Summary
RNA-interferens (RNAi) har mange fordele i forhold til gen-knockout og er bredt anvendt som et redskab i gen funktionelle undersøgelser. Opfindelsen af DNA-vektor baseret RNAi teknologi har gjort lang sigt og inducerbare gen knockdown muligt, og også øget muligheden for gen-nedregulering
Abstract
RNA-interferens (RNAi) hæmmer genekspression ved specifikt at nedbryde target mRNA. Siden opdagelsen af dobbeltstrenget lille interferens RNA (siRNA) i gen-nedregulering 1 har RNAi blevet et stærkt forskningsværktøj i genfunktion undersøgelser. Sammenlignet med genetisk deletion har RNAi-medieret gen-nedregulering mange fordele, såsom lethed, hvormed den er udført og dets egnethed til de fleste cellelinjer. Flere undersøgelser har påvist anvendelser af RNAi teknologi i kræftforskning. Navnlig har udviklingen af DNA-vektor-baseret teknologi til at producere små hårnålen RNA (shRNA) drevet af U6 eller H1 promotor fremstillet langvarig og inducerbare gen-nedregulering muligt 2,3. Dets anvendelse i kombination med gensplejsede virusvektorer, såsom lentivirus, letter høje virkningsgrader af shRNA levering og / eller integration i genomisk DNA for stabil shRNA ekspression.
Beskriver vi en detailed under anvendelse af DNA-vektoren er baseret RNAi teknologi til at bestemme genfunktion, herunder konstruktion af lentivirale vektorer, der udtrykker shRNA, lentivirus produktion og celleinfektion, og funktionelle undersøgelser under anvendelse af en muse-xenotransplantat-model.
Forskellige strategier er blevet rapporteret at generere shRNA konstruktioner. Protokollen beskrevet her anvender PCR-amplifikation og en 3-fragment-ligering kan anvendes til direkte og effektivt at generere shRNA indeholdende lentivirale konstruktioner uden at efterlade nogen ekstra nukleotid støder op til en shRNA kodende sekvens. Idet shRNA-ekspressionskassetterne er skabt af denne strategi kan skæres ud af restriktionsenzymer, kan de let flyttes til andre vektorer med forskellige fluorescerende eller antibiotiske markører. De fleste kommercielle transfektionsreagenser kan anvendes i lentivirus produktionen. Men i denne rapport, giver vi en økonomisk metode ved hjælp af calciumphosphat nedbør, der kan opnå over 90% transfektionseffektivitet i293T-celler. Sammenlignet med konstitutive shRNA ekspressionsvektorer, en inducerbar shRNA system er især egnet til at vælte et gen afgørende for celleproliferation. Vi viser genet undertrykkelse af Yin Yang 1 (YY1), en potentiel oncogen i brystkræft 4,5, med en Tet-On inducerbare shRNA systemet og dets virkninger på tumordannelse. Forskning ved hjælp af lentivirus kræver gennemgang og godkendelse af en protokol om biosikkerhed ved biosikkerhed udvalget en forskers institution. Forskning ved hjælp af dyremodeller kræver gennemgang og godkendelse af et dyr protokol fra Animal Care og Use Committee (ACUC) af en forskers institution.
Protocol
1. Generering af shRNA konstruktioner
- Identificer et siRNA-målsekvens (20-23 nukleotider) baseret på tidligere offentliggjorte kriterier 6 eller bruge en web-baseret algoritme server, såsom "siRNA Target Finder" fra Ambion og GenScript.
- Syntetisere oligonukleotider baseret på udformning i figur 1 og eksempel sekvenserne i tabel 1. Udføre PCR-opformering ved anvendelse af oligonukleotider P1 og P2 (30 cyklusser af denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 sek, og forlængende ved 72 ° C i 30 sek) og et plasmid, der bærer U6 eller H1 promotor som skabelon. Oprense PCR-produktet ved anvendelse af en PCR oprensningssøjle. Fordøje det med BamHI og HindIII og oprense det fordøjede DNA under anvendelse af en PCR oprensningssøjle. Annelere oligonukleotider P3 og P4 (2,5 pmol / ul af hver i 100 ul 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) ved kogning i 5 minutter og afkøles langsomt til omgivelsestemperatur. Fordøje en lentiviral VECtor, såsom den beskrevet i figur 2A, med BamHI og EcoRI, og udføre gel-oprensning.
