الحمض النووي الريبي التدخل ناقلات القائم على دراسة وظيفة الجينات في سرطان

Summary

تدخل الجيش الملكي النيبالي (رني) تمتلك مزايا عديدة أكثر من خروج المغلوب الجينات، واستخدمت على نطاق واسع باعتبارها أداة في دراسات الجينات الوظيفية. جعلت من اختراع تكنولوجيا الحمض النووي رني ناقلات القائم على المدى الطويل، ومحرض ضربة قاضية الجين ممكن، وزادت أيضا في جدوى إسكات الجينات

Abstract

تدخل الجيش الملكي النيبالي (رني) يحول دون التعبير الجيني من قبل mRNAs الهدف المهينة على وجه التحديد. منذ اكتشاف المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) في إسكات الجينات ^1، وأصبح رني أداة بحث قوية في الدراسات وظيفة الجين. بالمقارنة مع حذف الجينية، [رني بوساطة إسكات الجينات تمتلك العديد من المزايا، مثل السهولة التي تتم فيها ومدى ملاءمتها لمعظم خطوط الخلية. وقد أظهرت دراسات متعددة في تطبيقات تكنولوجيا رني في أبحاث السرطان. على وجه الخصوص، جعلت تطوير تكنولوجيا مكافحة ناقلات القائم على الحمض النووي الريبي لانتاج صغير دبوس الشعر (shRNA) مدفوعا U6 أو مروج H1 على المدى الطويل والجينات محرض إسكات ^2،3 ممكن. استخدامه في تركيبة مع النواقل الفيروسية وراثيا، مثل الفيروسة البطيئة، تسهل الكفاءة العالية للتسليم shRNA و / أو الاندماج في الحمض النووي الجيني للتعبير shRNA مستقر.

نحن تصف detaileد الإجراء باستخدام تكنولوجيا الحمض النووي رني ناقلات القائم على تحديد وظيفة الجينات، بما في ذلك بناء ناقلات lentiviral معربا عن shRNA، وإنتاج الفيروسة البطيئة وإصابة الخلية، والدراسات الفنية باستخدام نموذج الفأر طعم أجنبي.

تم الإبلاغ عن الاستراتيجيات المختلفة في توليد بنيات shRNA. وصف بروتوكول هنا توظيف تضخيم PCR وربط 3-شظية يمكن استخدامها لمباشرة وكفاءة توليد shRNA التي تحتوي على ثوابت lentiviral دون أن تترك أي المتاخمة اضافية النوكليوتيدات لتسلسل shRNA الترميز. حيث يمكن خفض الكاسيت shRNA التعبير عن هذه الاستراتيجية التي أنشأتها من قبل إنزيمات التقييد، ويمكن بسهولة انتقلوا إلى ناقلات أخرى مع مختلف علامات الفلورسنت أو المضادات الحيوية. ويمكن استخدام الكواشف ترنسفكأيشن معظم الإنتاج التجاري في الفيروسة البطيئة. ومع ذلك، في هذا التقرير، ونحن نقدم وسيلة اقتصادية باستخدام الكالسيوم فوسفات هطول الأمطار التي يمكن أن تحقق أكثر من 90٪ في كفاءة ترنسفكأيشن293T الخلايا. مقارنة التأسيسي ناقلات التعبير shRNA، نظام shRNA محرض هو مناسبة خاصة لاسقاط الجين ضروري لتكاثر الخلايا. علينا أن نبرهن على إسكات الجينات من يانغ يين 1 (YY1)، وهو الجين الورمي المحتملة في الاصابة بسرطان الثدي ^4،5، من تيت، وعلى نظام shRNA محرض وآثارها على تكوين ورم. بحث باستخدام الفيروسة البطيئة يتطلب مراجعة والموافقة على بروتوكول السلامة الاحيائية من قبل لجنة السلامة من مؤسسة الباحث. بحث باستخدام نماذج حيوانية يتطلب مراجعة والموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام (ACUC) من مؤسسة الباحث.

