Summary
Mitochondrial पृथक माउस mitochondria दिल में पारगम्यता संक्रमण ताकना खोलने की माप के लिए एक spectrofluorometric प्रोटोकॉल को यहां प्रस्तुत किया है. परख mitochondria सीए के साथ माप शामिल
Protocol
1. Mitochondria माउस दिल से अलगाव
- दिल mitochondria को अलग anesthetize, और अपने स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार चूहों बलिदान.
नोट: mitochondria अलगाव प्रोटोकॉल के सभी चरणों को बर्फ पर किया जाना चाहिए. बर्फ के ठंडे buffers और पूर्व ठंडा पेट्री डिश, फाल्कन ट्यूबों और Eppendorf ट्यूब का प्रयोग करें. प्रोटोकॉल में दी गई मात्रा 2 माउस दिलों युक्त नमूना के लिए कर रहे हैं.
- दिल निकालें, उन्हें ठंड Mitochondria अलगाव बफर में जगह (300 मिमी sucrose, 10 ना HEPES मिमी, 200 सुक्ष्ममापी EDTA, 7.4 पीएच) और बंद रक्त कुल्ला.
नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, mitochondrial buffers का पीएच कोह और एसिटिक एसिड के साथ समायोजित किया जाना चाहिए.
- एक ठंड पेट्री डिश पर जगह दिल, वसा और atria निकालें, और सूक्ष्मता बोटी - बोटी करना प्राप्त करने के लिए जब तक एक ब्लेड का उपयोगएक सजातीय उत्पाद आईएनजी.
- एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब कीमा बनाया हुआ दिल स्थानांतरण, 0.1 मिलीग्राम / एमएल trypsin के साथ Mitochondria अलगाव बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ने और नमूना बर्फ पर 10 मिनट के लिए पचाने के लिए अनुमति देते हैं.
नोट: अलगाव की प्रक्रिया के दौरान ट्रिप्सिन पृथक mitochondria की पैदावार बढ़ जाती है और mitochondrial तैयारियाँ बीच लगातार रखा जाना चाहिए. हम अनुशंसा करते पृथक तैयारी पर mitochondrial कार्यों का परीक्षण trypsin के अभाव के लिए सुनिश्चित करें कि एंजाइम कार्यशीलता के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है.
- 0.1% फैटी एसिड मुक्त BSA और 5 मिलीग्राम trypsin अवरोध करनेवाला (सोयाबीन) के साथ Mitochondria अलगाव बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें और inverting ट्यूब कई बार द्वारा मिश्रण करने के लिए trypsin बेअसर.
नोट: Mitochondria अलगाव बफर अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है विगलन पर पीएच की जाँच करें. ट्रिप्सिन, trypsin अवरोध करनेवाला या BSA एक होना चाहिएप्रयोग के दिन पर Mitochondria अलगाव बफर dded.
- कम से मध्यम गति centrifugation द्वारा 4 में 1 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए पचा ऊतक पुनर्प्राप्त
- 0.1% फैटी एसिड मुक्त BSA और homogenize एक motorized एक Teflon मूसल (1,200-14,00 rpm पर 4-6 गुजरता) के साथ Dounce homogenizer का उपयोग के साथ 8 मिलीग्राम Mitochondria अलगाव बफर में Resuspend ऊतक. बर्फ पर नमूना रखें जबकि homogenizing.
- स्थानांतरण 800xg में एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 4 में 10 मिनट के लिए homogenate ° C गोली नाभिक और ऊतक मलबे.
- Eppendorf ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 15 मिनट के लिए 8000 XG पर mitochondria युक्त तैरनेवाला 4, स्वस्थ डिग्री सेल्सियस
- ध्यान से ऊपर सफेद परत निकालें और शेष गहरा 1 मिलीलीटर Mitochondria अलगाव बफर में mitochondria युक्त गोली धो लो.
- 4 बजे 15 मिनट के लिए 8000xg पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस 150 μl Mitochondrial Isola में सतह पर तैरनेवाला और resuspend mitochondria गोली त्यागेंtion बफर. बर्फ पर आगे assays के लिए mitochondria रखें.
नोट: कार्यात्मक assays के दौरान सर्वोत्तम परिणामों के लिए, अलगाव के 4 घंटे के भीतर mitochondria का उपयोग करें.
