Summary
単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む
Abstract
ミトコンドリア透過性遷移孔（mtPTP）が1.5 kDaのより小さい分子量を有する溶質を輸送するためにミトコンドリア内膜で形成し、非特定のチャンネルです。細孔の決定的な分子的同一性が議論中であるが、そのようなシクロフィリンD、VDACとANTのようなタンパク質は、形成をmtPTPに貢献します。細胞死におけるmtPTP開口部の関 与は十分に1を確立されている間、累積証拠はmtPTPは、ミトコンドリアのCa 2 +恒常性2、バイオエナジェティックスと3シグナル伝達レドックス中に生理的な役割を果たしていることを示しています。
mtPTP開口部はマトリックスのCa 2 +が、その活性は、酸化ストレスなどのいくつかの他の要因によって変調することができ、アデニンヌクレオチド枯渇、Piの高濃度、ミトコンドリア膜の脱分極や脱共役、および長鎖脂肪酸酸4。 インビトロ 、mtPTPによってトリガされる開口部は、ACHすることができますCa 2 +の外因性の追加（カルシウム保持能力）を介してミトコンドリアのマトリックス内のCa 2 +濃度を増加させることによりieved。 のCa 2 +レベルのミトコンドリア内部の特定のしきい値に達したときに、mtPTPが開き、のCa 2 +放出を容易にする 、プロトン駆動力の損失、膜電位が崩壊し、最終的に破裂につながるミトコンドリアマトリックス容積（腫れ）の増加ミトコンドリア外膜およびオルガネラ機能の不可逆的な損失。
ここでは、単離ミトコンドリアマウス心臓におけるmtPTP開口部の総合的な特性評価を可能にする蛍光分析について説明します。ミトコンドリアのCa 2 +ハンドリング（取り込みと放出は、Ca 2によって測定されたアッセイ培地中+濃度）、ミトコンドリア膜電位、及びmitocho：アッセイはmtPTP開口部が発生したときに変更されている3つのミトコンドリアのパラメータの同時測定を含むndrialボリューム。アッセイ培地とミトコンドリア膜電位のCa 2 +測定を採用染料はフラFF、膜透過性は、Ca 2 +の存在下で励起波長のシフトを受けるレシオメトリックインジケータ、JC-1は、カチオン性であり、それぞれ、低域と高膜電位でグリーンモノマー又は赤凝集体を形成レシオメトリックインジケータ。ミトコンドリアの体積の変化はミトコンドリア懸濁液による光散乱を記録することによって測定されます。高品質で機能的なミトコンドリアがmtPTP開アッセイに必要とされるため、我々はまた、無傷ミトコンドリア、高度に結合されており、機能的な孤立した心を得るために必要な手順について説明します。
Protocol
1。マウスの心臓からミトコンドリアの単離
- 心臓がミトコンドリア単離するためには、あなたの地元の施設内動物のケアと使用委員会によって承認された手順に従って、マウスを麻酔し、生け贄に捧げる。
注：ミトコンドリア単離プロトコルのすべてのステップは、氷上で行う必要があります。氷冷緩衝液及び予冷ペトリ皿、ファルコンチューブ、エッペンドルフチューブを使用しています。プロトコルで指定されたボリュームは2マウスの心臓を含むサンプル用です。
- 、心を取り除く冷たいミトコンドリア単離緩衝液（300 mMスクロース、10mMのNa-HEPES、200μMのEDTA、pH7.4）に置き、血を洗い流す。
注：最適な結果を得るためには、ミトコンドリアの緩衝液のpHをKOHと酢酸で調整する必要があります。
- 冷たいペトリ皿の上に置いて心が、脂肪と心房を削除して、取得するまで、ブレードを使用して細かくミンチ均質な製品をING。
- 50mlのFalconチューブにみじん切りにした心を移し、0.1 mg / mlのトリプシンを用いてミトコンドリア単離緩衝液10mlを加え、サンプルを氷上で10分間消化することができます。
注：分離手順中にトリプシンが単離されたミトコンドリアの収率を増加させ、ミトコンドリアの準備の間に一定に保つ必要があります。我々は、単離された調剤のミトコンドリアの機能をテストすると、酵素が機能を妨害しないことを保証するためにトリプシンの不在であることをお勧めします。
