10 mikron.
Bu işlem sırasında üretilen sonucu ince matrisler ECM düşmeye hücrelerinin yeteneğini değerlendirmek için hassas bir araç sağlar. Şekil 4 Oregon Yeşil-488 konjuge jelatin lamel kaplama bir OSC19 hücreden invadopodia etkinliklere bir örnek gösterirve konvansiyonel konfokal mikroskopi ile yanı sıra üç boyutlu ters evrişim sonrasında hacim-dolgu görüntü işleme ile görüntülenmiştir.
Şekil 4,. Invadopodia matris bozulması etkinlik için temsili örnekler. Bir. Invadopodia ve ilgili jelatin matriks proteolizin Görselleştirme. Kaplamalı Oregon Yeşil 10 488-konjuge jelatin lamelleri üzerine OSC19 hücreleri saat sabit ve rodamin-konjuge phalloidin (F-aktin) ve anti-cortactin antikorlar (Alexa Fluor 647 sekonder antikor ve yalancı yeşil ile görüntülendi) ile işaretlendi. Invadopodia Birleştirilen görüntünün içinde jelatin temizleme (matriks karanlık delikler) alanları ile örtüşen F-aktin ve cortactin fokal sitoplazmik konsantrasyonu olarak belirgindir. Genişlemiş yeniden gösterildiği gibi ok başları içeren Kutulu bölgelerde fokal matriks proteoliz bireysel invadopodia ve alanları gösterirAşağıda gions. Bar, 10 mikron. B. Cilt ECM içine invadopodia penetrasyon görselleştirme doldurun. Kaplama ve lekeli (A) gibi OSC19 hücreler görsel rodamin-konjuge phalloidin ve Oregon Yeşil 488-konjuge jelatin için 7.04 mikron toplam z dilimleri optik 23 ardışık 0.32 mikron alarak hale getirildi. Her kanal için belirlenen yerli EKK dosyası AutoQUANT x2.2 yazılımı açıldı ve her bir görüntü yığını bir 3D kör Dekonvolüsyonun önerilen ayarlar (10 iterasyon, orta gürültü) kullanılarak yapıldı. Işlenmiş görüntüler daha sonra NIS Elemanları açıldı ve alfa harmanlama ile bir birim görünümü olarak konmuştur TIFF yığınlar olarak kaydedilmiştir. LUT ayarlandı ve subvolume invadopodia mevcut hücre içinde bir kenar göstermek için oluşturuldu. Dorsal kenar görünümü temel jelatin (yeşil) takılı invadopodia (kırmızı oklar) göstermektedir. Ventral kenar görünümü lamel altında jelatin bozulması çıkıntılı invadopodia ve alanları gösteriryeşil matris (ok başları) kırmızı mevcut bölgeleri gibi. Sunulan toplam resim alanı 77 x 65 mikron şekilde kırpılır; hücre ~ 60 x 40 mikron.
Şekil 5 protokolünün 3. adımda açıklandığı gibi normalleştirilmiş jelatin matriks yıkımı ölçümü için önemli bazı adımları gösterir. Bu yordam görünümü bütün bir alanında jelatin bozulması tarafsız ölçümü için izin vermek için tasarlanmıştır, ve alanında birçok hücre atfedilen matriks bozulması için uygundur.
Protokolü, 3. adımda açıklandığı gibi tüm bir mikroskobik görüntü içinde hücreleri için normalize jelatin bozulması hesaplama destekli nicelleştirmesinde önemli adımları gösteren Şekil 5. Ekran yakalama görüntüleri. Tüm floresan görüntüler iyi kırmızı eşikleme ve ROI işaretlerini görüntülemek için gri tonlamaya dönüştürülür edilmiştir. A. ImOregon Yeşil bozulması meydana gelmiştir karanlık alanları gösteren 488-konjuge jelatin, ("delik"), yaş (adım 3.4). B. kırmızı (adım 3.5) bozulması alanları vurgulayarak jelatin görüntü eşiklenir. C. Çizim alanı için ölçülen ROI'ler gösteren bozulması (adım 3.7). F-aktin (adım 3.8) D. Rodamin phalloidin boyama. E. kırmızı (adım 3.9) total hücre alanı vurgulayarak aktin görüntü eşiklenir. F. Çizim (adım 3.10) ölçülecek hücre alanlarını gösteren DAPI boyalı hücre çekirdeğinin. G. Görüntü (adım 3.13). H. Kırmızı otomatik çekirdeklerin sayma (adım 3.13) adlı gösterisi sonuçları özetlemektedir. Havza filtresi dokunmadan ayrı çekirdeklerin (beyaz ok) potansiyeline sahiptir. Çekirdekleri yoğun çakışırsa, onlar tek nesneleri (kırmızı ok) ayrılmıştır olabilir. Bir çekirdeğin düzensiz bir şekil varsa, birden çok nesne (sarı ok) ayrılabilir. I. </ Hücre sayacı aracını (adım 3.14) kullanarak manuel sayım sırasında çekirdeklerin lekelenmesini strong> Sonuçları.