- Udføre en tre-fragment-ligering med BamHI / EcoRI-fordøjet vektor, en BamHI / HindIII-spaltet PCR-fragment og et par af annealede oligonukleotider (dannelse HindIII og EcoRI-steder ved begge ender) ved en 01:10:10 molforhold (Figur 1).
- Omdanne højeffektive kompetente E. coli DH5a celler under anvendelse af ligerede produkt. Screene kolonier under anvendelse af oligonukleotiderne P5 (i vektoren) og P6 (i H1 eller U6 promotor). 7
- Fremstilling af plasmid DNA fra de positive kolonier med et kommercielt kit og bekræfte tilstedeværelsen af insertionen af BamHI / EcoRI-fordøjelse og DNA agaroseelektroforese. Sekvens i regionen indeholdende promotoren og shRNA anvendelse af oligonukleotid P5.
- Anvendes plasmid-DNA Midi-eller Maxi-forberedelsesmateriale (endotoxinfrit foretrækkes) til fremstilling af lentivirus DNA, der bærer shRNA udtrykketkassetten. Bestemmelse af DNA-koncentration ved at måle absorptionen ved 260 nm. Se DNA'et renhed under anvendelse af 260 nm/280 nm forholdet og sikre, at det falder inden for intervallet fra 1,8 til 2,0. Kontroller lentivirus plasmidet integritet under anvendelse af agarosegelelektroforese. DNA til transfektion være super-coiled.
2. Lentivirus Transfection
Forholdsregler: Lentivirale vektorer er afledt af det humane immundefektvirus-1 (HIV-1) genom og replikationsinkompetent. De har været udbredt anvendt i genafgivelse grund af evnen til at inficere både delende og ikke-delende celler. Men to store risici findes i de studier med lentivirus. (1) Potentialet for generering af replikationskompetente lentivirus. Denne risiko kan reduceres betydeligt, hvis den tredje generation lentiviral systemet anvendes. (2) risikoen for onkogenese. Denne risiko kan blive forstærket, hvis de transporteres skær er onkogene eller undertrykke tumorsuppressorer.Forskningsaktiviteterne er involveret i HIV-baserede lentivirus bør følge de "Biosafety Overvejelser for forskning med lentivirusvektorer" af NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) og kræver en godkendelse fra biosikkerhed udvalget af en forskers institution. Generelt forbedret biosikkerhedsniveau-2 (BSL-2) indeslutning er nødvendig for laboratoriet hvis lentivirale vektorer anvendes.
- Pladen 4 x 10 6 HEK 293T-celler med komplet DMEM medium (DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 enheder / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin) i 10 cm skåle og kultur natten over ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. Erstatte mediet med 5 ml forvarmet Opti-MEM I reduceret serum Media (Invitrogen).
- Fremstil en opløsning A: 10 ug shRNA indeholdende lentiviral vektor, 5 ug af hver af den tredje geneation lentivirusinfektioner emballering plasmider (fremstillet med høj renhed, tre emballager plasmider indbefatter VSV-G: for et kappeprotein, pRSV-Rev: for rev, og pMDLg / pRRE: for gag / pol, som er afgørende for lentivirus emballage), 36 pi af 2M CaCl2 og 300 ul sterilt vand.
- Forbered Opløsning B: 300 pi 2 x HEPES-bufret saltvand (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na2 HPO4, pH justeret til 7,12 med 0,5 N NaOH og steriliseret ved 0,22 um filter).
- Langsomt dråbeopløsning A i opløsning B, medens boble luft gennem Opløsning B med en pipette. Forlader røret ved omgivelsernes temperatur i 30 min.
- Langsomt falde de blandede opløsninger A / B i HEK 293T celledyrkningsskål fremstillet i trin 2.1 og inkuber ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 4-6 timer.
