Summary
התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת הגן
Abstract
התערבות RNA (RNAi) מעכב ביטוי גנים על ידי mRNAs יעד משפילים במיוחד. מאז גילויו של פעמיים תקועים התערבות RNA קטן (siRNA) בגן ההשתקה 1, RNAi הפך לכלי רב עוצמה המחקר במחקרים תפקוד הגן. לעומת מחיקה גנטית, RNAi בתיווך להשתקת גנים בעל יתרונות רבים, כגון הקלות שבה היא מתבצעת והתאמתו שורות תאים ביותר. מחקרים רבים הדגימו את היישומים של טכנולוגיית RNAi בחקר הסרטן. בפרט, פיתוח טכנולוגיית ה-DNA וקטור מבוסס לייצר סיכת ראש RNA קטן (shRNA) מונע על ידי U6 או האמרגן H1 הפכה לטווח ארוך הגן מושרה להשתיק 2,3 אפשרי. השימוש בו בשילוב עם וקטורים ויראליים מהונדסים גנטית, כמו lentivirus, מקלה על יעילות גבוהה של משלוח shRNA ו / או אינטגרציה לתוך הדנ"א הגנומי לביטוי shRNA יציב.
אנו מתארים detaileהליך D באמצעות וקטור מבוססי טכנולוגיית ה-DNA RNAi לקבוע תפקוד הגן, כולל בנייה של וקטורים lentiviral המבטאים shRNA, ייצור lentivirus וזיהום התא, ומחקרים תפקודית באמצעות מודל xenograft העכבר.
אסטרטגיות שונות דווחו ביצירת מבנים shRNA. פרוטוקול המתואר כאן העסקת הגברה PCR ו קשירת 3-שבר יכול לשמש ישירות וביעילות ליצור shRNA המכילים מבנים lentiviral מבלי לעזוב כל הצמוד נוקלאוטיד נוסף ברצף shRNA קידוד. מאז shRNA ביטוי קלטות שנוצרו על ידי אסטרטגיה זו ניתן לגזור על ידי אנזימי הגבלה, הם יכולים להעביר בקלות וקטורים אחרים עם סמנים ניאון או אנטיביוטיקה שונים. ריאגנטים transfection המסחריים יכולים לשמש בייצור lentivirus. עם זאת, בדו"ח זה, אנו מספקים שיטה כלכלית באמצעות סידן זרחתי משקעים כי ניתן להשיג על יעילות transfection של 90%293T תאים. לעומת מכוננת וקטורים shRNA הביטוי, מערכת shRNA מושרה מתאים במיוחד כדי לדפוק את הגן חיוני התפשטות תאים. אנחנו מדגימים להשתקת גנים של ין יאנג 1 (YY1), oncogene פוטנציאל בסרטן השד 4,5, על ידי ט במערכת מושרה shRNA והשפעתו על היווצרות הגידול. מחקר באמצעות lentivirus מחייב סקירה ואישור פרוטוקול בטיחות ביולוגית על ידי ועדת בטיחות ביולוגית של המוסד של החוקר. מחקרים באמצעות מודלים של בעלי חיים מחייבת בדיקה ואישור של פרוטוקול בעלי חיים על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (ACUC) במוסד של החוקר.
Protocol
1. דור בונה shRNA
- זהה את רצף siRNA-היעד (20-23 נוקלאוטידים) על פי קריטריונים שפורסמו בעבר 6 או להשתמש בשרת מבוסס אינטרנט אלגוריתם, כגון "Finder siRNA יעד" מ Ambion ו GenScript.