Protocol

1. جيل بنيات shRNA

1. تحديد تسلسل سيرنا المستهدفة (20-23 النيوكليوتيدات) بناء على معايير سبق نشرها ⁽⁶⁾ او استخدام ملقم الخوارزمية على شبكة الإنترنت، مثل "سيرنا الباحث عن الهدف" من Ambion وGenScript.
2. توليف [أليغنوكليوتيد] بناء على تصميم متواليات الشكل 1 والمثال في الجدول رقم 1. تنفيذ تضخيم PCR باستخدام P1 و P2 [أليغنوكليوتيد] (30 دورات من تبديل طبيعة في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، الصلب عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والتطويل في 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) وبلازميد يحمل U6 أو H1 مروج كقالب. تنقية منتج PCR باستخدام عمود تنقية PCR. هضمه من قبل BamHI وHindIII وتنقية الحمض النووي يهضم باستخدام عمود تنقية PCR. يصلب [أليغنوكليوتيد] P3 و P4 (2.5 بمول / ميكرولتر من كل في 100 ميكروليتر من تريس 50 ملم • حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0) بواسطة الغلي لمدة 5 دقائق وتبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. هضم مركزنا lentiviralتور، مثل تلك التي وصفها في الشكل 2A، بواسطة BamHI وEcoRI، وأداء هلام تنقية.
3. إجراء عملية ربط 3-شظية مع ناقلات EcoRI هضمها BamHI /، وهو جزء PCR BamHI / HindIII-هضمها وزوج واحد من صلب [أليغنوكليوتيد] (تشكيل HindIII ومواقع EcoRI على طرفي) في نسبة 01:10:10 المولي (الشكل 1).
4. تحويل E. المختصة ذات كفاءة عالية خلايا القولونية DH5α استخدام المنتج ligated. فحص المستعمرات باستخدام [أليغنوكليوتيد] P5 (في ناقلات) وP6 (في مروج H1 أو U6) ⁷
5. إعداد البلازميد من المستعمرات إيجابي مع مجموعة تجارية وتأكيد وجود إدراج بواسطة BamHI / EcoRI الهضم والحمض النووي الكهربائي الاغاروز. تسلسل هذه المنطقة التي تحتوي على المروج وshRNA باستخدام P5 قليل النوكليوتيد.
6. استخدام البلازميد الحمض النووي ميدي أو ماكسي إعداد مجموعات (الذيفان الداخلي خالية من يفضل) لتحضير الحمض النووي الفيروسة البطيئة تحمل التعبير shRNAكاسيت. تحديد تركيز الحمض النووي عن طريق قياس الامتصاص في 260 نانومتر. التحقق من نقاء الحمض النووي باستخدام نسبة 260 نانومتر nm/280 والتأكد من أنها تقع في نطاق بين 1.8 و 2.0. تحقق من سلامة الفيروسة البطيئة البلازميد باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام. وينبغي أن الحمض النووي لترنسفكأيشن تكون فائقة ملفوف.

2. الفيروسة البطيئة ترنسفكأيشن

الاحتياطات: وتستمد ناقلات Lentiviral من فيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1) العوامل الوراثية والتكرار غير كفء. وقد استخدموا على نطاق واسع في توصيل الجينات نظرا لقدرة من اصابة كل من تقسيم لا تنقسم فيها الخلايا. ومع ذلك، واثنين من المخاطر الكبرى موجودة في دراسات باستخدام الفيروسة البطيئة. (1) إن إمكانات جيل من تكرارها، المختصة الفيروسة البطيئة. ويمكن هذا خطر تقلص إلى حد كبير إذا تم استخدام نظام الجيل الثالث lentiviral. (2) إن إمكانات oncogenesis. يمكن أن تتفاقم هذه المخاطر إذا كان إدراج قامت هي أنكجنيك أو قمع المكثفات ورم.وينبغي لأنشطة البحوث المشاركة في فيروس نقص المناعة البشرية على أساس اتباع الفيروسة البطيئة "اعتبارات السلامة للبحوث مع الموجهات Lentiviral" من المعاهد الوطنية للصحة ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html )، وتتطلب الحصول على موافقة من لجنة السلامة الأحيائية من مؤسسة الباحث. عموما، وتعزيز السلامة على مستوى 2 (BSL-2) مطلوب الاحتواء من أجل إعداد مختبر في حال استخدام ناقلات lentiviral.