- Mitochondrial ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग प्रोटीन यों.
2. पृथक Mitochondria की गुणवत्ता नियंत्रण
2.1. श्वसन नियंत्रण अनुपात के मापन (रेसकोर्स रोड)
- हवा संतृप्त पानी के साथ Oxytherm ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड जांच करने के लिए अधिक से अधिक ऑक्सीजन लाइन स्थापित करने के लिए. जब ऑक्सीजन की एक स्थिर स्तर प्राप्त की है हौसले से तैयार 10 मिमी सोडियम hydrosulfite समाधान शून्य ऑक्सीजन लाइन की स्थापना की 100 μl जोड़ें. 30 डिग्री सेल्सियस पर मापन का प्रदर्शन
- 1 सुक्ष्ममापी Oxytherm कक्ष को rotenone साथ जोड़ें 2 मिलीलीटर Mitochondria श्वसन बफर (125 मिमी KCl, 20 मिमी HEPES, 3 मिमी 2 MgCl, 400 सुक्ष्ममापी EGTA, 300 सुक्ष्ममापी डीटीटी, 5 मिमी KH 2 4 पीओ, पीएच 7.2), चैम्बर सील करने के लिए और शुरू recorडिंग.
- जब ऑक्सीजन संकेत स्थिर है, 1 मिनट के लिए 250 mitochondria ग्राम और रिकार्ड बेसल श्वसन जोड़ने. इस बिंदु पर श्वसन बहुत कम होने के रूप में अंतर्जात substrates (राज्य श्वसन 1) पर mitochondria respiring रहे हैं चाहिए.
- 5 मिमी succinate और 1 मिनट के लिए रिकॉर्ड संकेत जोड़ें. राज्य 2 श्वसन के दौरान ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि करनी चाहिए.
- 150 सुक्ष्ममापी ADP जोड़ने द्वारा राज्य 3 श्वसन प्रेरित. इस बिंदु ऑक्सीजन की खपत oxidative phosphorylation के माध्यम से एटीपी संश्लेषण के कारण वृद्धि करनी चाहिए. रिकॉर्ड संकेत जब तक श्वसन धीमा, ADP खपत और राज्य 4 श्वसन संक्रमण का संकेत है. कम से कम 1 मिनट के लिए रिकॉर्ड राज्य श्वसन 4.
- 1 सुक्ष्ममापी CCCP और 1 मिनट के लिए रिकॉर्ड संकेत जोड़ें. Uncoupled श्वसन अधिक से अधिक होना चाहिए.
नोट: mitochondrial श्वसन पर CCCP के प्रभाव खुराक निर्भर है: CCCP की उच्च सांद्रता ऑक्सीजन की खपत को बाधित कर सकते हैं और इसलिए ध्यान टी होना चाहिएitrated.
- राज्य श्वसन 4 के दौरान ऑक्सीजन की खपत दर से राज्य 3 श्वसन के दौरान ऑक्सीजन की खपत दर विभाजित करके श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड) की गणना. एक लक्ष्य RCR 4 ≥ होना चाहिए.
2.2. Mitochondrial झिल्ली अखंडता का आकलन (साइटोक्रोम ग परीक्षण)
- अच्छी तरह से 70% इथेनॉल और पानी साथ Oxytherm चैम्बर धोने और कदम -2.1.4 2.1.2 दोहराने के.
- 1 मिमी ADP और रिकॉर्ड 1 मिनट के लिए ऑक्सीजन की खपत जोड़ें.
- 10 सुक्ष्ममापी साइटोक्रोम ग जोड़ें. चूंकि साइटोक्रोम ग बरकरार mitochondrial झिल्ली के लिए अभेद्य है, श्वसन में वृद्धि हुई है या टूट क्षतिग्रस्त mitochondrial झिल्ली को इंगित करता है.
3. Mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना खोलने की मापन
- मल्टी पैरामीटर mtPTP खोलने की माप के लिए spectrofluorometer सेटअप. FelixGx कार्यक्रम का उपयोग करना, एक नए हार्डवेयर विन्यास (क्वांटा मास्टर स्थिर स्टेशनते) प्रकाश स्रोत, उत्तेजना monochromator, नमूना डिब्बे और दो उत्तेजना monochromator (4 चित्रा) के सम्मान के साथ 90 ° और 270 ° पर तैनात है डिटेक्टरों शामिल हैं. अधिक से अधिक समय संकल्प को प्राप्त करने के लिए, दोनों उत्सर्जन monochromators (90 ° और 270 °) और अक्षम किया जाना चाहिए 90 ° और 270 ° पर नमूना डिब्बे में उत्सर्जन फिल्टर हार्डवेयर विन्यास मेनू में सक्षम है. यह कदम उत्सर्जन तरंगदैर्य की मोटर नियंत्रण हटाने और एक विशेष तरंगदैर्ध्य पर प्रत्येक monochromator को ठीक कर देंगे. यदि उत्सर्जन monochromators अक्षम नहीं कर रहे हैं, प्रत्येक डिटेक्टर दोनों तरंगदैर्य और डुप्लिकेट माप के बीच चक्र होगा दर्ज किया जाना है.
- एक नए अधिग्रहण मल्टी डाई प्रकार का उपयोग प्रोटोकॉल बनाएँ और निम्नलिखित रंजक दर्ज करें:
- Fura (उच्च Ca + +) उत्तेजना 340 एनएम, उत्सर्जन 525 एनएम (1 डिटेक्टर)
- Fura (कम Ca + +): उत्तेजना 380 एनएम, 525 एनएम (1 डिटेक्टर) उत्सर्जन
- JC1 (कुल): 543 एनएम उत्तेजनाउत्सर्जन 595 एनएम (2 डिटेक्टर)
- JC1 (monomer): 498 एनएम उत्तेजना उत्सर्जन 525 एनएम (1 डिटेक्टर)
- सूजन: 525 एनएम उत्तेजना, उत्सर्जन 525 एनएम (1 डिटेक्टर)
- 1 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन slits और तापमान 37 डिग्री सेल्सियस सेट
- Fura और जे.सी.-1 के लिए ratiometric संकेत प्राप्त करने के लिए, दो व्युत्पन्न निशान उत्पन्न: Fura (उच्च Ca + +) / Fura (कम Ca + +) और (कुल) JC1 / JC1 (monomer).
- मैन्युअल रूप से 1 डिटेक्टरों और 2 से 525 एनएम और 595 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन क्रमशः समायोजित करने के लिए,.
- मिश्रण 1 सुक्ष्ममापी rotenone, 5 मिमी succinate और एक डिस्पोजेबल 4 पक्षीय में 800 एनएम Fura एफएफ के साथ 1 मिलीग्राम Mitochondria परख बफर (120 मिमी KCl, 10 मिमी NaCl, 1 मिमी KH 2 4 पीओ, 20 मिमी HEPES Tris, पीएच 7.2) methacrylate क्युवेट. नमूना डिब्बे में 250 नमूना mitochondria ग्राम और जगह से जोड़ें. सुनिश्चित करें कि चुंबकीय दोषी पर कर दिया जाता है.
- रिकॉर्डिंग शुरू. 1 मिनट के बाद, अधिग्रहण को रोकते हैं, 500 एनएम जे.सी.-1 जोड़ने और फिर एक पुनः आरंभcquisition. जे.सी.-1 संकेत अनुपात बढ़ाने के लिए, mitochondria से सक्रिय डाई तेज का संकेत चाहिए. रिकॉर्डिंग जारी रखें जब तक जे.सी. 1-संकेत (आमतौर पर 5 मिनट के भीतर) एक पठार तक पहुँच गया है.
- 20 सुक्ष्ममापी 2 CACL जोड़ें. Fura एफएफ अनुपात संकेत में एक तात्कालिक वृद्धि परख बफर में वृद्धि हुई Ca 2 + उपस्थिति, एक क्रमिक कमी mitochondrial Ca 2 + तेज करने के लिए कारण से बाद से मनाया जाना चाहिए. जे.सी.-1 संकेत अनुपात एक संक्षिप्त क्षणिक कमी का संकेत मामूली mitochondrial झिल्ली विध्रुवण प्रदर्शन करना चाहिए.
