Summary
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) जीन पीटकर पर कई फायदे के पास है और मोटे तौर पर जीन कार्यात्मक अध्ययन में एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. वेक्टर आधारित डीएनए आरएनएआई प्रौद्योगिकी के आविष्कार दीर्घकालिक और inducible जीन पछाड़ना संभव बना दिया है, और भी जीन मुंह बंद करने की व्यवहार्यता की वृद्धि हुई
Protocol
1. ShRNA constructs की पीढ़ी
- एक siRNA लक्ष्य (20-23 nucleotides) अनुक्रम पहले प्रकाशित 6 मापदंड या एक वेब आधारित एल्गोरिथ्म सर्वर, ऐसे "Ambion और GenScript से siRNA लक्ष्य खोजक" के रूप में उपयोग के आधार पर पहचानें.
- तालिका 1 में 1 चित्रा और उदाहरण दृश्यों की डिजाइन पर आधारित oligonucleotides के synthesize. बाहर कैर्री पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग कर oligonucleotides है P1 और P2 (denaturing की 94 में 30 चक्र ° सी 30 सेकंड के लिए, 60 में annealing के ° सी 30 सेकंड के लिए, और 30 सेकंड के लिए 72 ° C elongating) और U6 या एच 1 ले जाने प्लाज्मिड एक टेम्पलेट के रूप में प्रमोटर. पीसीआर उत्पाद पीसीआर शुद्धीकरण स्तंभ का उपयोग कर, शुद्ध. यह BamHI और HindIII द्वारा डाइजेस्ट और पचा एक पीसीआर शुद्धीकरण स्तंभ का उपयोग डीएनए को शुद्ध. Oligonucleotides के पी 3 और पी 4 (2.5 / 50 मिमी Tris के 100 μl में प्रत्येक के pmol μl • एचसीएल, 8.0 पीएच) 5 मिनट और धीरे धीरे परिवेश के तापमान को शांत के लिए उबलते द्वारा पानी रखना एक lentiviral vec डाइजेस्ट केचित्रा 2A में वर्णित है, EcoRI BamHI और द्वारा, और जेल शुद्धि प्रदर्शन के रूप में टो.
- बाहर कैर्री एक 1:10:10 दाढ़ अनुपात में / BamHI EcoRI पचा वेक्टर, एक / BamHI HindIII है पचा पीसीआर टुकड़ा और annealed के oligonucleotides एक जोड़ी (HindIII और दोनों सिरों पर EcoRI साइटों बनाने) के साथ एक 3 - टुकड़ा बंधाव (चित्रा 1).
- अत्यधिक कुशल सक्षम ई. रूपांतरण कोलाई DH5α ligated उत्पाद का उपयोग कोशिकाओं. P5 oligonucleotides है (वेक्टर में) और P6 (एच 1 या U6 प्रमोटर में) 7. का उपयोग कर कालोनियों स्क्रीन
- प्लास्मिड डीएनए एक वाणिज्यिक किट के साथ सकारात्मक कालोनियों से तैयार है और BamHI / EcoRI पाचन और डीएनए agarose वैद्युतकणसंचलन द्वारा डालने की उपस्थिति की पुष्टि. अनुक्रम क्षेत्र प्रमोटर और shRNA oligonucleotide P5 का उपयोग युक्त.
- Lentivirus shRNA अभिव्यक्ति ले जाने के डीएनए तैयार प्लास्मिड डीएनए Midi या मैक्सी तैयारी किट (endotoxin के मुक्त पसंद है) का प्रयोग करेंकैसेट. 260 एनएम के अवशोषण को मापने के द्वारा डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. डीएनए 260 nm/280 एनएम अनुपात का उपयोग शुद्धता की जाँच करें और यकीन है कि यह 1,8 करने के लिए 2,0 की श्रेणी में आता है. Lentivirus प्लाज्मिड agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग अखंडता की जाँच करें. अभिकर्मक के लिए सुपर coiled डीएनए होना चाहिए.