1. لوحة 4 × 10 ⁶ كلوة الجنين البشري 293T مع الخلايا المتوسطة DMEM كاملة (DMEM مزودة المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، 2 مم الجلوتامين، 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) في أطباق 10 سم والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO _2. استبدال المتوسطة مع 5 مل من قبل غروب حرارة-MEM أنا انخفاض المصل وسائل الاعلام (إينفيتروجن).
2. إعداد الحل: 10 ميكروغرام من shRNA المحتوية على ناقلات lentiviral، 5 ميكروغرام لكل من خينير 3البلازميدات أوجه التعبئة والتغليف الفيروسة البطيئة (أعدت مع نقاء عالية، والبلازميدات التعبئة والتغليف وتشمل VSV 3-G: للحصول على البروتين المغلف، pRSV-القس: لتزيد السرعة، وpMDLg / pRRE: لهفوة / بول، وهما أمران أساسيان لتعبئة الفيروسة البطيئة)، 36 ميكرولتر من 2M CaCl _2، و 300 ميكرو لتر من الماء المعقم.
3. إعداد ب الحل: 300 ميكرولتر من Hepes × 2 مخزنة المالحة (281 ملم كلوريد الصوديوم، و 100 HEPES مم، 1.5 مم نا ₂ هبو _4، ودرجة الحموضة تعديلها ل7.12 بواسطة هيدروكسيد الصوديوم N 0.5 و معقم بنسبة 0.22 ميكرون فلتر).
4. إسقاط ببطء إلى حل B الحل بينما فقاعات الهواء من خلال B الحل مع ماصة. ترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
5. إسقاط ببطء الحلول المختلطة A / B في صحن 293T كلوة الجنين البشري ثقافة خلية أعدت في الخطوة 2.1 واحتضان على 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO ₂ لمدة 4-6 ساعات.
6. استبدال المتوسطة مع 7 مل من المتوسط ​​DMEM كاملة. بعد 24 ساعة، إضافة إضافية 5 مل من المتوسط ​​DMEM كاملة. حصاد تابع المتوسطةaining الفيروسة البطيئة وبعد 24 ساعة أخرى للثقافة.
7. وتدور في المتوسط ​​في 1500 دورة في الدقيقة، درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تصفية طاف باستخدام فلتر ميكرون 0.45 وتدور التدفق من خلال المتوسطة التي تحتوي على الفيروسة البطيئة من قبل تنبيذ فائق في 25000 دورة في الدقيقة (ما يعادل 125000 ز × مع الدوار SW28 الدلو المتأرجح، بيكمان منبذة فائقة XL-90)، و 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. صب وطاف على وعاء مع مبيض 5٪ (تركيز النهائي).
8. Resuspend وبيليه الفيروسة البطيئة في 0،5-1،0 مل من برنامج تلفزيوني الباردة وجعل aliquots الفيروسة البطيئة إلى 50-100 ميكرولتر لكل أنبوب. تخزينها في -80 درجة مئوية.
9. يمكن تحديد عيار من الفيروسة البطيئة من قبل مجموعات تجارية (مثل QuickTiter الفيروسة البطيئة كيت تحديد الكميات من Biolabs الخليوي، وشركة)، بواسطة بروتوكول PCR الوقت الحقيقي ^8، أو من خلال تحديد علامة المشترك وأعرب فلوري باستخدام المجهر مضان أو التدفق الخلوي . عادة، يمكن للمرء أن ثقافة طبق 10 سم، وتنتج نحو 0،5-1،0 × 10 ⁸ العدوىtious وحدة (وحدة دولية).