- Erstatte mediet med 7 ml komplet DMEM-medium. Efter 24 timer tilsættes yderligere 5 ml af komplet DMEM-medium. Harvest mediet containing lentivirus efter yderligere 24 timer i kultur.
- Dreje medium ved 1.500 rpm, stuetemperatur i 10 min. Filtreres supernatanten under anvendelse af en 0,45 um filter og dreje gennemstrømning medium indeholdende lentivirus ved ultracentrifugering ved 25.000 rpm (svarende til 125.000 x g med en SW28 svingende spand rotor, Beckman Ultracentrifuge XL-90), 4 ° C i 90 min. Supernatanten dekanteres til en beholder med 5% blegemiddel (slutkoncentration).
- Resuspender lentivirus pelleten i 0,5-1,0 ml kold PBS og gøre lentivirusinfektioner alikvoter i 50 til 100 pi pr rør. Opbevares ved -80 ° C.
- Titeren af lentivirus kan bestemmes ved kommercielle kits (såsom QuickTiter lentivirus Kvantificering Kit fra Cell Biolabs, Inc.), ved en real-time PCR-protokol 8, eller ved at bestemme co-udtrykte fluorescerende markør ved hjælp af fluorescens-mikroskopi eller flowcytometri . Typisk kan en 10-cm dyrkningsskålens producerer omkring 0,5-1,0 × 10 8 infektiontiøse enheder (IE).
3. Infektion oq karakteriserinq af inficerede celler
- Frø cellerne for at være inficeret i 2 ml komplet medium i en 6-brønds plade med 30-40% konfluens (ca. 5-8 x 10 5 celler, afhængigt cellestørrelser). Dyrkning af cellerne natten over ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Erstatte mediet med 1 ml frisk medium indeholdende 8 ug / ml polybren (Sigma, Kat # H9268) eller 5 ug / ml protamin (Sigma, katalog # P4020).
- Bestemme en egnet multiplicitet af infektion (MOI) på mellem 9 for en bestemt cellelinie med lentivirus med fluorescerende markør. Beregning eller empirisk bestemme mængden af lentivirus, der skal anvendes til at inficere cellelinjen. Langsomt slip lentivirus i pladen og ryst den forsigtigt i 10 sek.
- Inkubér pladen ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 6 timer og derefter erstatte mediet med normal komplet medium.
- Mindst to days efter infektion, se cellerne under anvendelse af fluorescensmikroskopi for lentivirus, der udtrykker fluorescerende markører og / eller tilføje det tilsvarende antibiotikum til mediet for lentivirale vektorer, der udtrykker antibiotiske resistensgener. For en inducerbar vektor, cellerne i medium, såsom en Tet-On-systemet (figur 2), kultur fremstillet med tetracyclin-fri FBS. Opdele cellerne 2-3 dage efter infektion. Tage en del af cellerne til at teste inducerbart gen knockdown ved dyrkning deraf i medium forsynes med og uden 1,5 ug / ml doxycyclin (Dox) i ≥ 2 dage.
- Kontroller genet Knockdown ved Western blot, Real-Time PCR eller immunfarvning ≥ 2 dage efter infektion, 2 dage efter antibiotisk selektion, eller (for en Tet-On inducerbare system) ≥ 2 dage efter Dox tilsætning.
- Anvender forskellige fremgangsmåder (såsom celleproliferation assays, bløde agarkultur undersøgelser, migration assays, invasion assays og tumordannelse undersøgelser) for at bestemme virkningerne af målgenet kNockdown på malignitet af cellerne.
4. Xenotransplantat mus modelundersøgelse
- Rengøre alle overflader til mus bedøvelse og injektion med 70% ethanol for at forhindre infektion af mus. Bedøve athymiske nøgne mus (NCI-Frederick) under anvendelse af 2% isofluran blandet med oxygen i en narkosemiddel kammer 10 min før celleinokulering. Opretholde anæstesi under anvendelse af 1% isofluran blandet med oxygen via en næsekegle. Udfør dette trin i et rum med god ventilation og vedhæft isofluran scavenger filtre til induktion kammeret.