- बेसल एक और CACL 2 पल्स (1-1.5 मिनट) के अलावा करने के लिए पहले स्तर Fura एफएफ अनुपात संकेत देता है जब तक रुको. निश्चित अंतराल पर स्पंदन जारी रखें जब तक mitochondria 2 Ca नहीं जमा कर सकते हैं और परख बफर में 2 Ca जारी शुरू करते हैं. mtPTP खोलने Fura एफएफ अनुपात संकेत में एक समवर्ती 2 Ca के कारण वृद्धि द्वारा visualized है रिहाई, संकेत जे.सी.-1 के अनुपात में कमी झिल्ली pote के कारणntial पतन, और mitochondrial सूजन के कारण प्रकाश बिखरने में एक कमी है (5 चित्रा).
- सक्रियण बाद mtPTP, Fura एफएफ, जे.सी.-1 और सूजन संकेतों की विशिष्टता क्रमशः सत्यापित साथ 1 मिमी EGTA 1 सुक्ष्ममापी CCCP और 5 ग्राम / मिलीलीटर alamethicin.
- MtPTP खोलने की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए, 3.6 चरणों को दोहराएँ 1 सुक्ष्ममापी की उपस्थिति में cyclophilin डी अवरोध करनेवाला cyclosporine के 3.9 (cyclophilin डी mtPTP का एक घटक है). Cyclosporine की उपस्थिति में एक, mtPTP के उद्घाटन के नियंत्रण नमूने (6 चित्रा) की तुलना में काफी अधिक CACL 2 दालों की आवश्यकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 2 पृथक माउस mitochondria दिल के एक ठेठ श्वसन नियंत्रण से पता चलता है. राज्य 3 श्वसन ADP के succinate पर mitochondria respiring अलावा द्वारा हासिल की है, और substra करने के लिए सम्मान के साथ काफी वृद्धि हुई ऑक्सीजन की खपत द्वारा विशेषताअकेले ते. की कमी ADP शुरू की राज्य 4 श्वसन, जिसके दौरान ऑक्सीजन की खपत धीमा और ADP अलावा पूर्व प्राप्त कर ली दरों के बराबर है. रेसकोर्स रोड कि राज्य 4 श्वसन द्वारा राज्य 3 श्वसन के लिए ऑक्सीजन की खपत दर विभाजित करके प्राप्त की है. साइटोक्रोम ग परीक्षण बाहरी mitochondrial झिल्ली की अखंडता की परख के लिए प्रयोग किया जाता है: जब साइटोक्रोम ग succinate और ADP, श्वसन में आगे कोई वृद्धि मनाया mitochondria respiring जोड़ा जाता है, एक अक्षुण्ण बाहरी mitochondrial झिल्ली (3 चित्रा) का संकेत है.
पृथक mitochondria दिल में mtPTP खोलने के लिए एक प्रतिनिधि छवि 4 चित्र में दिखाया गया है. इस मामले में mtPTP खोलने 1.5 मिनट के अंतराल पर 4 CACL 2 दालों (20 सुक्ष्ममापी प्रत्येक) के अलावा द्वारा शुरू किया गया था. mtPTP खोलने के पास एक साथ रिलीज mitochondrial 2 Ca + (Fura FF संकेत अनुपात में वृद्धि), mitochond के पतन के द्वारा स्पष्ट हैरियाल झिल्ली (JC-1 संकेत अनुपात में कमी) की क्षमता और बढ़ mitochondrial मात्रा (सूजन संकेत में कमी). Cyclosporine जब एक जोड़ा है, जो mtPTP cyclophilin डी घटक को बांधता है, mtPTP खोलने CACL 2 की बजाय 4 7 दालों (5 चित्रा) की आवश्यकता है.
चित्रा 1 पृथक mitochondria दिल के लिए मल्टी पैरामीटर mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना खोलने प्रोटोकॉल का प्रवाह चार्ट. हार्ट चूहों से काटा जाता है और mitochondria अंतर centrifugation के माध्यम से अलग कर रहे हैं. mitochondrial तैयारी तो गुणात्मक श्वसन नियंत्रण और साइटोक्रोम ग की उपस्थिति में mitochondrial झिल्ली intactness अनुपात के polarographic माप के द्वारा मूल्यांकन किया है. पृथक mitochondria में Mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना खोलने अनुक्रमिक सीएसी से शुरू हो रहा हैएल 2 परिवर्धन और एक spectrofluorometer के साथ mitochondria, झिल्ली संभावित पतन से Ca 2 + रिहाई निगरानी और mitochondrial मैट्रिक्स की सूजन से मापा जाता है.