- לסנתז oligonucleotides מבוסס על העיצוב של רצפי איור 1, למשל בטבלה 1. לבצע הגברה באמצעות PCR oligonucleotides P1 ו-P2 (30 מחזורים של denaturing על 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול ב 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו מתארך ב 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) ו פלסמיד שנשא U6 או H1 האמרגן כתבנית. לטהר את המוצר באמצעות PCR טור טיהור PCR. לעכל את זה על ידי BamHI ו HindIII ולטהר את ה-DNA מתעכל באמצעות טור טיהור PCR. לחשל oligonucleotides P3 ו P4 (2.5 pmol / μl של כל 100 μl של 50 מ"מ טריס • HCl, pH 8.0) על ידי רותחים במשך 5 דקות ומצננים לאט לטמפרטורת הסביבה. לעכל vec lentiviralטור, כמו זה המתואר באיור 2 א, על ידי BamHI ו EcoRI, ולבצע ג'ל לטיהור.
- ביצוע קשירת 3-קטע עם וקטור, EcoRI מתעכל BamHI /, שבר BamHI / HindIII-מתעכל PCR ואחד זוג oligonucleotides annealed (להרכיב HindIII ואתרים EcoRI על שני הקצוות) ביחס של 01:10:10 טוחנת (איור 1).
- להפוך את ה מוסמכת היעילה ביותר קולי תאים DH5α באמצעות מוצר ligated. מסננים את המושבות באמצעות oligonucleotides P5 (בווקטור) ו P6 (ב האמרגן H1 או U6). 7
- הכן את ה-DNA פלסמיד מן המושבות חיוביות עם ערכת מסחרי לאשר את קיומו של הכנס על ידי עיכול BamHI / EcoRI ו אלקטרופורזה DNA agarose. אזור רצף המכיל את היזם shRNA באמצעות P5 oligonucleotide.
- השתמש פלסמיד מידי או מקסי, הכנת ערכות ה-DNA (רעלן פנימי ללא עדיף) להכין את ה-DNA lentivirus נושאת ביטוי shRNAהקלטת. קבע את ריכוז ה-DNA על ידי מדידת ספיגת ב 260 ננומטר. לבדוק את טוהר DNA באמצעות 260 nm/280 יחס ננומטר לוודא שהוא נופל בטווח של 1.8-2.0. בדוק את שלמות פלסמיד lentivirus באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל. ה-DNA של transfection צריך להיות סופר מפותל.
2. Lentivirus transfection
אמצעי זהירות: וקטורים lentiviral נגזרות וירוס הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1) הגנום ושכפול כשיר. הם היו בשימוש נרחב למסירה גן בשל היכולת של הדבקה גם חלוקת ולא חלוקת תאים. עם זאת, שני סיכונים עיקריים קיימים מחקרים באמצעות lentivirus. (1) פוטנציאל לייצור של lentivirus שכפול-המוסמכת. סיכון זה יכול להיות מופחת באופן משמעותי אם מערכת הדור השלישי lentiviral משמש. (2) פוטנציאל oncogenesis. סיכון זה עלול להחמיר אם מוסיף שבוצעו הם בשעור או להדחיק מדכאי סרטן.פעילויות המחקר המעורבים lentivirus HIV המבוסס על צריכה לבצע את "שיקולי בטיחות ביולוגית למחקר עם וקטורים lentiviral" של NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) ודורשים אישור של ועדת בטיחות ביולוגית המוסד של החוקר. באופן כללי, רמת בטיחות ביולוגית משופרת-2 (BSL-2) הבלימה נדרשת הגדרה במעבדה אם וקטורים lentiviral משמשים.
- צלחת 4 × 10 6 HEK 293T תאים עם שלם DMEM בינוני (DMEM מסופק עם 10% בסרום שור עוברית (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל) ב -10 מנות ס"מ ותרבות לילה ב 37 מעלות 5% CO 2 באינקובטור. החלף בינוני עם 5 מ"ל של מחומם מראש Opti-MEM אני מופחתת סרום מדיה (Invitrogen).