- Udbreder de celler, der bærer shRNAs. Anvende tetracyclin-frit medium til Tet-On inducerbare vektorer. Trypsinisér cellerne, og resuspender dem i komplet medium indeholdende 50% Matrigel. Placer de nøgne mus på en varmepude (30 ° C) og injiceres 200 pi af cellerne (1-10 x 10 6, afhængigt af malignitet af cellerne) i musene med 1-2 injektionssteder pr mus. Brug sprøjter med 25.5-gauge nåle for subkutane injektioner, og 28-30 gauge nåle til ortotopisk injektioner.
- For konstitutive shRNA vektorer, anvender 2 grupper af mus injiceret med celler, der udtrykker målgenet shRNA og en kodet shRNA. For Tet-On inducerbare shRNA vektorer, anvender 4 grupper af mus injiceret med celler, der bærer målgenet shRNA og en kodet shRNA, forsynes med normalt vand og DOX (1,5 mg / ml) indeholdende vand (2 shRNAs × 2 behandlinger = 4 grupper) . Udskift Dox-holdige vand to gange om ugen.
- Overvåge længden og bredden af tumorerne ugentlige eller hver anden uge ved en digital skydelære og beregne tumorvolumener (V) med formlen V = 1/2 (længde x bredde2) 10. Sørg for, at tumor volumen ikke overstiger retningslinjerne i den institutionelle ACUC (som f.eks, 10% af kropsvægten). Afliv alle mus ved hjælp af en protokol godkendt af institutionelle ACUC hvis det viser tegn på omfattende ulceration eller nekrose, indlysende infection, ukontrolleret blødning eller slutstadium sygdom.
- Tumorvækst og metastase, kan overvåges for inokulerede tumorceller, der udtrykker en bioluminescerende markør 11, såsom ildflueluciferase. Rengør alle overflader for mus bedøvelse og billedbehandling med 70% ethanol for at forhindre infektion af mus. Bedøve musene som beskrevet i trin 4.1. Injicere luciferin (150 mg / kg) intraperitonealt. Placer musene i en desinficeret billeddannelse kammer i et kommercielt imaging system, såsom en IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences, Inc.). Tænd for anæstesi håndtaget for at vedligeholde anæstesien med 1% isofluran blandet med ilt. Gennemføre dette trin i et rum med god ventilation.
- Tag det første billede ved at udsætte 5 minutter og kontrollere dens signal intensitet. Juster eksponeringen tid til at få billeder med optimal signal versus baggrund. Bestemme afbildningstiden empirisk, som generelt er 1-5 min for subkutane tumorer.
- Aflive musene ved en godkendt protokolaf den institutionelle ACUC når tumorstørrelser nå op på omkring 1.000 mm 3, eller som angivet af ACUC retningslinjer. Excise den xenotransplantattumorer, vejer dem og tage billeder. Behandle tumorprøver til forskellige undersøgelser, såsom patologiske analyser for at afgøre tumor celle morfologi, og Western Blot og Real-Time PCR undersøgelser for at teste genekspression.
5. Repræsentative resultater
Denne protokol blev anvendt til at undersøge virkningerne af YY1 knockdown af xenograft tumordannelse af ildflue-luciferase-udtrykkende MDA-MB-231-celler (humane brystadenokarcinomceller; Caliper Life Sciences) i athymiske nøgne mus. Den shRNA målsekvens af human YY1 er "GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T". En forvrænget sekvens "GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T" blev også skabt for en kontrol (fortsat) shRNA, som ikke har betydelig lighed med nogen kendt udskrift. Oligonucleotiderne anvendt til at Tet-On inducerbare shRNA konstruktioner med YY1 som et eksempel, Er vist i tabel 1. Som et resultat blev to lentivirale vektorer, plu-puro-Indu-YY1 shRNA og plu-puro-Indu-cont shRNA, fremstillet og de blev anvendt til at fremstille lentivira. Vi anvendte disse lentivira individuelt inficere to MDA-MB-231-cellekloner (kloner 1 og 3), der udtrykker både tetracyklin regulator (tetR) og ildflueluciferase. Polyklonale cellepopulationer blev opnået efter puromycin selektion. Figur 3A viser Dox-induceret YY1 knockdown i disse MDA-MB-231-celler inficeret med plu-puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. Vi derefter anvendt de polyklonale celler af klon 3 inficeret individuelt ved disse inducerbar YY1 shRNA og CONT shRNA lentivira og observerede, at YY1 depletering reduceret invasivitet af MDA-MB-231-celler (fig. 3B). Western blot-analyser bekræftede Dox-induceret YY1 inaktivering i MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA, medens celler, der indeholder indu-cont shRNA ikke viser denne virkning (figur 3C). Vi derefter anvendes disse celler til xenotransplantat musemodel undersøgelse. Sammenlignet med kontrolgrupperne, musene implanteret ved MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA og forsynet med Dox-holdigt vand udviste reduceret tumordannelse, når visualiseret ved bioluminescens (figur 4A) og bestemmes ved tumorvægte (figur 4B ). YY1 inaktivering i disse xenotransplantattumorer blev bekræftet ved Western blot-forsøg er vist i figur 4C.