चित्रा 2 के मापन. पृथक mitochondria दिल की श्वसन नियंत्रण अनुपात (RCR). पृथक mitochondria दिल से ऑक्सीजन की खपत 3 श्वसन के दौरान राज्य succinate और ADP की उपस्थिति में मापा जाता है, और राज्य ADP खपत के बाद 4 श्वसन के दौरान. पृथक uncouplers mitochondria की प्रतिक्रिया CCCP के अलावा द्वारा मापा जाता है. ग्राफ़ पर संख्याओं nmol / / मिनट मिलीग्राम प्रोटीन में अलग mitochondria से ऑक्सीजन की खपत की दर हैं.
चित्रा 3 उपाय. पृथक mitochondria दिल की झिल्ली अखंडता के बयान. Mitochondrial झिल्ली अखंडता succinate और ADP की उपस्थिति में और साइटोक्रोम ग के अलावा के बाद पृथक mitochondria में ऑक्सीजन की खपत को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है. ग्राफ़ पर संख्याओं nmol / / मिनट मिलीग्राम प्रोटीन में अलग mitochondria से ऑक्सीजन की खपत की दर हैं.
चित्रा mtPTP खोलने की माप के लिए बहु - पैरामीटर Spectrofluorometer 4 हार्डवेयर विन्यास. spectrofluorometer हार्डवेयर विन्यास एक प्रकाश स्रोत, एक उत्तेजना monochromator, एक नमूना डिब्बे और 525 एनएम और 595 एनएम में तय उत्सर्जन तरंगदैर्य के साथ दो डिटेक्टरों शामिल हैं. 1 वेक्षक Fura एफएफ उच्च और कम 2 Ca +, monomer जे.सी.-1 के संकेत का पता लगाने, और सूजन संकेत के लिए प्रयोग किया जाता है. 2 वेक्षक जे.सी.-1 कुल संकेत उपाय.
चित्रा 5 अलग mitochondria दिल में मल्टी पैरामीटर mtPTP खोलने की माप. mtPTP उद्घाटन 20 सुक्ष्ममापी CACL 2 अनुक्रमिक परिवर्धन द्वारा शुरू किया गया था और सीए द्वारा 2 विशेषता mitochondria, mitochondrial झिल्ली संभावित पतन से रिहाई और mitochondrial मैट्रिक्स मात्रा (सूजन) की वृद्धि हुई है. Extramitochondrial 2 Ca + और झिल्ली क्षमता ratiometric Fura एफएफ (हरा ट्रेस) और जे.सी. 1 (लाल ट्रेस) संकेतक के साथ मापा गया. Mitochondria की सूजन 525 एनएम (काले ट्रेस) पर प्रकाश बिखरने रिकॉर्डिंग से मापा गया था. जे.सी.-1 की विशिष्टता और सूजन संकेतों 1 सुक्ष्ममापी CCCP और 5 ग्राम / एमएल alamethicin (माइक्रोबियल विष) के साथ परीक्षण किया गया था.
चित्रा 6 मल्टी.पृथक cyclosporine ए Cyclosporine की उपस्थिति में mitochondria दिल में पैरामीटर mtPTP खोलने की माप (1 सुक्ष्ममापी) CACL 2 अलग mitochondria दिल में mtPTP खोलने के लिए आवश्यक दालों की संख्या बढ़ जाती है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल आवश्यक प्रयोगात्मक पृथक mitochondria दिल (1 चित्रा और चित्रा 4) में पारगम्यता संक्रमण ताकना खोलने का आकलन चरणों का वर्णन: माउस दिल mitochondria के लिए अलग प्रक्रिया, श्वसन नियंत्रण है कि उनकी ईमानदारी और कार्यक्षमता को सुनिश्चित करने के लिए, mitochondrial मापदंडों के दौरान निगरानी mtPTP खोलने और उनके माप के लिए कार्यरत रंजक, spectrofluorometric उपकरण की स्थापना, और mtPTP उद्घाटन के लक्षण वर्णन. इस प्रोटोकॉल में कार्यरत spectrofluorometer एक साथ इन तीन मापदंडों का तेजी से माप परमिट. हालांकि, बुनियादी प्रोटोकॉल अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करते हुए कम समय संकल्प के साथ यद्यपि, नियोजित किया जा सकता है. गैर ratiometric रंगों भी नियोजित किया जा सकता है, लेकिन दोनों 2 Ca + और mitochondrial झिल्ली क्षमता 5 के मात्रात्मक उपायों की अनुमति नहीं है.