- הכן פתרון: 10 מיקרוגרם של וקטור shRNA המכיל lentiviral, 5 מיקרוגרם כל אחת gener 3lentivirus ation אריזה פלסמידים (מוכן עם טוהר גבוה: שלוש פלסמידים אריזה כוללים VSV-G: חלבון המעטפת, pRSV-Rev: עבור Rev, ו pMDLg / pRRE: על איסור פרסום / pol, המהווה מרכיב חיוני אריזה lentivirus), 36 μl של 2M CaCl 2, ו - 300 μl של מים סטריליים.
- הכן פתרון ב ': 300 μl של 2 Hepes × שנאגרו מלוחים (281 mM NaCl, 100 HEPES מ"מ, 1.5 מ"מ Na 2 HPO 4, pH 7.12 מותאם על ידי 0.5 N NaOH ו - 0.22 מיקרון על ידי עיקור מסנן).
- לאט לאט לרדת פתרון ב 'פתרון תוך זמן מבעבע אוויר דרך פתרון ב' עם טפטפת. השאירו את הצינור בטמפרטורת הסביבה למשך 30 דקות.
- לאט לאט להפיל את הפתרונות מעורבות B / לתוך קערה 293T HEK התא התרבות מוכן בשלב 2.1 ו - דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור במשך 4-6 שעות.
- החלף בינוני עם 7 מ"ל של מדיום DMEM מלאה. לאחר 24 שעות, מוסיפים 5 מ"ל נוספים של המדיום DMEM מלאה. לקצור את המשך בינוניaining lentivirus לאחר שעות אחר 24 של תרבות.
- ספין בינוני ב -1,500 סל"ד, טמפרטורת הסביבה על 10 דקות. סנן supernatant באמצעות מסנן 0.45 מיקרון ו לסובב את הזרימה דרך תווך המכיל lentivirus ידי ultracentrifugation ב -25,000 סל"ד (שווה ל 125.000 × גרם עם רוטור SW28 דלי מתנדנד, ultracentrifuge Beckman XL-90), 4 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. למזוג supernatant למיכל עם אקונומיקה 5% (הריכוז הסופי).
- Resuspend גלולה lentivirus ב 0.5-1.0 מ"ל של קר PBS ולעשות aliquots lentivirus אל μl 50-100 לכל צינור. לאחסן אותן -80 ° C.
- כייל של lentivirus ניתן לקבוע באמצעות ערכות מסחריות (כגון ערכת Lentivirus QuickTiter quantitation מ Biolabs סלולריים, Inc), לפי בזמן אמת PCR פרוטוקול 8, או על ידי קביעת סמן שיתוף הביע ניאון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או cytometry זרימה . בדרך כלל, 1 ל -10 ס"מ צלחת התרבות יכולים לייצר על 0.5-1.0 × 10 8 infectious יחידות (IU).
3. זיהום אפיון תאים נגועים
- זרעים התאים להידבק ב 2 מ"ל של מדיום שלמה בצלחת 6 גם עם confluency 30-40% (כ 5-8 × תלוי בגודל התא, 10 5 תאים). התרבות תאים לילה ב 37 מעלות 5% CO 2 באינקובטור.
- החלף בינוני עם 1 מ"ל של מדיום חדש המכיל 8 מיקרוגרם / מ"ל של polybrene (Sigma, חתול # H9268) או 5 מיקרוגרם / מ"ל של protamine (Sigma, חתול # P4020).
- לקבוע ריבוי מתאימה לזיהום (משרד הפנים) טווח 9 לקו תא מסוים באמצעות lentivirus עם סמן פלואורסצנטי. חישוב או אמפירי לקבוע את כמות lentivirus לשמש כדי להדביק את הקו הסלולרי. לאט לאט לרדת lentivirus לתוך צלחת ובעדינות לנער אותו 10 שניות.
- דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב CO 5% 2 חממה 6 שעות ולאחר מכן להחליף בינוני עם בינוני מלא רגיל.