Şekil 6. protokol 4. adımda açıklandığı gibi karışık bir hücresel nüfus içindeki bireysel hücrelerin floresan jelatin bozulması niceleme yer seçme adımları gösterir. Burada transfekte edilmiş hücreler tarafından matris bozulması transfekte edilmiş ve non-transfekte edilmiş hücreler oluşan karışık bir popülasyon içindeki analiz edilebilir.
Şekil 6. Ekranı bir hücre popülasyonu içindeki bireysel transfekte hücrelerden jelatin bozulması niceleme katılan adımlar görüntüleri yakalayabilir. BAYRAK epitop etiketi kaynaşmış tek bir transfekte OSC19 hücresi eksprese rekombinant cortactin Kantitasyonu bir örnek olarak gösterilmiştir. Tüm floresan görüntüler iyi kırmızı eşikleme ve sarı YG işaretlerini görüntülemek için gri tonlamaya dönüştürülür edilmiştir. A. B. Çizim Eşik uygulama takip ve Parçacıklar fonksiyonları (adım 4,2-3) Çözümle. C. Konfokal görüntü bozulması var koyu alanlar ("delik") gösteren, Oregon Yeşil 488-konjuge jelatin BAYRAK-etiketli cortactin (* ile işaretli) (adım 4.4). D. Görüntü ifade tek bir hücrenin gösteren hücre popülasyonunun anti-BAYRAK immün arasında oluştu (adım 4.5) E. kırmızı bozulmanın karanlık alanları (adım 4.5) vurgulayarak jelatin görüntü eşiklenir. F. panel B (adım 4.6) elde edilen hücre hatları ile jelatin görüntü overlaid eşiklenir. Hücre hatları içinde sadece eşiklendi piksel analiz sayılan dikkat edin. Geçerli hücre konumu (beyaz ok) zamanla jelatin genelinde hücre göçü sonucu dışında bozulması Alanları ve inclu değildiranalizinde ded.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekstrasellüler matriks degrade hücreleri görselleştirmek için yeteneği hücre invazyonu erken adımları istihdam moleküler mekanizmaları keşfetmek yardımcı olmuştur. 1980 başlarında 4,14,15 Wen-Tien Chen öncülüg sonraki mikroskopik analiz için cam lameller üzerine kaplama floresan etiketli dışı proteinler hücre türleri geniş bir yelpazesinde invadopodia fonksiyonu değerlendirmede birincil tekniği olarak ortaya çıkmıştır. Öngörülen protokolü var ne benzer birçok geleneksel floresan ve konfokal mikroskoplar 11,16-18 hücreler tarafından ekstrasellüler matriks yıkımı tespiti için uygun en az 2 mikron kalınlığında bir kollajenöz tabaka oluşturur jelatin kaplı lamelleri, hazırlamak için kullanılan temel yöntem gösterilmektedir Önceden 19-21 tarif edilmiştir. Bu özellikler, matris bozulması ilk başlangıç saptamaya muktedir kaplanmış lamelleri hızlı bir üretimini mümkün kılar. Inci sağladığı hassasiyete genel matriks ortamında 22 yüksek doğasında sertlik bir tepki olarak invadopodia oluşumunu teşvik yatan sert cam yüzeyinde muhtemel yardımları üzerinde ince jelatin matriks sonuçlanır. Bununla birlikte, bu matrisler invadopodia iyi uzama ya da benzer bir metodoloji, kaplanmış transwells veya elektron mikroskobu ile 20,23,24 (30-100 um) jelatin daha kalın tabakalar kullanılarak elde edilmiştir ilave morfometrik analizi için uygun değildir.