- 0.1パーセント脂肪酸フリーBSAおよび5 mgのトリプシンインヒビター（大豆）とミトコンドリア単離緩衝液10mlを加え、トリプシンを中和するためにチューブを転倒数回混ぜる。
注：ミトコンドリア単離緩衝液を予め用意することができ、-20℃で保存することができます解凍時のpHをチェックしてください。トリプシン、トリプシンインヒビターまたはBSAがなければなりません実験当日のミトコンドリア分離バッファへdded。
- 4℃で1分のために低〜中速の遠心分離によって消化された組織を回復
- 再懸濁し、0.1パーセント脂肪酸フリーBSAで8ミリリットルミトコンドリア単離緩衝液における組織とテフロン乳棒（1,200-14,00 rpmで4月6日経過）と電動ダウンスホモジナイザーを用いてホモジナイズする。ホモジナイズしながらサンプルを氷上に保つ。
- 4℃で10分間800xgで15mlファルコンチューブと遠心分離機にホモジネート転送℃でペレット核や組織片へ。
- 4時15分、℃、8,000 xgでエッペンドルフチューブと遠心分離機にミトコンドリアを含む上清を回収
- 慎重に上部白層を除去し、1mlのミトコンドリア分離バッファ内のミトコンドリアを含む残りの濃いペレットを洗浄する。
- 4℃で15分間8000xgで遠心℃、 150μlのミトコンドリアイゾラ清と再懸ミトコンドリアペレットを捨てるるバッファ。さらなるアッセイのための氷の上でミトコンドリア保つ。
注：機能アッセイ時の最良の結果を得るためには、分離の4時間以内にミトコンドリアを使用しています。
- ブラッドフォードアッセイを用いてミトコンドリアタンパク質を定量化する。
2。単離されたミトコンドリアの品質管理
2.1。呼吸調節率（RCR）の測定
- 最大酸素ラインを確立するために空気飽和水でOxytherm酸素電極を校正します。酸素の安定レベルはゼロ酸素ラインを確立するために、新たに調製し、10mMの亜硫酸ナトリウム溶液100μlを加えたとき。 30℃で測定を実行
- チャンバーを密閉、Oxytherm室に1μMのロテノンで2mlミトコンドリア呼吸Bufferを（125のKCl、20mMのHEPES、3mMのMgCl 2、400μMのEGTA、300μMのDTT、5mMのKH 2 PO 4、pH7.2）に追加とスタートrecor鼎。
- 酸素信号が安定していれば、1分間250μgのミトコンドリアとレコード基底呼吸を追加します。ミトコンドリアは内在性基質（状態1呼吸）で呼吸するされるこの時点で呼吸が非常に低くなければならない。
- 5mMのコハク酸と1分間記録信号を追加します。酸素消費量は、状態2呼吸の間に増加する必要があります。
- 150μMのADPを追加することで、状態3呼吸を誘導する。この時点で、酸素消費量で酸化的リン酸化によるATP合成のために増加する必要があります。記録信号呼吸がADP消費と4呼吸の状態への遷移を示して、遅くまで。少なくとも1分間レコードの状態4呼吸。
- 1μMのCCCPと1分間記録信号を追加します。切り離さ呼吸は最大でなければならない。
注：ミトコンドリアの呼吸にCCCPの効果は用量依存性である：CCCPの高濃度の酸素消費量を抑制することができるので、慎重にトンでなければなりませんitrated。
- 状態4呼吸時の酸素消費率で状態3呼吸時の酸素消費速度を分割することによって呼吸調節率（RCR）を計算します。ターゲットRCRは≥4でなければなりません。
2.2。ミトコンドリア膜の完全性の評価（ シトクロム c 試験 ）
- 徹底的に70％エタノールと水との手順を繰り返し2.1.2 -2.1.4とOxytherm室を洗う。
- 1mMのADPおよび1分間のレコード酸素消費量を追加します。
- 10μMのシトクロムcを追加します。シトクロムcが無傷ミトコンドリアの膜に不浸透性であるので、呼吸の増加が故障または破損してミトコンドリア膜を示しています。
3。ミトコンドリア透過性遷移孔の開口部の測定