2. Lentivirus प्रोटोकॉल
सावधानियां: lentiviral वैक्टर मानव वायरस 1 इम्यूनो (एचआईवी -1) अक्षम जीनोम और प्रतिकृति से प्राप्त कर रहे हैं. उन्होंने व्यापक रूप से किया गया है दोनों विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित करने की क्षमता की वजह से जीन वितरण में इस्तेमाल किया. बहरहाल, दो प्रमुख जोखिम lentivirus का उपयोग अध्ययन में मौजूद हैं. (1) प्रतिकृति - सक्षम lentivirus की पीढ़ी के लिए संभावित. इस खतरे को बहुत अगर तीसरी पीढ़ी lentiviral प्रणाली में प्रयोग किया जाता है कम कर सकते हैं. (2) oncogenesis के लिए संभावित. इस जोखिम अगर किया आवेषण oncogenic हैं या ट्यूमर शामक दबाने exacerbated किया जा सकता है.अनुसंधान एचआईवी आधारित lentivirus में शामिल गतिविधियों एनआईएच (lentiviral वैक्टर के साथ अनुसंधान के लिए जैवसुरक्षा विचार का पालन करना चाहिए http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) और जैवसुरक्षा समिति से अनुमोदन की आवश्यकता एक शोधकर्ता संस्था के. आम तौर पर बढ़ाया स्तर 2 जैवसुरक्षा (बीएसएल-2) नियंत्रण प्रयोगशाला की स्थापना के लिए आवश्यक है अगर lentiviral वैक्टर उपयोग किया जाता है.
- 4 प्लेट × 10 सेमी बर्तन और रात भर संस्कृति में पूरी DMEM मध्यम (10% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम मिमी 2 एल glutamine, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, 100 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ आपूर्ति की DMEM) के साथ 10 6 HEK 293T कोशिकाओं 37 ° C एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में. पूर्व गर्म ऑप्टी सदस्य के 5 मिलीलीटर मैं कम सीरम मीडिया (Invitrogen) के साथ मध्यम बदलें.
- ShRNA युक्त lentiviral वेक्टर के 10 μg, 5 μg प्रत्येक तीसरे gener की: एक समाधान तैयारव्यावहारिक lentivirus पैकेजिंग (उच्च शुद्धता के साथ तैयार की, तीन पैकेजिंग प्लास्मिड VSV जी: एक लिफाफा प्रोटीन, pRSV - रेव के लिए राजस्व के लिए, और / pMDLg pRRE के / झूठ नीति है, जो lentivirus पैकेजिंग के लिए आवश्यक हैं के लिए) प्लास्मिड, 36 2M 2 CaCl, और बाँझ पानी के 300 μl μl.
- समाधान: बी 2 × खारा बफर Hepes 300 μl (281 मिमी, NaCl 100 मिमी HEPES को 1.5 मिमी ना 2 4 HPO, 0.5 एन NaOH द्वारा 7.12 समायोजित और .22 माइक्रोन फिल्टर द्वारा निष्फल पीएच) तैयार करें.
- धीरे धीरे समाधान बी में एक समाधान ड्रॉप जबकि समाधान बी के माध्यम से एक विंदुक के साथ हवा बुदबुदाती. परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्यूब को छोड़ दें.
- धीरे धीरे मिश्रित समाधान HEK 293T सेल संस्कृति 2.1 चरण में तैयार पकवान में ए / बी ड्रॉप और एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ° C पर 4-6 घंटे के लिए सेते हैं.
- पूरा DMEM मध्यम 7 मिलीग्राम के साथ मध्यम बदलें. 24 घंटे बाद, पूरा DMEM मध्यम के एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर जोड़ें. मध्यम cont के जल का संग्रहणसंस्कृति की एक और 24 घंटे के बाद lentivirus aining.
- 1500 आरपीएम, परिवेश के तापमान पर 10 मिनट के लिए मध्यम स्पिन. एक .45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर और प्रवाह के माध्यम से 25,000 rpm पर ultracentrifugation द्वारा lentivirus युक्त मध्यम स्पिन (SW28 झूल बाल्टी रोटर के साथ 125.000 × जी के बराबर, के Beckman ultracentrifuge 90 एक्स्ट्रा लार्ज), 90 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस. एक कंटेनर में 5% ब्लीच अंतिम एकाग्रता के साथ सतह पर तैरनेवाला छानना.
- ठंड पीबीएस 0.5-1.0 मिलीलीटर में lentivirus गोली Resuspend और ट्यूब प्रति 50-100 μl में lentivirus aliquots. उन्हें -80 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
- lentivirus की अनुमापांक वाणिज्यिक (जैसे सेल Biolabs से QuickTiter lentivirus Quantitation किट, Inc के रूप में) एक वास्तविक समय पीसीआर प्रोटोकॉल 8, किट, या सह व्यक्त फ्लोरोसेंट मार्कर का निर्धारण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है . आमतौर पर, एक संस्कृति 10 सेमी पकवान 0.5-1.0 के बारे में उत्पादन × 10 8 infec कर सकते हैंtious इकाइयों (आइयू).