3. إصابة وتوصيف من الخلايا المصابة

1. بذور الخلايا للإصابة في 2 مل من المتوسط ​​الكاملة في لوحة 6 جيدا مع confluency 30-40٪ (حوالي 5-8 × 10 ⁵ خلايا، اعتمادا على حجم الخلية). ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO _2.
2. استبدال المتوسطة مع 1 مل من المتوسط ​​الطازجة التي تحتوي على 8 ميكروغرام / مل من polybrene (سيغما، القط # H9268) أو 5 ميكروغرام / مل من بروتامين (سيغما، القط # P4020).
3. تحديد عدد وافر مناسبة للعدوى (وزارة الداخلية) النطاق ⁹ للحصول على خط خلية معينة باستخدام الفيروسة البطيئة مع علامة فلوري. حساب أو تحديد تجريبيا كمية الفيروسة البطيئة ليتم استخدامها لتصيب خط الخلية. إسقاط ببطء الفيروسة البطيئة في لوحة ويهز بلطف لمدة 10 ثانية.
4. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ₂ 5٪ لمدة 6 ساعات ثم استبدال المتوسطة مع المتوسطة كاملة طبيعي.
5. اثنين على الاقل من داYS بعد الإصابة، والتحقق من الخلايا باستخدام المجهر مضان لالفيروسة البطيئة معربا عن علامات الفلورسنت و / أو إضافة المضادات الحيوية المقابلة للمتوسط ​​لناقلات lentiviral التعبير عن الجينات المقاومة للمضادات الحيوية. للحصول على ناقلات محرض، مثل تيت، على نظام الثقافة، (الشكل 2) الخلايا في المتوسط ​​على استعداد مع التتراسيكلين خالية FBS. انقسام الخلايا 2-3 إصابة آخر أيام. أخذ جزء من الخلايا لاختبار محرض ضربة قاضية الجين بواسطة زراعة منهم في المتوسط ​​الموردة مع وبدون 1.5 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين (دوكس) ليوم 2 ≥.
6. فحص الجينات ضربة قاضية من قبل لطخة غربية، PCR في الوقت الحقيقي أو المناعية ≥ 2 أيام بعد الإصابة، 2 بعد أيام من اختيار المضادات الحيوية، أو (لنظام محرض تيت أون) ≥ 2 أيام بعد إضافة دوكس.
7. استخدام أساليب مختلفة (مثل فحوصات تكاثر الخلايا، لينة دراسات ثقافة أجار، المقايسات والهجرة، والمقايسات الغزو ودراسات تشكيل ورم) لتحديد الآثار المترتبة على الهدف KN الجينockdown على الورم الخبيث للخلايا.

4. طعم أجنبي دراسة نموذج الفأر

1. تنظيف جميع الأسطح لتخدير الماوس وحقن بواسطة الايثانول 70٪ للوقاية من العدوى من الفئران. تخدير الفئران عارية athymic (NCI-فريدريك) باستخدام 2٪ isoflurane مختلطة مع الأوكسجين في دقيقة تحريض التخدير 10 غرفة قبل تلقيح الخلية. الحفاظ على التخدير باستخدام 1٪ isoflurane مختلطة مع الأكسجين من خلال مخروط الأنف. تنفيذ هذه الخطوة في غرفة ذات تهوية ممتازة ونعلق المرشحات زبال isoflurane إلى دائرة تحريض.
2. نشر خلايا تحمل shRNAs. استخدام التتراسيكلين خالية من المتوسط ​​لتيت، على ناقلات محرض. يعرض للتريبسين الخلايا وresuspend منهم في المتوسط ​​كاملة تحتوي على Matrigel 50٪. وضع الفئران عارية على وسادة التدفئة (30 درجة مئوية)، وأن تضخ 200 ميكروليتر من الخلايا (1-10 × 10 ^6، اعتمادا على الورم الخبيث للخلايا) في الفئران مع مواقع حقن 1-2 في الماوس. استخدام الحقن مع 25.5-مقياس إبر للحقن تحت الجلد، والإبر قياس 28-30 للحقن orthotopic.
3. لنواقل shRNA التأسيسية، واستخدام مجموعات 2 من حقن الفئران مع خلايا التعبير عن الهدف shRNA الجينات وshRNA سارعت. لتيت، على ناقلات shRNA محرض، واستخدام 4 مجموعات من الفئران حقنها بخلايا تحمل الهدف shRNA الجينات وshRNA سارعت، المزودة بالمياه العادية ودوكس (1.5 ملغ / مل) التي تحتوي على ماء (2 shRNAs × 2 = 4 العلاجات مجموعات) . استبدال المياه دوكس المحتوية على مرتين في الأسبوع.
4. رصد الطول والعرض للأورام الأسبوعية أو كل أسبوعين من قبل الفرجار رنيه الرقمية وحساب كميات ورم (V) من قبل الخامس الصيغة = 1/2 (طول × عرض ^{2) 10.} تأكد من أن حجم الورم لا يتجاوز الخطوط العريضة لACUC المؤسسية (مثل، 10٪ من وزن الجسم). الموت ببطء أي فأر باستخدام بروتوكول التي وافق عليها ACUC المؤسسية إذا كان يظهر أي علامة من تقرح واسعة النطاق أو نخر، infectio واضحن، والنزيف غير المنضبط أو المرض في نهاية المرحلة.
5. يمكن مراقبة نمو الورم والانبثاث لخلايا الورم تلقيح معربا عن علامة bioluminescent ^11، مثل luciferase المراسل اليراع. تنظيف جميع الأسطح لتخدير الماوس والتصوير بواسطة الايثانول 70٪ للوقاية من العدوى من الفئران. تخدير الفئران كما هو موضح في الخطوة 4.1. حقن luciferin (150 ملغ / كلغ) intraperitoneally. وضع الفئران في غرفة التصوير تطهيرها من نظام التصوير التجاري، مثل نظام التصوير IVIS (الفرجار علوم الحياة، وشركة). تشغيل رافعة للحفاظ على التخدير التخدير بنسبة 1٪ isoflurane مختلطة مع الأوكسجين. إجراء هذه الخطوة في غرفة ذات تهوية ممتازة.
6. أخذ الصورة الأولى من خلال تعريض 5 دقائق والتحقق من شدته إشارة. ضبط الوقت من التعرض للحصول على صور مع إشارة الأمثل مقابل الخلفية. تحديد وقت التصوير تجريبيا، والذي هو عادة 1-5 دقيقة للأورام تحت الجلد.
7. الموت ببطء الفئران التي وافقت على بروتوكولمن ACUC المؤسسية عندما أحجام ورم تصل إلى نحو 1000 مم ^3، أو كما هو محدد في المبادئ التوجيهية ACUC. استئصال أورام طعم أجنبي، وزن لهم والتقاط الصور. معالجة عينات من ورم لدراسات مختلفة، مثل التحليلات المرضية لتحديد ورم مورفولوجيا الخلية، والغربية وصمة عار في الوقت الحقيقي ودراسات لاختبار PCR التعبير الجيني.