एकअच्छी गुणवत्ता mitochondrial तैयारी आवश्यक है जब mtPTP खोलने परख करने की क्रिया है, के बाद से दोनों Ca 2 संचित करने की क्षमता और एक झिल्ली क्षमता को बनाए रखने कसकर interrelated रहे हैं. उदाहरण के लिए, हम एक कम RCR जे.सी. -1 संचय और गरीब Ca 2 + जुटाना कम प्रदर्शन के साथ कि mitochondria पाया. हम प्रक्रिया mitochondria दिल को अलग करने के लिए उपयोग कर रहे हैं पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 6, 7 से लिया गया था और उच्च गुणवत्ता mitochondria रेसकोर्स रोड और साइटोक्रोम ग परीक्षण द्वारा मापा में बहुत अनुरूप साबित हुई.
MtPTP के खुलने एक जटिल घटना कि mitochondrial शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान में कई स्तरों पर बदलाव शामिल है. परख हम यहाँ का वर्णन spectrofluorometrically extramitochondrial Ca 2 + के स्तर में एक साथ परिवर्तन, mitochondrial संभावित झिल्ली और mitochondrial मात्रा के उपाय. एक ही समय में कई मापदंडों की माप comprehe प्रदान करता हैव्यक्तिगत मापदंडों के अकेले 2 CA के रूप में, माप से घटना की nsive तस्वीर + जुटाना या सूजन. इसके अलावा, 2 Ca + और झिल्ली संभावित माप के लिए ratiometric रंजक Fura एफएफ और जे.सी.-1 का उपयोग प्रयोगात्मक एकाग्रता तेज, या photobleaching डाई संबंधित artifact सीमा. इन रंगों को भी आसानी से करने में अधिक मात्रात्मक मापन प्राप्त calibrated किया जा सकता है. एक महत्वपूर्ण टिप्पणी है कि सभी डाई सांद्रता कम के रूप में संभव के रूप में रखा जाना चाहिए mitochondria श्वसन और झिल्ली क्षमता के साथ हस्तक्षेप से बचने के रूप में अच्छी तरह से रूप में mtPTP खोलने फ़ोटो का काग़ज़ प्रकाश - ग्राही बनाना. हमारे हाथ में, 1 सुक्ष्ममापी ऊपर जे.सी.-1 सांद्रता 1-2 दालों द्वारा mtPTP खोलने की जरूरत दालों की संख्या को कम करने. इसलिए उचित नियंत्रण रंगों को छोड़कर और अन्य मानकों (जैसे अकेले सूजन के रूप में) रिकॉर्डिंग लगता है कि PTP खोलने की जरूरत दालों की संख्या लगातार बनी हुई है के द्वारा किया जाना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल के दौरानहम जो द्वितीय जटिल से जटिल मैं अन्य श्वसन substrates रिवर्स इलेक्ट्रॉन परिवहन रोकता rotenone, की उपस्थिति में mitochondria जटिल द्वितीय सब्सट्रेट succinate पर respiring लिए mtPTP खोलने मापा है पाइरूवेट / Malate जो परिसर पर श्वसन का समर्थन करता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है, मैं हालांकि, 2 Ca की संख्या में substrate से संबंधित मतभेद + को mtPTP खोलने के लिए आवश्यक दालों 8 किया गया है की सूचना दी है. mtPTP खोलने को मापने के लिए एक ही प्रोटोकॉल विभिन्न ऊतकों या सेल लाइनों से mitochondria अलग के साथ नियोजित किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक जिगर, मांसपेशियों और mitochondria मस्तिष्क के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है, हालांकि 2 Ca की संख्या + दालों mtPTP खोलने निर्भर ऊतक के रूप में पहले 10 9 रिपोर्टेड ट्रिगर की जरूरत है. mitochondria अलगाव प्रोटोकॉल और अनुकूलित किया जाना चाहिए प्रत्येक ऊतक या सेल homogenization प्रक्रिया और अलगाव 11 buffers, 12 के बारे में विशिष्ट आवश्यकताओं के कारण लाइन के लिए अनुकूलित
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम HL094536 (BJH) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. Jr The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