3. संक्रमण और संक्रमित कोशिकाओं की विशेषता
- बीज को पूरा मध्यम 2 मिलीलीटर में 6 अच्छी तरह से एक थाली में 30-40% confluency (के बारे में × 5-8 5 10 कोशिकाओं सेल आकार पर निर्भर करता है) से संक्रमित होने की कोशिकाओं. 37 पर रातोंरात संस्कृति कोशिकाओं ° सी में एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर.
- ताजा माध्यम के 1 मिलीग्राम 8 μg / polybrene की मिलीलीटर (सिग्मा, बिल्ली H9268 #) या 5 μg / protamine मिलीलीटर (सिग्मा, P4020 # बिल्ली) युक्त के साथ मध्यम बदलें.
- संक्रमण (MOI) के फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ lentivirus का उपयोग एक विशेष सेल लाइन के लिए 9 रेंज के एक उपयुक्त बहुलता का निर्धारण करते हैं. गणना या empirically lentivirus की राशि निर्धारित करने के लिए सेल लाइन को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा. धीरे धीरे थाली में lentivirus छोड़ देता है और धीरे यह 10 सेकंड के लिए हिला.
- 37 ° C पर एक 5% 6 घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली और सेते हैं तो सामान्य पूर्ण मध्यम के साथ मध्यम की जगह.
- कम से कम दो दासंक्रमण के बाद वाईएस, फ्लोरोसेंट मार्करों और / व्यक्त lentivirus के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं की जाँच करें या lentiviral वैक्टर एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों व्यक्त करने के लिए मध्यम करने के लिए इसी एंटीबायोटिक जोड़ें. एक inducible वेक्टर के लिए, एक Tet पर प्रणाली (चित्रा 2) संस्कृति, जैसे माध्यम में कोशिकाओं से टेट्रासाइक्लिन मुक्त FBS के साथ तैयार है. कोशिकाओं 2-3 दिनों के बाद संक्रमण विभाजित. कोशिकाओं के एक भाग लेने के लिए उन्हें मध्यम में संवर्धन ≥ 2 दिनों के लिए 1.5 / μg मिलीलीटर डॉक्सीसाइक्लिन (Dox) के साथ और बिना आपूर्ति inducible जीन पछाड़ना परीक्षण.
- पश्चिमी धब्बा, वास्तविक समय पीसीआर या संक्रमण के बाद ≥ 2 दिन Immunostaining, एंटीबायोटिक चयन के बाद 2 दिन, या Dox अलावा ≥ 2 दिन के बाद (Tet पर एक inducible प्रणाली के लिए) द्वारा जीन पछाड़ना की जाँच करें.
- अलग अलग दृष्टिकोण (जैसे सेल प्रसार assays, नरम अगर संस्कृति अध्ययन, प्रवास assays के आक्रमण assays के और ट्यूमर गठन के अध्ययन के रूप में) का उपयोग करने के लिए लक्ष्य जीन कर्नाटक के प्रभावों का निर्धारणकक्षों की दुष्टता पर ockdown.
4. Xenograft माउस मॉडल का अध्ययन
- माउस anesthetization 70% इथेनॉल इंजेक्शन चूहों के संक्रमण को रोकने के लिए सभी सतहों को साफ. Athymic नग्न चूहों (NCI-फ्रेडरिक) 2% का उपयोग कर isoflurane संज्ञाहरण शामिल कक्ष सेल टीका से पहले 10 मिनट में ऑक्सीजन के साथ मिलाया. चतनाशून्य करना 1 isoflurane% नाक शंकु के माध्यम से ऑक्सीजन के साथ मिश्रित का उपयोग संज्ञाहरण बनाए रखें. उत्कृष्ट वेंटिलेशन के साथ एक कमरे में इस कदम उठाने के लिए और प्रेरण कक्ष isoflurane मेहतर फिल्टर देते हैं.