Biz önceden konjuge ticari olarak üretilen Oregon Yeşil 488 jelatin hızlı deneysel kurulum ve tutarlı, tekrarlanabilir sonuçlar sağlar bulduk. Bununla birlikte, etiketlenmemiş jelatin ile fluorescein isothiocyanate (FITC) borat alkali fluoresan konjugasyonunu jelatin konjugatlarının 20 üretmek için bir popüler ve pahalı olmayan bir yöntem kalır. Fibronektin da etiketleme ve kapak kaplama 4,9, alternatif bir matriks proteini olarak ve bazı durumlarda kullanılırvestigators yoğun matrisler 11,25 oluşturmak etiketsiz jelatin kaplı lamelleri üzerine katmanlı etiketli fibronektin kullandık. Diğer matrisler hücre tipi özelliklerine bağlı olarak kullanılabilir. Yeşil 488 nm spektrum içinde boyalar ek olarak, floroforlar geniş bir yelpazede da rodamin 21,26, Alexa Fluor 350 24, 21, 546, 568 de dahil olmak üzere 5,11 farklı spektrumlar lamelleri ile, oluşturmak için elle kavrama yöntemler ile kullanılmıştır , 594 27 ve 647 5 boyalar. Böyle konjugatları en herhangi bir görüntüleme filtresi seti için uygun özel ECM proteini-boya kombinasyonları kullanan için esneklik sağlayarak, öngörülen protokolünde kullanmak için kolayca uyarlanabilir.
Teknikleri prev yayınlanan belgede heterojen nüfus veya tüm hücre gruplarında tek tek hücrelere atfedilen jelatin matriks yıkımı ölçmek ImageJ kullanan için gerekli ayrıntılı adımlar sağlamak tarifiously 6,28. Tescilli yazılım da başarıyla aynı amaçla 5,25 için istihdam edilmiştir. Bu protokol, matris bozulması alan hücrelerin toplam alanı veya alana hücrelerinin toplam sayısı (çekirdekler) ya da normalize edilir. Genellikle, normalleşmesi için her iki seçenek (ELW, veriler gösterilmemiştir) aynı sonucu verecektir. Ancak, farklı büyüklükteki hücrelerdir sahip farklı hücre hatları karşılaştırıldığında ediliyor ya da deneysel tedavi boyutunu değiştirmek için hücreleri neden olursa, o zaman hücre sayısı normalleştirmeniz daha doğru olabilir eğer. Diğer yandan, bir çok kanser hücre hatları toplam hücre alan normalizasyonu için daha doğru bir parametre olabilir, bu durumda, çok çekirdekli hücreler yüksek bir yüzdesi vardır. Bir hücrenin yalnızca bir bölümünü bir görüntü (Şekil 6) yakalanan Ayrıca, eğer, bu hücre alanının normalleştirmek yerine tek bir hücre için bozulması potansiyelini hafife almak daha iyi olabilir. En iyisi takım elbise görüntü analiz optimize etmek önemlidirspesifik deneysel kurulum özellikleri ve nüansları.
Kalabalık bir alanda hücre sayısını belirlemek için, çekirdekler sayma sık sık tercih edilen yöntemdir. ImageJ otomatik sayma için bir çekirdek sayaç eklentisi var. Bu aracı bir seçenek Havza filtredir. Bu filtre tek tek nesneler (Şekil 5H, beyaz ok) içine ayrıştırarak dokunmadan ayrı çekirdeklerin yardımcı olacaktır. Ancak, bu filtre (Şekil 5H, kırmızı ok) yaygın örtüşmesi ayrı çekirdeklerin mümkün olmayabilir. Bir çekirdeğin düzensiz bir şekil ve yoğunluk açısından büyük farklılıklar varsa ek olarak, filtre birden çok nesne (Şekil 5H, sarı ok) tek bir çekirdek ayrışabilir. Bu nedenle, bu analiz için en iyi parametreleri belirlemek için bu eklenti farklı eşik ve yumuşatma yöntemleri denemek için önemlidir. Otomatik sayma doğru sayılar üreten değilse, hücre sayacı eklentisi li can hücre veya çekirdeklerin manuel sayım litate.