- לפחות 2 דהys לאחר ההדבקה, לבדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור lentivirus המבטאים סמנים ניאון ו / או להוסיף אנטיביוטיקה המתאימה בינוני עבור וקטורים lentiviral המבטאים גנים עמידות לאנטיביוטיקה. עבור וקטור מושרה, כגון ט על התרבות המערכת, (איור 2) התאים בינוני מוכן עם טטרציקלין ללא FBS. פיצול התאים 2-3 ימים שלאחר זיהום. קח חלק מהתאים כדי לבחון הגן מציאה מושרה על ידי culturing אותם במדיום מסופק עם ובלי 1.5 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין (DOX) עבור ≥ 2 ימים.
- בדוק מציאה הגן על ידי כתם המערבי, Real-Time PCR או immunostaining ≥ 2 ימים לאחר ההדבקה, 2 ימים לאחר בחירת אנטיביוטיקה, או (עבור מערכת ט ב מושרה) ≥ 2 ימים לאחר כן DOX.
- לנצל את הגישות שונות (כגון הפצת מבחני סלולריים, רכים לימודי התרבות אגר, מבחני הגירה, מבחני הפלישה ומחקרים היווצרות גידולים) כדי לקבוע את ההשפעות של KN הגן היעדockdown על גידול ממאיר של התאים.
4. עכבר Xenograft דגם מחקר
- נקו את כל משטחי העכבר של הרדמה על ידי הזרקת אתנול 70% על מנת למנוע זיהום של עכברים. להרדים עכברים בעירום athymic (NCI-פרדריק) באמצעות 2% isoflurane מעורבב עם חמצן דקות אינדוקציה הרדמה 10 קאמרית לפני חיסון התא. לשמור על הרדמה באמצעות 1% isoflurane מעורבת עם חמצן דרך האף קונוס. ביצוע שלב זה בחדר עם אוורור מעולה לצרף מסננים זבל isoflurane לתא אינדוקציה.
- הפץ את התאים הנושאים shRNAs. השתמש טטרציקלין ללא בינוני ט על וקטורים מושרה. Trypsinize את התאים resuspend אותם בינוני מלא המכיל 50% Matrigel. מקם את העכברים עירום על כרית חימום (30 ° C) להזריק 200 μl של תאים (1-10 × 10 6, תלוי גידול ממאיר של התאים) לעכברים עם 1-2 המוזרקים לכל עכבר. שימוש במזרקים עם 25.5-מד מחטים תת עורית זריקות ומחטים 28-30 מדד של זריקות orthotopic.
- עבור המכונן וקטורים shRNA, לנצל 2 קבוצות של עכברים שהוזרק עם התאים המבטאים את הגן היעד shRNA ו shRNA מקושקשות. עבור ט על וקטורים shRNA מושרה, לנצל 4 קבוצות של עכברים שהוזרק עם תאים הנושאים את הגן היעד shRNA ו shRNA מקושקשות, סיפקה מים רגיל DOX (1.5 מ"ג / מ"ל) המכיל מים (2 × 2 shRNAs טיפולים = 4 קבוצות) . להחליף את המים DOX המכילים פעמיים בשבוע.
- לפקח על אורך ורוחב של גידולים שבועי או דו שבועי על ידי vernier דיגיטלית קליפר ולחשב כמויות הגידול (V) על ידי הנוסחה V = 1/2 (אורך רוחב × 2) 10. להבטיח כי נפח הגידול אינו עולה על ההנחיות של ACUC המוסדי (כגון, 10% ממשקל הגוף). להרדים כל העכבר באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי ACUC מוסדי אם הוא מראה שום סימן של נמק נרחב או כיב, infectio ברורn, דימום בלתי נשלט או מחלה סופנית.
- הגידול גרורות ניתן לפקח על תאים סרטניים המבטאים מחוסן סמן bioluminescent 11, כגון בלוציפראז Firefly. נקו את כל משטחי העכבר של הרדמה והדמיה על ידי אתנול 70% על מנת למנוע זיהום של עכברים. להרדים את העכברים כפי שמתואר בשלב 4.1. להזריק luciferin (150 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally. מניחים את העכברים לתוך חדר הדמיה חיטוי של מערכת הדמיה מסחרית, כגון מערכת IVIS דימות (Caliper מדעי החיים, Inc). להפעיל את המנוף הרדמה כדי לשמור על ההרדמה על ידי% 1 isoflurane מעורבב עם חמצן. לבצע שלב זה בחדר עם אוורור מעולה.