5. ممثل النتائج

وقد استخدم هذا البروتوكول على دراسة آثار YY1 ضربة قاضية في تشكيل الورم من الخلايا طعم أجنبي اليراع MDA-MB-231 luciferase المراسل في التعبير عن (خلايا غدية الثدي؛ الفرجار علوم الحياة) في الفئران عارية athymic. تسلسل الهدف shRNA من YY1 الإنسان هو "GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T". تسلسل سارعت "GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T" تم إنشاؤه أيضا لسيطرة (تابع) shRNA، الذي لم يكن لديها تشابه كبير إلى أي نص معروف. [أليغنوكليوتيد] والتي استخدمت لصنع تيت على اساس ثوابت shRNA محرض، مع YY1 كمثال، مبينة في الجدول رقم 1. ونتيجة لذلك، تم بناء متجهين lentiviral، PLU-بورو، ايندو، YY1 shRNA وshRNA PLU-بورو، ايندو، تابع، وكانت تستخدم لإنتاج lentiviruses. استخدمنا هذه lentiviruses لتصيب بشكل فردي 2 استنساخ خلية MDA-MB-231 (استنساخ 1 و 3) على حد سواء معربا عن منظم التتراسيكلين (tetR) وluciferase المراسل اليراع. وقد تم الحصول على السكان الخلية بولكلونل بعد اختيار بوروميسين. 3A ويبين الشكل دوكس التي يسببها YY1 ضربة قاضية في هذه الخلايا MDA-MB-231 إصابة قبل الفيروسة البطيئة shRNA PLU-بورو، ايندو، YY1. كنا ثم الخلايا بولكلونل من استنساخ 3 المصابين بشكل فردي عن طريق هذه محرض YY1 shRNA وlentiviruses تابع shRNA ولاحظ أن YY1 نضوب خفض الغازية من MDA-MB-231 الخلايا (الشكل 3B). وأكد تحليل لطخة غربية دوكس التي يسببها YY1 إسكات في MDA-MB 231-الخلايا التي تحتوي على shRNA ايندو-YY1، في حين أن الخلايا التي تحتوي على ايندو، تابع shRNA لم يظهر هذا التأثير (الشكل 3C). كنا ثم هذه الخلايا لدراسة نموذج الفأر طعم أجنبي. وأظهرت الفئران التي تقيمها الخلايا MDA-MB-231-مع ايندو YY1 shRNA والموردة مع دوكس المحتوية على المياه بالمقارنة مع مجموعات المراقبة، وتكوين الورم يؤدي إلى انخفاض وعندما تصور من قبل تلألؤ بيولوجي (الشكل 4A) والتي يحددها الأوزان ورم (الشكل 4B ). وأكد YY1 في إسكات هذه الأورام طعم أجنبي من الدراسات الغربية وصمة عار هو مبين في الشكل 4C.