Geçici transfeksiyon kullanılarak durumlarda, resimler genellikle salgılayan hücrelerin bir karışımını içeren veya çıkar (Şekil 6) bir proteini ifade değildir. Bu senaryoda, bu hücrelerin Matriks yıkımının alanları oluşturmak için sorumlu olduğu her zaman açık değildir. Hücreleri jelatin genelinde geçiriyorsanız, bu özellikle doğrudur. Analizinde tutarlı olması için, sadece doğrudan her hücrenin altında bozulmuş alanlarda ölçmek için önemlidir. Matris içinde karanlık alanları seçmek için eşik ve hücre hatlarını oluşturmak için aktin kullanılarak, hücreler altında sadece bozulan alanların nicelendirildi edilecektir. Bu prosedür analizi hücre sınırları (Şekil 6F, ok) dışında bozulmuş alanlarda dışarıda bırakır. Tahlil hücreleri taşımak için bir şansı vardı önce bozulması için yeterli bir zaman tanır bir zaman noktasını seçmek için optimizasyon isteyebilir.
"> Çeşitli yöntemler invadopodia oluşumu ve işlevi ölçmek için geliştirilmiştir. Matris bozulması ek olarak, diğer sık rastlanan parametreler hücre başına invadopodia sayısı, verilen bir popülasyon içindeki invadopodia gösteren hücrelerin yüzdesi ve sayısı belirlenerek içerir" olgunlaşmamış "ya da" ön kırıcı ECM 11,13,25,26 yeteneğine sahip olgun "invadopodia" non-alçaltıcı invadopodia ile karşılaştırıldığında ". invadopodia değerlendirilmesi için tercih edilen yöntem, (s) her bir hücre tipinde doğal özelliklere bağlıdır. Örneğin, hücre başına invadopodia sayısını sayma veya invadopodia içeren hücrelerin yüzdesini belirlemede analiz hücreleri birkaç önemli invadopodia içeriyorsa iyi çalışan basit bir yaklaşımdır, ancak invadopodia onlarca veya nerede invadopodia küçük olabilir sahip hücrelerde daha zorlaşır ve zor tespit etmek. bozulma testi kullanılarak mümkün ön invadopodia v yüzdesini hesaplamak için yapars. alçaltıcı matris yüzdesine invadopodia ile hücrelerin toplam sayısını karşılaştırarak tek bir hücre ya da bir nüfus içinde olgun invadopodia. Daha az hücre invadopodia sergileyen hücrelere kıyasla alçaltıcı matris bir farklılık vardır, bu hücrelerin bu hücrelerin tespit edilen zaman matris bozulması yeteneğine sahip olan ön-şekillendirme invadopodia olduğunu gösteriyor olabilir.Analiz için seçilen yöntem ne olursa olsun kombinasyon, bu olarak bağımsız bir biçimde arzu edilen invadopodia özelliklerini ölçmek için önemlidir. Mikroskop görüntüleri toplarken, tercihen bozulma düzeyi yüksek olan bölgelerde seçmekten yanlılığı önlemek için yerine floresan matrisi daha hücreleri (aktin), bakarak alanları seçin. Çoklu görüntü hücre popülasyonunun adil temsilini sağlamak için satın alınmalıdır. Görüntüler aynı zamanda, uygun bir büyütme ile elde edilebilir. Hücrelerin düzgün kesimler için, düşük büyütme yapabilirsinizbozulması alanlarda hala çözülebilir sürece daha fazla hücre toplamak için kullanılabilir. Yüksek büyütme görüntüleri tek tek hücrelerin altındaki alanları ölçmek ve bireysel invadopodia çözmek için tercih edilmektedir. Alanlar nicelendirildi yapıldığı zaman, yoğunluğuna dayalı görüntü eşik el ile ölçmek için matris bölgeleri tercih daha amacıdır. Tüm durumlarda, birden fazla bağımsız deneyler hücrelerin yeterli sayıda istatistiksel anlamlı tekrarlanabilir sonuçlar vermek için analiz edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu eser Batı Virginia Üniversitesi Meryem Babb Randolph Kanser Merkezi'nden bağış fonları tarafından desteklenmiştir. Biz erken tavsiye ve yardım için Susette Mueller (Georgetown Üniversitesi) ve Laura Kelley ederim. Batı Virginia Üniversitesi Mikroskopi Görüntüleme Tesisi kullanımı (Meryem Babb Randolph Kanseri Merkezi, NIH hibe P20 RR16440, P30 ve P30 RR032138 GM103488 tarafından desteklenen) minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
