Summary
这里介绍一个荧光光谱的测量小鼠离体心脏线粒体中的线粒体通透性转换孔开放的协议。该法涉及同时测定线粒体钙
Abstract
线粒体通透性转换孔（mtPTP）是一种非特异性通道，形成内线粒体膜的运输溶质的相对分子质量小于1.5 kDa的。虽然最终分子身份的孔隙仍在辩论，如亲环蛋白D，VDAC和ANT的蛋白质有助于mtPTP形成。虽然参与的mtPTP开放的细胞死亡完善，越来越多的证据表明，mtPTP供应的生理作用过程中线粒体Ca 2 +稳态，生物能和氧化还原信号3。
被触发mtPTP开口矩阵的Ca 2 +，但其活性可以是由多个其它因素，如氧化应激，腺嘌呤核苷酸耗尽，高浓度的Pi，线粒体膜去极化或解偶联，和长链脂肪酸的4调制。 在体外 ，mtPTP开口可以ACHieved线粒体基质内Ca 2 +浓度增加，通过外源添加的Ca 2 +（钙保持能力）。当Ca 2 +的水平内线粒体达到一定的阈值，mtPTP打开和促进的Ca 2 +释放的质子动力，耗散，膜电位崩溃和线粒体基质体积（肿胀）的增加，最终导致破裂的线粒体外膜和细胞器的功能不可逆转的丧失。
在这里，我们描述了一种荧光检测，允许进行全面的表征mtPTP开离体小鼠心脏线粒体。该法涉及到3线粒体发生改变时mtPTP开幕的参数，同时测量：线粒体Ca 2 +处理（吸收和释放的Ca 2 +浓度测定介质中），线粒体膜电位，并mitochondrial量。采用的染料为Ca 2 +的测定培养基及线粒体膜电位的测量的Fura FF，膜不能渗透的比例的指标，进行中的Ca 2 +和JC-1，阳离子的存在下，在激发波长的移位，形成绿色的单体或红色总量的比例指标，分别在低和高的膜电位，。线粒体量的变化记录的线粒体悬浮液的光散射测量。由于高品质，功能性线粒体所需要的的mtPTP开放试验，我们还描述了必要的步骤，以获得完整的，高度耦合和功能的离体心脏线粒体。
Protocol
1。从小鼠心脏线粒体的分离
- 分离心脏线粒体，麻醉和牺牲小鼠，根据您的当地机构动物管理和使用委员会批准的程序。
注：线粒体隔离协议的所有步骤必须执行在冰上。用冰冷的缓冲和预冷的培养皿中，Falcon管和Eppendorf管。在协议中给出的体积的样品中含有2小鼠心脏。
- 删除的心，把他们在寒冷的线粒体分离缓冲液（300 mM蔗糖，10毫米的Na-HEPES，200μMEDTA，pH值7.4），并用清水冲洗干净血液。
注意：为了获得最佳结果，线粒体缓冲液的pH值应进行调整，用KOH和醋酸的催化剂。
- 广场的心在一个寒冷的培养皿中，去除脂肪和心房，和肉细，使用刀片服务器，直到获得ING均匀的产品。
- 剁碎心中转移到50ml Falcon管中，加入10毫升含0.1毫克/毫升胰蛋白酶及线粒体隔离缓冲允许样品消化在冰上10分钟。
注：在分离过程中的胰蛋白酶分离线粒体和增加产量之间线粒体制剂应保持不变。我们建议，测试筹备分离的线粒体功能是胰蛋白酶的情况下，以确保酶的功能，不干扰。
- 线粒体分离缓冲液中加入10毫升的0.1％的脂肪酸游离BSA和5 mg胰蛋白酶抑制剂（大豆）和混合颠倒离心管数次中的胰蛋白酶。
注：线粒体隔离缓冲可以预先准备的，并且可以被存储于-20℃下检查解冻后的pH值。胰蛋白酶，胰蛋白酶抑制剂或BSA必须是一个dded实验当天的线粒体隔离缓冲。
- 恢复消化组织由低到中速离心1分钟，在4°C
- 重悬组织在8毫升线粒体分离缓冲液用0.1％的脂肪酸BSA和同质化用聚四氟乙烯杵（4-6的通行证在1,200-14,00转）使用机动Dounce匀浆器。而同质化，保持样品在冰。
- 在800xg转移入15ml Falcon管中，离心匀浆10分钟，在4℃下沉淀细胞核和组织碎片。
- 含有线粒体到Eppendorf管中并离心，以8,000 xg离心15分钟，回收上清液在4℃下