- קחו את התמונה הראשונה על ידי חשיפת 5 דקות ולבדוק עוצמת האות שלה. כוון את זמן החשיפה כדי להשיג תמונות עם האות האופטימלי לעומת הרקע. קבע את הזמן דימות באופן אמפירי, אשר בדרך כלל 1-5 דקות של גידולים תת עורית.
- להרדים את העכברים על ידי פרוטוקול שאושרעל ידי ACUC המוסדי כאשר גדלים גידולים להגיע כ -1,000 מ"מ 3, או כפי שנקבע בהנחיות ACUC. הבלו גידולים xenograft, לשקול אותם לצלם. לעבד את דגימות הגידול של מחקרים שונים, כגון ניתוחים פתולוגיים כדי לקבוע מורפולוגיה תאים סרטניים, וכן כתם המערבי בזמן אמת לימודי ה-PCR לבדיקת ביטוי גנים.
5. נציג תוצאות
פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את ההשפעות של מציאה YY1 על היווצרות גידולים xenograft של גחלילית בלוציפראז-לבטא מד"א-MB-231 (תאים אנושיים אדנוקרצינומה בשד תאים, Caliper מדעי החיים) בעכברים עירום athymic. רצף היעד shRNA של YY1 האנושי "GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T". רצף מקושקשות "GGG ACT ACT CTA tta CGT CAT T" נוצר גם עבור (המשך) shRNA, אשר לא היה דמיון משמעותי תמליל כל הידוע. את oligonucleotides המשמשים לייצור ט ב בונה shRNA מושרה, עם YY1 כדוגמה, מוצגים בטבלה 1. כתוצאה מכך, שני וקטורים lentiviral, plu-Puro-Indu-YY1 shRNA ו-plu Puro-Indu-המשך shRNA, נבנו והם שימשו לייצור lentiviruses. היינו אלה lentiviruses בנפרד להדביק שתי מד"א-MB-231 שיבוטים תא (שיבוטים 1 ו -3) הביעו גם הרגולטור טטרציקלין (tetR) ו בלוציפראז Firefly. אוכלוסיות תאים Polyclonal התקבלו לאחר בחירת puromycin. איור 3 א מציג DOX הנגרמת YY1 מציאה אלה מד"א-MB-231 תאים נגועים על ידי plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. לאחר מכן השתמשו בתאי polyclonal של שיבוט 3 נגועים בנפרד על ידי אלה מושרה YY1 shRNA ואת המשך lentiviruses shRNA ו ציין כי YY1 דלדול מופחת הפולשנות של מד"א-MB-231 תאים (איור 3 ב). ניתוח המערב למחוק אישר DOX הנגרמת YY1 ההשתקה במד"א-MB-231 תאים עם shRNA indu-YY1, בעוד התאים המכילים indu-המשך shRNA לא הראו את האפקט הזה (איור 3 ג). היינו אז תאים אלה של המחקר העכבר xenograft המודל. לעומת קבוצות הביקורת, העכברים המושתלים על ידי מד"א-MB-231 תאים עם indu-YY1 shRNA וסיפקה מים DOX המכיל הראה היווצרות הגידול הקטינה, כאשר דמיינו ידי ביולומינציה (איור 4 א) ו - נקבע על ידי משקולות הגידול (איור 4B ). YY1 השתקת אלה גידולים xenograft אושר על ידי מחקרים כתם המערבי שמוצג באיור 4C.
באיור 1. תרשים סכמטי עבור הדור של מבנה shRNA והתעתיק shRNA. P1 primers כדי P6 מוצגים (ראה לוח 1 עבור רצפים למשל). Pol III: RNA פולימראז III (ד). בסוף מעוכל. הרישום הוא לא קנה מידה. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר .
2 "src =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
איור 2. תרשימים סכמטיים של וקטור () lentiviral ו (ב) מנגנון ט על מקדם מושרה H1 משמש להשתקת גנים. וקטור lentiviral שוחזר על פי pLL3.7 14. H1-PR: האמרגן H1, UBC-PR: האמרגן האדם היוביקוויטין C; Puro: puromycin: Tre: אלמנט טטרציקלין תגובה: DOX: דוקסיציקלין. TetR: הרגולטור טטרציקלין. 5'LTR, 3'SIN-LTR ו WRE הם מרכיבים חיוניים של 14 וקטור lentiviral.
איור 3. DOX הנגרמת YY1 ההשתקה והשפעתה על הפולשנות של מד"א-MB-231 תאים. א YY1 רמות שתי אוכלוסיות תאים polyclonal הנגזרות TetR-להביע שיבוטים 1 ו -3 נגועים על ידי plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus ותרבותיים בהעדר נוכחות של DOX. ב בוידן קאמרית assay של מד"א-MB-231 תאים עם shRNAs מושרה. (* P <0.05 לעומת שלוש הקבוצות האחרות). ג נציג המערב כתמים של הביטוי YY1 אלה אוכלוסיות תאים ארבע.
באיור 4. ההשפעות של השתקה YY1 הנגרמת על היווצרות גידולים xenograft ידי מד"א-MB-231 תאים. א Schematic דיאגרמה של השתלת תאים (משמאל) תמונות bioluminescent נציג שנתפסו על ידי מערכת הדמיה IVIS ב 4 שבועות (מימין) תא חיסון הודעה. ב Xenograft משקולות הגידול ב 4 שבועות. * P ≤ 0.05. ג מערביות כתמים של YY1 ו β-אקטין ביטוי ב xenografts של מד"א-MB-231 תאים עם indu-YY1 shRNA בהעדר נוכחות של DOX. תוויות על גבי שמות של עכברים בודדים.
| Oligonucleotide | רצף (5 '- 3 ") | השימוש ומיקומו |
| P1 (ט ב ח1) | cagt GGATCC CGA ACG CTG ACG TCA TCA ACC C | PCR, בסוף 5'-של האמרגן H1 |
| P1 (U6) | cagt GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG | PCR, בסוף 5'-של האמרגן U6 |
| P2 (עבור YY1 עם ט ב H1) | cagc AAGCTT GAA ATC tgc ACC tgc TTC tgc TCC ג GGG ATC ATC TCT ACT גת AGG GAA C | PCR, בסוף-3'של האמרגן ט ב H1 מושרה |
| P2 (עבור YY1 עם U6) | cagc AAGCTT GAA ATC tgc ACC tgc TTC tgc TCC ג AAA Caa ggc TTT TCT המרכז לאמנות עכשווית agg גת | PCR, בסוף-3'של האמרגן U6 |
| P3 (עבור YY1) | AGC TT ATC tgc ACC tgc TTC tgc TCC ג ttttt גרם | להיות מרותק עם P4 |
| P4 (עבור YY1) | aattc aaaaa | להיות מרותק עם P3 | |
| P5 (עבור pLL3.7) | GGG טק AGT gca GGG GAA אגא אתא g | לסינון PCR, בשימוש עם P6 |
| P6 (עבור ט ב H1) | גת TTC המרכז לאמנות עכשווית GAA CAC ATA GCG AC | לסינון PCR, בשימוש עם P5 |
| P6 (עבור U6) | AGG GTG AGT TTC CTT TTG TGC TG | לסינון PCR, בשימוש עם P5 |
טבלה 1. Oligonucleotides מסונתז המשמשים ליצירת מבנים shRNA. P1 ו רצפים P6 עבור U6 עכבר ט על אדם מושרה מקדמי H1 מסופקים. YY1 האדם משמש כדוגמה עם רצף מטרה shRNA של GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA ט רצפים ספציפיים YY1 מודגשים. שני רצפים-P2 של YY1 מיועדים שני היזמים, בהתאמה. U6 מכוננת / YY1 shRNA תוארה בעבר 15, בעוד ט ב H1/YY1 נעשה שימוש בפרוטוקול זה. P5 הוא וקטור ספציפי את רצף עבור pLL3.7 14 מוצג. הרצפים של אנזימי הגבלה הם קו תחתי, ואילו רצפים כדי לחשל את היזמים במהלך הגברה PCR הם המודגש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה להפיל הגן באמצעות shRNA ולדמיין ההשפעה הביולוגית שלה באמצעות הדמיה bioluminescent גידול תאים סרטניים in vivo. אתר היעד של shRNA לא יכילו כל אחד משלושת אתרי הגבלה (BamHI, HindIII ו EcoRI) משמש עבור subcloning. בתרחיש נדיר כאשר כל אחד מהאתרים הללו קיים, אנזים הגבלה נוספת שניתן להשתמש בהם כדי להחליף אותו ביצירת מבנה.