- ShRNAs ले जाने कोशिकाओं प्रचार. Inducible वैक्टर Tet पर टेट्रासाइक्लिन मुक्त माध्यम का उपयोग करें. इस कोशिकाओं Trypsinize और उन्हें पूरा मध्यम युक्त 50% Matrigel में resuspend. एक हीटिंग पैड पर नग्न चूहों (30 डिग्री सेल्सियस) स्थिति और माउस प्रति 1-2 इंजेक्शन साइटों के साथ चूहों में कोशिकाओं के 200 μl (1-10 × 6 10, कोशिकाओं की दुष्टता पर निर्भर करता है) इंजेक्षन. 25 के साथ सीरिंज का उपयोग करें.5 गेज सुई चमड़े के नीचे इंजेक्शन, और 28-30 orthotopic इंजेक्शन के लिए गेज सुई के लिए.
- विधान shRNA वैक्टर के लिए, लक्ष्य जीन shRNA और एक तले shRNA व्यक्त की कोशिकाओं में इंजेक्शन के साथ चूहों के दो समूहों का उपयोग करें. के लिए Tet पर inducible shRNA वैक्टर, लक्ष्य जीन shRNA और एक तले shRNA, सामान्य पानी के साथ आपूर्ति और Dox (1.5 मिलीग्राम / एमएल) पानी (2 × shRNAs 2 उपचार = 4 समूहों) युक्त कोशिकाओं को ले जाने के साथ इंजेक्शन चूहों के 4 समूहों का उपयोग . Dox - युक्त पानी सप्ताह में दो बार बदलें.
- मॉनिटर और साप्ताहिक या एक डिजिटल vernier कैलिपर द्वारा सप्ताह में दो बार ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई और ट्यूमर मात्रा में (वी) की गणना सूत्र = 1/2 वी (× 2 लंबाई चौड़ाई) 10. सुनिश्चित करें कि ट्यूमर मात्रा संस्थागत ACUC के दिशा निर्देशों (जैसे, शरीर के वजन के 10%) से अधिक नहीं है. किसी भी का उपयोग एक संस्थागत ACUC द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल अगर यह व्यापक ulceration या परिगलन, स्पष्ट infectio का कोई संकेत नहीं दिखाता है माउस Euthanizen, अनियंत्रित खून बह रहा है या अंत में मंच बीमारी.
- ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस टीका एक bioluminescent 11 जुगनू luciferase, मार्कर के रूप में व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं के लिए नजर रखी जा सकती है. माउस anesthetization इमेजिंग और 70% इथेनॉल द्वारा चूहों के संक्रमण को रोकने के लिए सभी सतहों को साफ. चूहों चतनाशून्य करना 4.1 चरण में वर्णित के रूप में. (150 मिलीग्राम / किग्रा) luciferin intraperitoneally इंजेक्षन. एक IVIS इमेजिंग प्रणाली (कैलिपर लाइफ साइंसेज, Inc) के रूप में एक वाणिज्यिक इमेजिंग प्रणाली, एक कीटाणुरहित इमेजिंग के चेंबर में चूहों रखें. संज्ञाहरण लीवर पर मुड़ें 1 isoflurane% ऑक्सीजन के साथ मिलाया द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए. उत्कृष्ट वेंटिलेशन के साथ एक कमरे में इस कदम को आचरण.
- 5 मिनट उजागर द्वारा पहली छवि ले लो और अपने संकेत तीव्रता की जाँच. समय जोखिम को समायोजित करने के लिए पृष्ठभूमि बनाम इष्टतम संकेत के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए. अनुभवतः इमेजिंग समय निर्धारित है, जो आम तौर पर चमड़े के नीचे ट्यूमर के लिए 1-5 मिनट है.
- एक अनुमोदित प्रोटोकॉल द्वारा चूहों Euthanizeसंस्थागत ACUC जब ट्यूमर आकार 1000 के बारे में 3 मिमी, या रूप में ACUC दिशा निर्देशों के द्वारा निर्दिष्ट तक पहुँचने के द्वारा. आबकारी xenograft ट्यूमर, उन्हें वजन और तस्वीरें ले लो. का प्रक्रियण रोग ट्यूमर कोशिका morphology निर्धारित विश्लेषण के रूप में विभिन्न अध्ययनों के लिए ट्यूमर के नमूने, और पश्चिमी धब्बा और वास्तविक समय पीसीआर अध्ययन जीन अभिव्यक्ति का परीक्षण.