- 小心删除顶白层，并用剩余的较深的颗粒在1毫升线粒体隔离缓冲中含有的线粒体。
- 在8000xg离心15分钟，在4℃下弃上清，重悬线粒体颗粒在150微升线粒体伊索拉杂交缓冲液。查看线粒体进一步测定在冰上。
注：为了达到最佳效果，在功能性检测，使用线粒体隔离4小时内。
- 量化线粒体蛋白，用Bradford法。
2。分离线粒体的质量控制
2.1。测量呼吸控制率（RCR）
- ，校准Oxytherm氧电极用空气饱和水建立的最大氧气线。当氧得到一个稳定的水平，加入100微升新鲜制备的10mM的亚硫酸氢钠溶液建立零氧线。在30°C进行测量
- 加入2 ml线粒体呼吸用1μM鱼藤酮的Oxytherm室的缓冲液（125 mM KCl中的20mM HEPES，3毫摩尔的MgCl 2，400μMEGTA，300μMDTT，5mM的KH 2 PO 4，pH为7.2），密封腔室并启动收音丁。
- 当氧信号是稳定的，添加250微克线粒体和记录的基础呼吸1分钟。在这一点上应该是非常低的呼吸，线粒体呼吸作用的内源性底物（呼吸状态1）。
- 添加5mM的琥珀酸酯和1分钟的记录信号。耗氧量增加在状态2呼吸。
- 加入150μMADP诱导状态3呼吸。在这一点上氧的消耗增加，因为通过氧化磷酸化合成ATP。记录信号，直到呼吸减慢，这表明的ADP消费和过渡到状态4呼吸。记录状态4呼吸至少1分钟。
- 添加1μM的CCCP并记录信号，1分钟。非耦合的呼吸应该是最大的。
注：CCCP线粒体呼吸的影响是剂量依赖性的高浓度的CCCP能抑制氧的消耗，因此应仔细吨itrated。
- 状态3呼吸期间由在状态4期间呼吸的氧消耗率除以氧消耗率计算呼吸控制率（RCR）。的目标RCR应≥4。
2.2。评估线粒体膜的完整性（细胞色素C测试）
- 彻底洗净Oxytherm的腔室用70％乙醇和水，并重复步骤2.1.2 -2.1.4。
- 加入1 mM的ADP和记录氧气消耗为1分钟。
- 添加10μM细胞色素c。由于细胞色素c的完整的线粒体膜是不可渗透的，呼吸增加表示断裂或损坏的线粒体膜。
3。测量的线粒体通透性转换孔开放
- 设置荧光光谱仪，多参数测量的mtPTP开放。使用FelixGx程序，创建一个新的硬件配置（广达主稳步站特），其包括光源，激发单色器，样品室和两个检测器的激发单色器（ 图4）相对于定位在90°和270°。为了达到最大的时间分辨率，发射波长（90°和270°）必须被禁止，排放过滤器的样品室，在90°和270°的硬件配置菜单中启用。此步骤将删除的发射波长的电机控制设备，每个单色器和固定在一个特定的波长。如果没有被禁用的发射波长，每个探测器将两个波长之间的循环和重复测量将被记录下来。
- 创建一个新的收购协议用染料类型多，并输入以下染料：
- 的Fura（高Ca + +）：激发340nm，发射波长525 nm（检测器1）
- 的Fura（低Ca + +）：激发380nm的发射检测器1（525纳米）
- JC1（总）：激发543 nm的，发射波长595nm（检测器）
- JC1（单体）：激发498 nm处，发射波长525 nm（检测器1）
- 肿胀：激发波长525 nm，发射波长525 nm（检测器）
- 设置的激发和发射狭缝为1 nm至37℃的温度
- 要获得比例的Fura和JC-1信号，产生两个派生的痕迹：的Fura（高Ca + +）/的Fura（低Ca + +）和：JC1（合计）/ JC1（单体）。
- 手动调整检测器1和2到525 nm和595nm处的发射波长，分别。
- 线粒体混合1毫升分析缓冲液（120毫摩尔NaCl，10 mM KCl中，1mM的KH 2 PO 4，20mM的HEPES的Tris，pH值7.2），鱼藤酮，用1μM5mM的琥珀酸和800纳米的Fura FF在一次性4双面甲基丙烯酸甲酯试管中。添加250微克线粒体和地方样品在样品室。确保磁力搅拌器接通。