צעדים מרכזיים בפרוטוקול זה תאיץ את בניית וקטורים lentiviral shRNA. ראשית, את תבנית ה-PCR פלסמיד המכיל את U6 או האמרגן H1 יכול להיות גנטי שונה עמידות לאנטיביוטיקה (כגון kanamycin) מ וקטור lentiviral (בדרך כלל אמפיצילין). זה יכול להקטין את הרקע של שינוי נגרם על ידי תבנית פלסמיד. שנית, יש צורך להשתמש א המוסמכת קולי תאים עם יעילות גבוהה של טרנספורמציה. פרוטוקול באמצעות אשלגןיונים nd מנגן יכול לשמש לייצור א המוסמכת קולי תאים עם יכולות גבוהות מאוד 12. שלישית, סמן לבחירה יכול להקל על subcloning 3-שבר. לדוגמה, וקטור lentiviral יכול להיות מהונדסים להכיל קלטת ביטוי galactosidase-β (LacZ) כי יוחלף הכניסה של שבר PCR ו מרותק P3/P4 oligonucleotides. במקרה זה, פלסמידים רקומביננטי עם מוסיפה את יהוו מושבות לבנות, בעוד אלה ללא מוסיף יהיו כחול, כאשר הם נחשפים X-gal (5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside) .
איכות וקטורים lentiviral ושלושת פלסמידים אריזה חיוני לייצור lentivirus יעיל. השיטה הכלכלית transfection מאוד ויעיל באמצעות פוספט משקעים סידן סופק. Polyethylenimine 13 או מסחריים ביותר ריאגנטים transfection יכול לשמש גם לייצור lentivirus. כדי להשתמש נכון משרד הפנים FOזיהום R, חשוב לקבוע את titers של lentivirus מיוצר.
עכברים של כל קבוצות הניסוי יש שוכנו בחדר אחד כדי לחסל את ההבדל קצב היממה שלהם שעלולה לגרום וריאציה של ביולומינציה במהלך הדמיה הגידול xenograft. גישות של המתת חסד העכבר כולל 2 CO מחנק ועל מנת יתר של isofluorane וצריך להיות מאושר על ידי ACUC המוסדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי מחקר המלומדת (116403-RSG-09-082-01-MgO) של האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן וקופות המיפוי של אוניברסיטת Wake Forest למדעי הבריאות ל GS. DBS נתמך על ידי NCI אימון מענק 5T32CA079448.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol. | |||
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment | |||
| PCR thermocycler | |||
| Ultracentrifuge | |||
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers | |||
| Digital Vernier caliper | |||
| IVIS imaging system | |||
| Highly competent DH5a E. coli | |||
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes | |||
| T4 DNA Ligase | |||
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE | |||
| Materials List | |||
References
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , Forthcoming (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