5. प्रतिनिधि परिणाम
Athymic नग्न चूहों में, यह प्रोटोकॉल xenograft जुगनू luciferase व्यक्त एमडीए MB-231 कोशिकाओं (कैलिपर लाइफ साइंसेज मानव स्तन ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं) के ट्यूमर गठन पर YY1 पछाड़ना के प्रभाव का अध्ययन किया गया था. मानव YY1 shRNA लक्ष्य अनुक्रम "AGC आगा AGC AGG टी जी सी आगा टी GGG है. तले हुए अनुक्रम GGG अधिनियम अधिनियम CTA TTA CGT कैट टी "भी एक नियंत्रण shRNA (आगे), जो किसी भी ज्ञात प्रतिलिपि करने के लिए महत्वपूर्ण समानता नहीं था के लिए बनाया गया था. inducible shRNA constructs Tet पर बनाने के लिए इस्तेमाल एक उदाहरण के रूप में, oligonucleotides के YY1 साथतालिका 1 में दिखाया जाता है. एक परिणाम के रूप में, दो lentiviral वैक्टर, plu Puro - इंदु - YY1 और shRNA और Plu Puro - इंदु - आगे shRNA, का निर्माण किया गया और वे lentiviruses उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया. हम इन lentiviruses का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत रूप से दो एमडीए MB-231 सेल क्लोनों (क्लोनों 1 और 3) दोनों टेट्रासाइक्लिन (tetr) नियामक और जुगनू luciferase व्यक्त संक्रमित. पॉलीक्लोनल सेल आबादी puromycin चयन के बाद प्राप्त किया गया चित्रा 3A के Dox प्रेरित इन एमडीए MB-231 Plu Puro - इंदु YY1 shRNA lentivirus द्वारा संक्रमित कोशिकाओं में YY1 पछाड़ना से पता चलता है. हम तो इन inducible YY1 shRNA और cont shRNA lentiviruses व्यक्तिगत संक्रमित मनाया कि YY1 कमी के एमडीए MB-231 कोशिकाओं (3B चित्रा) के invasiveness कम 3 क्लोन की पॉलीक्लोनल कोशिकाओं का इस्तेमाल किया. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण Dox प्रेरित एमडीए MB-231 है इंदु YY1 shRNA के साथ कोशिकाओं में YY1 मुंह बंद करने की पुष्टि की है, जबकि उद्योगों के आगे shRNA युक्त कोशिकाओं को इस प्रभाव नहीं दिखा (चित्र 3C). हम तो xenograft माउस मॉडल के अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं. नियंत्रण समूह की तुलना में, इंदु YY1 shRNA के साथ एमडीए MB-231 कोशिकाओं द्वारा प्रत्यारोपित और Dox युक्त पानी के साथ आपूर्ति चूहों कम ट्यूमर गठन से पता चला, जब bioluminescence (4A चित्रा) द्वारा कल्पना और ट्यूमर वजन द्वारा निर्धारित (4B चित्रा ). इन xenograft ट्यूमर में YY1 मुंह बंद पश्चिमी धब्बा चित्रा 4C में दिखाया अध्ययन के द्वारा पुष्टि की गई.
आकृति 1. एक shRNA निर्माण और shRNA प्रतिलेखन की पीढ़ी के लिए योजनाबद्ध आरेख P6 प्राइमरों P1 के दिखाए जाते हैं (उदाहरण के दृश्यों के लिए तालिका 1). पोल तृतीय: शाही सेना पोलीमरेज़ III (घ): पच अंत. आरेखण पैमाने पर करने के लिए नहीं है. यहाँ क्लिक करें बड़ी छवि को देखने के लिए .
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चित्रा 2. (ए) एक lentiviral वेक्टर और (बी) के तंत्र Tet पर inducible एच 1 जीन मुंह बंद करने के लिए इस्तेमाल किया प्रमोटर. के योजनाबद्ध चित्र lentiviral वेक्टर pLL3.7 14 के आधार पर पुनर्निर्मित किया गया. मानव ubiquitin सी प्रमोटर, Puro: puromycin, TRE: टेट्रासाइक्लिन उत्तरदायी तत्व, Dox: डॉक्सीसाइक्लिन, UBC पीआर एच 1 प्रमोटर: एच 1 - पीआर. Tetr: टेट्रासाइक्लिन नियामक. लीटर और Wre 5'LTR, 3'SIN एक lentiviral वेक्टर 14 की आवश्यक घटक हैं.