- 开始记录。 1分钟后，暂停收购，加入500 nM的JC-1，然后重新启动一个cquisition。 JC-1的比例信号应该增加，说明染料的吸收活跃的线粒体。继续录制JC-1“信号，直到已达到了高原（通常在5分钟内）。
- 添加20μM 氯化钙 。应遵守的Fura FF比信号的瞬时增加，所增加的Ca 2 +在检测缓冲液，其次是由于线粒体Ca 2 +摄取逐渐减少。 JC-1的比例信号，应表现出短暂下降表示轻微的线粒体膜去极化。
- 等待，直到基础水平之前，除了另一氯化钙脉冲（1-1.5分）的Fura FF比信号返回。继续脉冲以固定的时间间隔，直到线粒体不能积累的Ca 2 +和开始到测定缓冲液释放Ca 2 +的 。 mtPTP开口是可视化的同时增加的Fura FF比信号由于对Ca 2 +释放的JC-1信号的比率，减少由于膜POTE周期边值 问题PBVP崩溃，而且在光散射减少由于线粒体肿胀（ 图5）。
- mtPTP激活之后，验证的Fura FF，JC-1和肿胀信号的特异性分别为1mM的EGTA，1μMCCCP和5微克/毫升丙甲菌素。
- 为了验证特异性的mtPTP开放，重复步骤3.6 - 3.9中存在的1μM的亲环蛋白D抑制环孢素A（亲环素D是一个组件的mtPTP）。在环孢霉素A，开放的mtPTP需要明显更氯化钙的2个脉冲比对照样品（ 图6）。
4。代表性的成果
图2显示了一个典型的小鼠离体心脏线粒体呼吸控制。状态3呼吸是通过加入ADP线粒体呼吸的上琥珀酸，由氧的消耗显着增加，其特征在于，相对于向substra德孤单。加入ADP启动状态，在此期间，呼吸耗氧量的放缓，是媲美率达到之前ADP此外耗尽。 RCR是通过将状态3呼吸的状态4呼吸的氧气消耗率。细胞色素 c的测试用于测定线粒体膜外的完整性：细胞色素 c被添加到线粒体呼吸的琥珀酸和ADP，观察不再增加呼吸时，表示一个完整的外线粒体膜（ 图3）。
如图4所示，在离体心脏线粒体的mtPTP开放的代表图像。在这种情况下，通过加入4 CaCl 2的脉冲（20μM）在1.5分钟的间隔。触发mtPTP开口几乎同时发布的线粒体Ca 2 +（增加的Fura FF比信号），氧代谢的崩溃是明显的mtPTP开幕里亚尔膜电位（减少JC-1比信号）和增加线粒体体积（减少溶胀信号）。当环孢素A被添加，其中结合到亲环素D成分mtPTP，mtPTP开口需要7个脉冲的CaCl 2，而不是4（ 图5）。
图1。的多参数线粒体通透性转换孔开放的协议离体心脏线粒体的流程图。心是收获的小鼠，并通过差速离心分离线粒体。线粒体制剂然后定性评估用极谱测量中存在的细胞色素 c的呼吸控制比和线粒体膜完好。在分离线粒体线粒体通透性转换孔开放所引发的顺序的CaCL 2的补充和与一个荧光分光光度计测定监察释放Ca 2 +从线粒体膜电位崩溃和肿胀的线粒体基质中。
图2的测量 离体心脏线粒体呼吸控制率（RCR）。离体心脏线粒体氧消耗期间测量状态3呼吸琥珀酸酯和ADP的存在下，和在状态4期间呼吸后ADP消费。分离线粒体解偶联剂的反应，测定由加入CCCP。图表上的数字是在纳摩尔/分钟/ mg蛋白分离的线粒体的氧消耗率。
图3测量的离体心脏线粒体膜的完整性。线粒体膜的完整性被确定琥珀酸盐的存在下，和ADP和之后的细胞色素 c的此外，通过测量氧的消耗，在分离的线粒体。图表上的数字是在纳摩尔/分钟/ mg蛋白分离的线粒体的氧消耗率。
图4。荧光光谱仪的硬件配置为多参数测量的mtPTP开幕。的硬件配置的荧光分光光度计，包括光源，激发单色器，样品室和两个检测器，与固定发射波长在525nm和595 nm。检测器1被用于信号检测的Fura FF高和低的Ca 2 +，JC-1单体和溶胀信号。探测器测量JC-1总的信号。