Figur 1. Skematisk diagram til generering af en shRNA konstruktion og shRNA transkription. Den primerne P1 til P6 er vist (se tabel 1 for eksempel sekvenser). Pol III: RNA-polymerase III (d). Fordøjet ende. Tegning er ikke målestok. Klik her for at se et større billede .
2 "src =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
Figur 2. Skematiske diagrammer af (A) en lentiviral vektor, og (B) mekanismen af Tet-On inducerbar H1 promotor anvendes til gen-nedregulering. Den lentivirale vektor blev rekonstrueret ud fra pLL3.7 14. H1-Pr: H1 promotor; UBC-Pr: human ubiquitin C promotor; Puro: puromycin, TRE: tetracyclin responsive element; Dox: doxycyclin. TetR: tetracyclin regulator. 5'LTR, 3'SIN-LTR og WRE er væsentlige elementer i en lentiviral vektor 14.
Figur 3. DOX-induceret YY1 nedregulering og dens virkning på invasivitet af MDA-MB-231 celler. A. YY1 niveauer i to polyklonale cellepopulationer afledt TetR-udtrykkende kloner 1 og 3 er inficeret med plu-puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus og dyrket i fravær og nærvær af Dox. B. Boyden kammer assay af MDA-MB-231 celler med inducerbare shRNAs. (* P <00,05 versus andre tre grupper). C. Repræsentative Western blots af YY1 ekspression i disse fire cellepopulationer.
Figur 4. Virkninger induceret YY1 silencing på xenotransplantat tumordannelse ved MDA-MB-231 celler. A. Skematisk diagram af celle implantation (venstre) og repræsentative bioluminiscerende billeder taget af den IVIS Imaging System på 4 uger (til højre) efter celleinokulering. B. xenograft tumorvægte efter 4 uger. * P ≤ 0,05. C. Western blots af YY1 og β-actinekspression i transplantater af MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA i fravær og nærvær af DOX. Etiketter på toppen er navnene på enkelte mus.