चित्रा 3. Dox प्रेरित YY1 मुंह बंद करने और एमडीए MB-231 कोशिकाओं के invasiveness पर उसके प्रभाव. दो पॉलीक्लोनल सेल से व्युत्पन्न आबादी में YY1 स्तर tetr व्यक्त एक क्लोन और 3 Plu Puro - इंदु YY1 shRNA lentivirus द्वारा संक्रमित है और और Dox की अनुपस्थिति उपस्थिति में संवर्धित. एमडीए MB-231 inducible shRNAs के साथ कोशिकाओं बी Boyden कक्ष परख. (* पी <00.05 बनाम अन्य तीन समूहों). सी. इन चार सेल आबादी में YY1 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि पश्चिमी blots.
चित्रा 4. प्रेरित मुंह बंद YY1 की एमडीए MB-231 कोशिकाओं द्वारा xenograft ट्यूमर गठन पर प्रभाव. सेल (बाएं) आरोपण और प्रतिनिधि bioluminescent 4 (सही) के बाद सेल टीका सप्ताह में IVIS इमेजिंग सिस्टम के द्वारा कब्जा कर लिया छवियों के योजनाबद्ध आरेख. 4 सप्ताह में बी xenograft ट्यूमर वजन. * पी 0.05 ≤. YY1 की सी. पश्चिमी blots और Dox की अनुपस्थिति उपस्थिति में एमडीए MB-231 के इंदु YY1 shRNA के साथ कोशिकाओं के xenografts में अभिव्यक्ति और β-actin. शीर्ष पर लेबल व्यक्तिगत चूहों के नाम हैं.
| Oligonucleotide | अनुक्रम (5 '- 3') | उपयोग और स्थान |
| P1 (Tet में एच1) | cagt GGATCC CGA ACG CTG ACG टी सी ए टी सी ए एसीसी सी | 5'-H1 के प्रमोटर के अंत में, पीसीआर |
| P1 (U6) | cagt GGATCC GAC जीसीसी जीसीसी एटीसी TCT AGG | 5'-U6 प्रमोटर के अंत में, पीसीआर |
| P2 (एच 1 Tet पर YY1 के लिए के साथ) | cagc AAGCTT GAA एटीसी TGC एसीसी TGC टीटीसी TGC टीसीसी ग GGG एटीसी TCT एटीसी अधिनियम जी ए टी AGG GAA सी | पीसीआर, 3'-Tet पर inducible एच 1 प्रमोटर के अंत में |
| P2 (U6 साथ YY1 के लिए) | cagc AAGCTT GAA एटीसी TGC एसीसी TGC टीटीसी TGC टीसीसी ग एएए CAA GGC TTT TCT सीसीए agg एक gat | 3'-U6 प्रमोटर के अंत में, पीसीआर |
| पी 3 (YY1 के लिए) | AGC टीटी एटीसी TGC एसीसी TGC टीटीसी TGC टीसीसी ग ttttt जी | पी 4 के साथ annealed |
| पी 4 (YY1 के लिए) | aattc aaaaa | में पी 3 के साथ annealed | |
| P5 (pLL3.7 के लिए) | GGG टीएसी AGT GCA GGG GAA आगा अता जी | पीसीआर जांच के लिए P6 साथ इस्तेमाल किया |
| P6 (के लिए एच 1 Tet पर) | जी ए टी टीटीसी सीसीए GAA सीएसी एटीए GCG एसी | पीसीआर स्क्रीनिंग, P5 साथ इस्तेमाल के लिए |
| P6 (U6 के लिए) | AGG GTG AGT टीटीसी सीटीटी टीटीजी टी जी सी टीजी | पीसीआर स्क्रीनिंग, P5 साथ इस्तेमाल के लिए |
तालिका 1. संश्लेषित shRNA constructs पैदा करने में इस्तेमाल किया P1 और माउस U6 और Tet पर inducible मानव एच 1 प्रमोटरों के लिए P6 दृश्यों oligonucleotides है. प्रदान की जाती हैं. मानव YY1 GGG AGC आगा AGC AGG टी जी सी आगा YY1 करने के लिए विशिष्ट दृश्यों को उजागर कर रहे हैं टी. के एक shRNA लक्ष्य के अनुक्रम के साथ एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. YY1 की दो p2 के दृश्यों के दो प्रमोटरों के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, क्रमशः. विधान U6 / वाईY1 shRNA 15 पहले से वर्णित किया गया है, जबकि Tet पर H1/YY1 इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था. P5 वेक्टर विशिष्ट और अनुक्रम 14 pLL3.7 के लिए दिखाया गया है. प्रतिबंध एंजाइमों के दृश्यों को रेखांकित कर रहे हैं, जबकि दृश्यों पीसीआर प्रवर्धन के दौरान प्रमोटरों के लिए पानी रखना करने के लिए italicized है.