- mtPTP開口部のマルチパラメータ測定用の蛍光分光光度計を設定します。 FelixGxプログラムを使用して、新しいハードウェア構成（クアンタマスター着実STAを作成TE）は、光源、励起分光器、試料室および励起分光器（ 図4）に対して90°と270°に位置する2つの検出器を含む。最大時間分解能を達成するために、両方の発光分光器（90°、270°）に無効とサンプルコンパートメントで90°と270°での発光フィルタは、ハードウェア構成のメニューで有効にする必要があります。このステップでは、発光波長のモータ制御を削除し、特定の波長で各単色光分光器を修正します。発光分光器が無効になっていない場合は、各検出器は波長と重複測定の両方の間でサイクルが記録されます。
- マルチ染料タイプを使用して新しい取得プロトコルを作成し、次の染料のように入力します。
- フラ（高Ca + +）：励起340 nmで発光525 nmの（検出器1）
- フラ（低Ca + +）：励起は380nm、発光525nmの（検出器1）
- JC1（集約）：励起543 nmの、放出595nmの（検出器2）
- JC1（モノマー）：励起498 nmであり、放出525nmの（検出器1）
- 腫れ：励起525 nmであり、放出525nmの（検出器1）
- 37℃に1 nmの励起および発光スリットと温度を設定
- フラとJC-1のレシオメトリック信号を得るために、2つの派生トレースを生成：フラ（高Ca + +）/フラ（低Ca + +）とJC1（集計）/ JC1（モノマー）。
- それぞれ手動で、検出器1と2から525 nmと595 nmの発光波長を調整します。
- 1μMのロテノン、5mMのコハク酸、800 nMの使い捨ての4面でフラFFで1ミリリットルミトコンドリアアッセイ緩衝液（120mMのKCl、10mMのNaCl、1mMのKH 2 PO 4、20mMのHEPES-トリス、pH 7.2）を混ぜてメタクリレートキュベット。サンプルコンパートメントに250μgのミトコンドリアと場所のサンプルを追加します。マグネチックスターラーの電源がオンになっていることを確認します。
- 記録を開始します。 1分後、買収を一時停止し、500nMのJC-1を追加してから再起動cquisition。 JC-1の比信号は、アクティブなミトコンドリアによる色素の取り込みを示し、増加する必要があります。 JC-1は信号がプラトー（通常は5分以内）に達するまで、記録を続けます。
- 20μMのCaCl 2を追加します。フラのFF比信号の瞬間的増加はミトコンドリアCa 2 +取り込みに起因する漸進的な減少が続いアッセイ緩衝液中で増加したCa 2 +の存在によって観察されるべきである。 JC-1の比信号はわずかミトコンドリア膜の脱分極を示す簡潔な一時的減少を示すべきである。
- 基礎レベルの前に別のCaCl 2のパルス（1〜1.5分）のほかにフラFFの比信号が戻るまで待ちます。ミトコンドリアのCa 2を蓄積できなくなるまで、一定の間隔で脈打つ続ける+と+アッセイバッファーへのCa 2を放出し始める。 mtPTP開口部はCa 2 +放出、膜poteに起因するJC-1の信号比が減少したことにより、フラFFの比率信号の同時増加によって可視化されるntial崩壊、ミトコンドリアの膨張に起因する光散乱が減少します（ 図5）。
- mtPTP活性化に続いて、1mMのEGTA、1μMCCCP及び5μg/ mlのアラメチシンでそれぞれフラFF、JC-1や腫れ信号の特異性を確認します。
- シクロフィリンD阻害剤シクロスポリン（サイクロフィリンDはmtPTPのコンポーネントである）を1μMの存在下で3.9 - mtPTP開口部の特異性を確認するには、手順3.6を繰り返します。シクロスポリンの存在下では、mtPTPを開くと、対照試料（ 図6）よりもはるかに多くのCaCl 2のパルスを必要とします。
4。代表的な結果