الشكل 1. ويبين الرسم التخطيطي لتوليد تأنشا shRNA والنسخ shRNA. وP1 الاشعال إلى P6 (انظر الجدول رقم 1 لمتواليات سبيل المثال). بول الثالث: الحمض النووي الريبي الثالث بوليميريز (د):. نهاية هضمها. الرسم ليس على نطاق واسع. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر .

2 "SRC =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
الشكل 2. التخطيطي الرسوم البيانية من ناقلات (A) lentiviral و (ب) آلية تيت، على مروج H1 محرض تستخدم لإسكات الجينات. أعيد بناء ناقلات lentiviral استنادا pLL3.7 ^14. H1-PR: H1 المروج؛ UBC-PR: الإنسان المروج C ubiquitin؛ بورو: بوروميسين؛ TRE: التتراسايكلين استجابة عنصر؛ دوكس: الدوكسيسيكلين. TetR: منظم التتراسيكلين. 5'LTR، 3'SIN-LTR وWRE هي المكونات الأساسية لمدة ¹⁴ ناقلات lentiviral.

الشكل 3. دوكس التي يسببها YY1 إسكات وتأثيره على الخلايا الغازية-MB-231 نجمة داود الحمراء. A. YY1 مستويات في اثنين من السكان الخلايا المشتقة من بولكلونل TetR في التعبير عن استنساخ 1 و 3 من المصابين الفيروسة البطيئة shRNA PLU-بورو، ايندو، YY1 وتربيتها في غياب وجود دوكس. B. فحص غرفة بويدن من MDA-MB 231-الخلايا مع shRNAs محرض. (* P <00.05 مقابل المجموعات الثلاث الأخرى). الممثل جيم البقع الغربية من YY1 التعبير في هذه التجمعات السكانية الخلية الأربعة.

الشكل 4. آثار إسكات YY1 الناجم عن تشكيل ورم طعم أجنبي بواسطة MDA-MB-231 الخلايا. ألف رسم تخطيطي من زرع خلية (يسار) وممثل bioluminescent الصور الملتقطة بواسطة نظام التصوير IVIS في 4 أسابيع (يمين) آخر تلقيح الخلية. الأوزان باء ورم طعم أجنبي في 4 أسابيع. * P ≤ 0.05. جيم الغربية البقع من YY1 و β-الأكتين التعبير في xenografts من MDA-MB-231-الخلايا مع ايندو YY1 shRNA في حال عدم وجود دوكس. علامات على الجزء العلوي هي أسماء من الفئران الفردية.

قليل النوكليوتيد	تسلسل (5 '- 3')	الاستخدام والموقع
P1 (تيت، على H1)	cagt GGATCC CGA ACG ACG CTG TCA TCA ACC C	PCR، في نهاية 5'من المروج H1
P1 (U6)	cagt GGATCC GAC دول مجلس التعاون الخليجي دول مجلس التعاون الخليجي ATC TCT AGG	PCR، في نهاية 5'من المروج U6
P2 (لYY1 مع تيت، على H1)	cagc AAGCTT غا ATC TGC ACC TGC TGC TTC TCC ج ج ج ج ATC ATC TCT ACT GAT AGG غا C	PCR، في نهاية 3'من المروج محرض H1 تيت، على
P2 (لYY1 مع U6)	cagc AAGCTT غا ATC TGC ACC TGC TGC TTC TCC ج AAA الجهاز المركزي للمحاسبات GGC TTT تكت CCA AGG جات 1	PCR، في نهاية 3'من المروج U6
P3 (لYY1)	AGC TT ATC TGC ACC TGC TGC TTC TCC ج ز ttttt	أن مطوع مع P4
P4 (لYY1)	aattc AAAAA	أن مطوع مع P3
P5 (لpLL3.7)	GGG معاهدة الصداقة والتعاون AGT GCA GGG غا الآغا ATA ز	لفحص PCR، وتستخدم مع P6
P6 (لتيت، على H1)	TTC GAT CCA غا كاك ATA GCG AC	لفحص PCR، وتستخدم مع P5
P6 (لU6)	AGG GTG AGT TTC CTT TTG TGC TG	لفحص PCR، وتستخدم مع P5