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Discussion
यह प्रोटोकॉल shRNA का उपयोग जीन दस्तक करने के लिए नीचे और अपनी जैविक प्रभाव का उपयोग कर bioluminescent इमेजिंग vivo में ट्यूमर कोशिकाओं के विकास की कल्पना की विधि का वर्णन एक shRNA का लक्ष्य साइट पर प्रतिबंध के तीन साइटों की किसी भी शामिल नहीं (BamHI HindIII, और EcoRI) किया जाना चाहिए. subcloning के लिए. एक दुर्लभ परिदृश्य में, जब इन साइटों में से किसी भी मौजूद है, एक अतिरिक्त प्रतिबंध एंजाइम का निर्माण पैदा करने में की जगह इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम shRNA lentiviral वैक्टर के निर्माण को गति देगा. सबसे पहले, पीसीआर प्लास्मिड टेम्पलेट U6 या एच 1 प्रमोटर युक्त एक अलग lentiviral वेक्टर (आमतौर पर एम्पीसिलीन) से एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन (जैसे kanamycin के रूप में) हो सकता है. इस परिवर्तन की पृष्ठभूमि है प्लाज्मिड टेम्पलेट के कारण कम कर सकते हैं. दूसरा, यह आवश्यक है सक्षम ई. का उपयोग परिवर्तन की उच्च क्षमता के साथ कोलाई कोशिकाओं. एक प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक पोटेशियमएन डी मैंगनीज आयनों लिए सक्षम ई. उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अत्यंत उच्च दक्षता के साथ 12 कोलाई कोशिकाओं. तीसरा, एक चयन मार्कर subcloning के 3 टुकड़ा की सुविधा कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, एक lentiviral वेक्टर β-galactosidase के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट (LacZ) के कि पीसीआर टुकड़ा की प्रविष्टि द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा और P3/P4 oligonucleotides के annealed शामिल इंजीनियर हो सकता है. इस मामले में, आवेषण के साथ पुनः संयोजक प्लास्मिड सफेद कालोनियों के रूप में, जबकि आवेषण के बिना इन नीला हो जाएगा, जब एक्स - लड़की के लिए संपर्क (5 - ब्रोमो 4 - क्लोरो 3 indolyl बीटा डी galacto - pyranoside) .
lentiviral वैक्टर और तीन पैकेजिंग प्लास्मिड गुणवत्ता कुशल lentivirus उत्पादन के लिए आवश्यक है. एक बहुत आर्थिक और कुशल अभिकर्मक कैल्शियम फॉस्फेट तेज़ी पद्धति का उपयोग करके प्रदान किया गया है. 13 polyethylenimine या सबसे वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मकों भी lentivirus उत्पादन में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक उचित MOI के लिए का उपयोगआर संक्रमण, यह महत्वपूर्ण है लिए उत्पादन lentivirus के titers निर्धारित है.
सभी प्रयोगात्मक समूहों के चूहे एक ही कमरे में रखे उनके circadian ताल अंतर है कि xenograft ट्यूमर इमेजिंग दौरान bioluminescence का बदलाव का कारण हो सकता है को समाप्त किया जाना चाहिए. माउस इच्छामृत्यु की दृष्टिकोण सीओ 2 और isofluorane द्वारा asphyxiation अधिक मात्रा में शामिल हैं और संस्थागत ACUC द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस भाग में काम अमेरिकन कैंसर सोसायटी से रिसर्च स्कॉलर (116,403-RSG-09-082-01-एम जी ओ) अनुदान और जी एस करने के लिए जागो वन विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य विज्ञान के अंदर धन के द्वारा समर्थित किया गया. डीबीएस NCI प्रशिक्षण अनुदान 5T32CA079448 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol. | |||
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment | |||
| PCR thermocycler | |||
| Ultracentrifuge | |||
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers | |||
| Digital Vernier caliper | |||
| IVIS imaging system | |||
| Highly competent DH5a E. coli | |||
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes | |||
| T4 DNA Ligase | |||
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE | |||
| Materials List | |||
References
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