| Oligonucleotid | Sekvensen (5 '- 3') | Anvendelse og placering |
| P1 (Tet-On H1) | CAGT GGATCC CGA ACG CTG ACG TCA TCA ACC C | PCR; ved 5'-enden af H1-promotoren |
| P1 (U6) | CAGT GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG | PCR; ved 5'-enden af U6 promotoren |
| P2 (for YY1 med Tet-On H1) | cagc AAGCTT GAA ATC TGC acc TGC TTC TGC tcc c GGG ATC TCT ATC ACT GAT AGG GAA C | PCR; ved 3'-enden af Tet-On inducerbar H1 promotor |
| P2 (for YY1 med U6) | cagc AAGCTT GAA ATC TGC acc TGC TTC TGC tcc c aaa CAA GGC ttt TCT CCA agg GAT en | PCR; ved 3'-enden af U6 promotoren |
| P3 (for YY1) | AGC tt ATC TGC acc TGC TTC TGC tcc c ttttt g | Kan anneales med P4 |
| P4 (for YY1) | aattc aaaaa | Skal udglødet med P3 | |
| P5 (for pLL3.7) | ggg tac AGT GCA ggg GAA AGA ata g | Til PCR-screening, der anvendes til P6 |
| P6 (for Tet-On H1) | GAT TTC CCA GAA CAC ATA GCG AC | Til PCR-screening, anvendes sammen med P5 |
| P6 (for U6) | AGG GTG AGT TTC CTT TTG TGC TG | Til PCR-screening, anvendes sammen med P5 |
Tabel 1. Syntetiserede oligonukleotider anvendt til at generere shRNA konstruktioner. P1 og P6 sekvenser for mus U6 og Tet-On inducerbare humane H1 promotorer er tilvejebragt. Human YY1 anvendes som et eksempel med en shRNA målsekvens af GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T. sekvenser specifikke for YY1 fremhæves. To P2 sekvenser af YY1 er konstrueret til de to promotorer, hhv. Den konstitutive U6 / YY1 shRNA blev beskrevet tidligere 15, medens Tet-On H1/YY1 blev anvendt i denne protokol. P5 er vektor-specifik og sekvens for pLL3.7 14 er vist. Sekvenserne af restriktionsenzymer er understreget, og de sekvenser, der annealer til de promotorer under PCR-amplifikation er kursiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskrives en metode til at vælte et gen under anvendelse shRNA og visualisere den biologiske virkning ved hjælp af bioluminescerende billeddannelse af tumorcellevækst in vivo. Målstedet for en shRNA bør ikke indeholde nogen af de tre restriktionssteder (BamHI, HindIII og EcoRI), der anvendes til subkloning. En sjælden scenario, når som helst af disse sites er til stede, kan en yderligere restriktionsenzym anvendes til at erstatte det i generering af konstruktionen.
Adskillige vigtige skridt i denne protokol vil fremskynde opbygningen af shRNA lentivirusvektorer. For det første kan PCR-skabelon plasmidet indeholdende U6 eller H1 promotor har en anden antibiotisk resistensgen (såsom kanamycin) fra lentiviral vektor (typisk ampicillin). Dette kan reducere baggrunden af transformation forårsaget af skabelonen plasmidet. Sekund, er det nødvendigt at anvende kompetente E. coli-celler med høje virkningsgrader af transformation. En protokol anvendelse af kalium ennd manganioner kan anvendes til fremstilling af kompetente E. coli-celler med ekstremt høje kompetencer 12. For det tredje kan en selekterbar markør lette 3-fragmentet subkloning. For eksempel kan en lentiviral vektor konstrueres til at indeholde en ekspressionskassette for β-galactosidase (LacZ), som vil blive erstattet ved insertion af PCR-fragmentet og annealet P3/P4 oligonukleotider. I dette tilfælde vil rekombinante plasmider med inserter danner hvide kolonier, mens disse ikke indsatsene bliver blå, når de udsættes for X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranosid) .
Kvaliteten af lentivirale vektorer og de tre emballage plasmider er væsentligt for effektiv lentivirus produktion. En meget økonomisk og effektiv transfektion med anvendelse af calciumphosphat nedbør er tilvejebragt. Polyethylenimintypen 13 eller kommercielle transfektionsreagenser kan også anvendes i lentivirus produktionen. For at bruge en ordentlig MOI for infektion, er det vigtigt at bestemme titere af produceret lentivirus.
Mus af alle forsøgsgrupper skal anbringes i det samme rum til at fjerne deres døgnrytme forskel, som kan forårsage variationer i bioluminescens under xenograft tumorafbildning. Tilgange af muse eutanasi omfatte CO 2 kvælning og overdosering af isofluoran og bør godkendes af den institutionelle ACUC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af de forskningsstipendiat Tilskud (116.403-RSG-09-082-01-MGO) fra American Cancer Society og Egne fonde for Wake Forest University Health Sciences til GS. DBS blev støttet af NCI træning tilskud 5T32CA079448.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol. | |||
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment | |||
| PCR thermocycler | |||
| Ultracentrifuge | |||
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers | |||
| Digital Vernier caliper | |||
| IVIS imaging system | |||
| Highly competent DH5a E. coli | |||
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes | |||
| T4 DNA Ligase | |||
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE | |||
| Materials List | |||
References
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , Forthcoming (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