الجدول رقم 1. وتقدم [أليغنوكليوتيد] توليفها المستخدمة في توليد بنيات shRNA. P1 وتسلسل P6 لU6 الماوس وتيت، على المروجين محرض H1 الإنسان. ويستخدم YY1 الإنسان كمثال مع تسلسل الهدف shRNA من AGA GGG AGC AGC AGG T. AGA TGC ويسلط الضوء على تسلسل محدد لYY1. تم تصميم متواليات P2 اثنين من YY1 للمروجين اثنين، على التوالي. وU6 التأسيسية / Yوقد وصفت Y1 shRNA سابقا ^15، في حين أن تيت، على H1/YY1 تم استخدامه في هذا البروتوكول. P5 هي ناقلات معينة وتسلسل لpLL3.7 هو مبين ^14. وشدد على متواليات من الانزيمات قيود، في حين أن متواليات ليصلب على المروجين خلال تضخيم PCR المائل و.

Discussion

هذا البروتوكول وصفا لطريقة لاسقاط الجين باستخدام shRNA ووضع تصور لتأثيره البيولوجية باستخدام التصوير bioluminescent من نمو الخلايا السرطانية في الجسم الحي. الموقع هدفا لshRNA يجب أن لا تحتوي على أي من مواقع تقييد الثلاثة (BamHI، HindIII وEcoRI) المستخدمة لsubcloning. في سيناريو نادر عند أي من هذه المواقع موجودة، ويمكن استخدام انزيم قيود إضافية ليحل محله في توليد بناء.

والخطوات الرئيسية عدة في هذا البروتوكول تسريع بناء ناقلات shRNA lentiviral. أولا، قد القالب PCR البلازميد الذي يحتوي على U6 أو مروج H1 لها مختلف الجينات المقاومة للمضادات الحيوية (مثل الكانامايسين) من ناقلات lentiviral (عادة أمبيسلين). وهذا يمكن أن تقلل من خلفية التحول الناجم عن قالب البلازميد. ثانيا، من الضروري استخدام هاء المختصة خلايا بكتيريا مع كفاءات عالية من التحول. بروتوكول باستخدام البوتاسيوم 1ويمكن استخدام أيونات المنغنيز الثانية لانتاج E. المختصة خلايا بكتيريا مع كفاءات عالية جدا ^12. ثالثا، يمكن للعلامة اختيار تسهيل subcloning 3-شظية. على سبيل المثال، يمكن هندستها متجه lentiviral لاحتواء كاسيت التعبير عن غالاكتوزيداز-β (LacZ) الذي سيحل محله ادراج جزء PCR ومطوع P3/P4 [أليغنوكليوتيد]. في هذه الحالة، سوف البلازميدات المؤتلف مع إدراج تشكيل مستعمرات بيضاء، في حين أن هذه من دون إدراج ستكون زرقاء، عندما تتعرض لX-غال (5-برومو-4-كلورو-3-indolyl بيتا-D-اللبن pyranoside) .

نوعية ناقلات lentiviral والتعبئة والتغليف البلازميدات الثلاثة هو ضروري لإنتاج الفيروسة البطيئة فعالة. وقدمت طريقة ترنسفكأيشن الاقتصادية وفعالة جدا باستخدام الكالسيوم فوسفات هطول الأمطار. ويمكن أيضا الكواشف ترنسفكأيشن Polyethylenimine ¹³ أو تجارية أكثر يمكن استخدامها في إنتاج الفيروسة البطيئة. لاستخدام السليم وزارة الداخلية FOص العدوى، فمن المهم لتحديد التتر من الفيروسة البطيئة المنتجة.

وينبغي أن يضم الفئران من جميع المجموعات التجريبية في غرفة واحدة للقضاء على الاختلاف بين كل إيقاع الساعة البيولوجية التي قد تسبب الاختلاف من التألق الحيوي أثناء التصوير ورم طعم أجنبي. النهج من القتل الرحيم الماوس تشمل CO ₂ اختناق وجرعة زائدة من قبل isofluorane، وينبغي أن وافق عليها ACUC المؤسسية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment
PCR thermocycler
Ultracentrifuge
Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers
Digital Vernier caliper
IVIS imaging system
Highly competent DH5a E. coli
EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes
T4 DNA Ligase
Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE
Materials List