図2は、単離ミトコンドリアマウス心臓の典型的な呼吸制御を示しています。状態3呼吸はコハク酸でミトコンドリア呼吸するにADPを添加することによって達成され、substraに関して有意に増加した酸素消費量によって特徴付けられる単独でTE。追加されたADPの枯渇は、酸素消費量が低下し、事前のADP添加達成率に匹敵し、その間状態4呼吸を開始する。 RCRは状態4呼吸のそれによって状態3呼吸のための酸素消費速度を割ることによって得られる。 シトクロム c試験は、アッセイミトコンドリア外膜の完全性を目的に使用されます。 シトクロム cコハク酸とADP、観察される呼吸においてさらなる増加にミトコンドリアが呼吸するに追加されたときに、無傷のミトコンドリア外膜（ 図3）を示す。
ミトコンドリア単離心臓でmtPTP開口するための代表的なイメージは、 図4に示されている。この場合mtPTP開口部は1.5分間隔で4 CaCl 2のパルス（20μMずつ）を添加することによって引き起こされた。 mtPTP開口部は、ミトコンドリアCa 2 +のほぼ同時リリース+（フラのFF比信号の増加）、mitochondの崩壊によって明らかであるリアル膜電位（JC-1の比信号の減少）と増加したミトコンドリアの体積（腫れ信号の減少）。 mtPTPのシクロフィリンD成分に結合する、追加されたとき、シクロスポリン、mtPTP開口部は7 CaCl 2のパルスの代わりに4（ 図5）が必要です。
図1：ミトコンドリア単離心臓用のマルチパラメータミトコンドリア透過性遷移孔の開口プロトコルのフロー· チャート。心臓はマウスから採取され、ミトコンドリアは、差動遠心分離により分離されています。ミトコンドリアの調製物を定性的にシトクロム cの存在下で呼吸調節率およびミトコンドリア膜無傷のポーラログラフ測定によって評価されます。単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部は、シーケンシャルCACによってトリガされます2リットルの追加およびCa 2 +のミトコンドリアマトリックスのミトコンドリア膜電位の崩壊や腫れからの放出を監視することにより、蛍光分光光度計を用いて測定される。
図2の測定 ミトコンドリア単離心臓の呼吸調節率（RCR）。ミトコンドリア単離心臓の酸素消費量は状態3コハク酸とADPの存在下で、呼吸、およびADP消費後の状態4呼吸時の間に測定される。脱共役剤に単離されたミトコンドリアの応答はCCCPの添加により測定されます。グラフ上の数字は、nmol /分/ mgタンパク質の単離されたミトコンドリアによる酸素消費の料金です。
図3測定ミトコンドリア単離心臓の膜完全性のリーメント。ミトコンドリア膜の完全性は、コハク酸とADPの存在下およびシトクロム cの添加後に分離したミトコンドリアの酸素消費量を測定することによって決定される。グラフ上の数字は、nmol /分/ mgタンパク質の単離されたミトコンドリアによる酸素消費の料金です。
mtPTP開口部のマルチパラメータ測定については、 図4。光度計のハードウェア構成。蛍光分光光度計のハードウェア構成は、光源、励起モノクロメータ、試料室および525 nmと595 nmで一定の発光波長を持つ2つの検出器を含む。検出器1はフラFFのハイとローのCa 2 +、JC-1モノマー、腫れ信号の信号検出に使用されます。検出器2は、JC-1は集約信号を測定します。
図5ミトコンドリア単離心臓でmtPTP開口のマルチパラメータ測定。 mtPTP開口部は、20μMのCaCl 2およびミトコンドリア、ミトコンドリア膜電位の崩壊からのCa 2 +放出をすることによって特徴付けられ、ミトコンドリアマトリックス容積（腫れ）が増加したの逐次付加によって引き起こされました。ミトコンドリア外のCa 2 +および膜電位は、レシオメトリック指標フラFF（緑のトレース）とJC-1（赤線）を用いて測定した。ミトコンドリアの膨潤が525ナノメートル（黒いトレース）での光散乱を記録することにより測定した。 JC-1や腫れ信号の特異性は、1μMのCCCP及び5μg/ mlのアラメチシン（微生物毒素）でテストされています。