图5。多参数在离体心脏线粒体测量的mtPTP开幕。所引发的顺序增加20μM 氯化钙和mtPTP开放为特征的Ca 2 +释放的线粒体，线粒体膜电位崩溃，增加线粒体基质体积（肿胀）。线粒体外的Ca 2 +的比例指标的Fura FF（绿线）和JC-1（红色线）和膜电位的测量。线粒体肿胀记录（黑迹线）为525 nm的光散射测定。 JC-1的特异性和肿胀信号进行了测试用1μMCCCP和5微克/毫升丙甲菌素（微生物毒素）。
图6的多参数测量的mtPTP开在离体心脏线粒体中存在的环孢素A环孢素A（1μM）CaCl 2的脉冲需要，打开mtPTP在离体心脏线粒体的数量增加。
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Discussion
这里介绍的协议描述了必要的实验步骤隔离小鼠心脏线粒体通透性转换孔开放，以评估在离体心脏线粒体（ 图1和图4）：过程，呼吸控制，确保其完整性和功能，线粒体期间监测参数mtPTP开放和他们的测量采用的染料，成立荧光分析仪器，表征mtPTP开幕。在本协议中的荧光分光光度计采用允许同时这三个参数的快速测量。然而，可以采用使用其它市售仪器的基本协议，尽管与时间分辨率下降。非比例染料也可以，但不进行定量措施都Ca 2 +和线粒体膜电位的5。
一质量好线粒体时，测定的mtPTP的开幕准备是必不可少的，因为两者的积累能力的Ca 2 +和维持膜电位是紧密相互关联的。例如，我们发现，线粒体与低RCR表现出减少的JC-1的积累和差的Ca 2 +动员。隔离心线粒体的过程中，我们使用的是改编自先前公布的协议，6，7，被证明是非常一致的生成高质量的线粒体RCR和细胞色素 c的测试测量。
打开的mtPTP是一个复杂的现象，涉及解剖学和生理学中的线粒体在几个层次上的变化。我们在这里描述的分析化学荧光法测定线粒体外Ca 2 +水平变化的同时，线粒体膜电位和线粒体体积。在同一时间的多个参数的测量提供了一个更comprehe，多元化图片的现象比单独测量的单个参数，如Ca 2 +动员或肿胀。此外，Ca 2 +和膜电位测量的比例染料的Fura FF和JC-1的用法限制工件有关的染料浓度，吸收或光漂白实验。这些染料也可以很容易地校准，以获得更多的定量测量。一个重要的发现是，所有的染料浓度应保持尽可能低，以避免干扰线粒体呼吸和膜电位作为以及作为敏感mtPTP的开幕。在我们的手中，JC-1浓度高于1μM减少了1-2个脉冲需要打开mtPTP的的脉冲数。因此，适当的控制应执行通过不包括染料和记录其他参数（如肿胀单独）的是确保需要打开的PTP的脉冲数保持一致。
在本协议我们已测定线粒体呼吸作用的复合体II基板琥珀酸在鱼藤酮的存在下，抑制反向电子输送，从复合体II复杂I.其他呼吸基板mtPTP开口可以用作，如丙酮酸/苹果酸盐支持呼吸对复杂一，但是，基板相关的差异的数量的Ca 2 +所需脉冲打开mtPTP已报道8。用于测量的mtPTP的开口部相同的协议，可以采用与线粒体隔离从不同的组织或细胞系。我们已经成功地利用这个协议，肝脏，肌肉和脑线粒体，虽然数量的Ca 2 +脉冲需要触发的mtPTP开放是组织相关的报道9，10。线粒体隔离协议必须进行调整和优化，每一个组织或细胞系的具体要求，对于同质化过程和隔离的缓冲器11日，12
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了HL094536（BJH）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
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