図6マルチシクロスポリンAシクロスポリン（1μM）の存在下でミトコンドリア単離心臓でmtPTP開口部のパラメータ測定は、単離ミトコンドリア中心にmtPTPを開くのに必要なCaCl 2のパルス数を増加させます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで紹介するプロトコルはミトコンドリア単離心臓（ 図1および図4）に透過性遷移孔の開口部を評価するために必要な実験手順を説明します。マウス心臓ミトコンドリアを単離するための手順を、それらの整合性と機能性を確保呼吸のコントロールは、ミトコンドリアのパラメータが中に監視mtPTP開口部とその測定に用いる染料、蛍光分光計測器のセットアップ、およびmtPTP開口部の特性評価。このプロトコルで用いられる蛍光分光光度計は、同時に、これらの3つのパラメータの迅速な測定を可能にします。しかし、基本的なプロトコルは減少時間分解能を持つとはいえ、他の市販の機器を用いて使用することができる。非レシオメトリック色素を採用することもできますが、Ca 2 +およびミトコンドリア膜電位5の両方の定量的尺度を許可していません。
AmtPTP開口部を測定する時のCa 2 +を蓄積して膜電位を維持するために、両方の能力をしっかりと相互に関係しているからです。良質ミトコンドリアの準備が不可欠ですが、例えば、我々は低RCRの展示とミトコンドリアはJC-1の蓄積と貧困のCa 2 +動員減少させることを見出した。我々は心臓ミトコンドリアを単離するために使用している手順は、以前に公開されたプロトコルは6、7から適応とRCRとシトクロム c のテストによって測定されたミトコンドリア高品質を生成する際に非常に一貫性のあることが証明された。
mtPTPの開口部は、ミトコンドリアの解剖学と生理学のいくつかのレベルでの変化を伴う複雑な現象である。私たちがここで説明するアッセイはspectrofluorometricallyミトコンドリア外のCa 2 +レベル、ミトコンドリア膜電位とミトコンドリアの体積の同時変化を測定します。同時に複数のパラメータの測定はよりcompreheを提供しています例えばCa 2単独で個々のパラメータの測定値よりも現象のnsive絵、+動員や腫れ。また、Ca 2 +および膜電位測定用のレシオメトリック染料フラFFと、JC-1の使用は、濃度、摂取または退色を染めるために関連した実験的なアーティファクトを制限します。これらの色素は、また、簡単に、より定量的な測定値を得るために校正することができます。重要な観察は、すべての色素濃度がミトコンドリア呼吸と膜電位との干渉を避けるだけでなく、mtPTP開口部を敏感に可能な限り低く保たれるべきであるということです。我々の手に、1μM上記のJC-1濃度は1-2パルスによってmtPTPを開くために必要なパルス数を減らすことができます。したがって、適切なコントロールが染料を除くとPTPを開くために必要なパルス数は一貫性を保つことを確認するために、他のパラメータ（例えば、単独で腫れなど）を記録することによって行われるべきである。
このプロトコルを通して我々は、このような複雑で呼吸をサポートするピルビン酸/リンゴ酸塩として、同様に使用することができるミトコンドリア複合体IIから複雑I.その他の呼吸器基板に逆電子輸送を阻害ロテノンの存在下で複合体IIの基質、コハク酸で呼吸するためmtPTP開口部を測定してきたI.はしかし、mtPTPを開くために必要な基板関連のCa 2 +の数の違い+パルスは8が報告されている。 mtPTP開口部を測定するための同じプロトコルが異なる組織または細胞株から単離されたミトコンドリアと共に用いることができる。 +パルスはmtPTP開口部をトリガするのに必要なCa 2 +の数が、我々は成功し、肝臓、筋肉、脳ミトコンドリアのこのプロトコルを利用してきた以前に報告された（9）（10）などの依存組織であった。ミトコンドリア単離プロトコルは、均質化手順および分離バッファ11,12に関する特定の要件のために、各組織または細胞ラインに適応し、最適化する必要があります
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品はHL094536（BJH）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. Jr The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
