Summary
Ett spektrofluorometrisk protokoll för mätning av mitokondriell permeabilitet övergången pore öppning i isolerad mus hjärta mitokondrier presenteras här. Analysen involverar samtidig mätning av mitokondrier Ca
Abstract
Den mitokondriella permeabilitet övergång porer (mtPTP) är en icke specifik kanal som bildas i det inre mitokondriemembranet att transportera lösta ämnen med en molekylvikt mindre än 1,5 kDa. Även om den definitiva molekylära identitet por är fortfarande under debatt, proteiner såsom cyklofilin D VDAC och ANT bidrar till mtPTP bildas. Även medverkan mtPTP öppning i celldöd är väl etablerad 1, ackumulerande bevis tyder på att mtPTP serverar en fysiologisk roll under mitokondriell Ca 2 + homeostas 2, bioenergetik och redox signalering 3.
mtPTP öppning utlöses av matris Ca 2 +, men dess aktivitet kan moduleras av flera andra faktorer såsom oxidativ stress, adeninnukleotid utarmning, höga koncentrationer av Pi, mitokondrie membrandepolarisering eller påhängsvagn, och långkedjiga fettsyror 4. In vitro mtPTP öppning kan ACHieved genom att öka Ca 2 + koncentrationen inuti den mitokondriella matrisen genom exogena tillsatser av Ca 2 + (kalcium retentionskapacitet). När Ca 2 + nivåer inuti mitokondrier når en viss tröskel, öppnas mtPTP och underlättar Ca 2 + frisättning, avledning av protonen drivkraft, membranpotentialen kollaps och en ökning av mitokondriella matrisen volym (svullnad) som slutligen leder till bristning av yttre mitokondriemembranet och oåterkallelig förlust av organell funktion.
Här beskriver vi en fluorometrisk analys som möjliggör en omfattande karakterisering av mtPTP öppning i isolerad mushjärta mitokondrier. Analysen innefattar samtidig mätning av 3 mitokondriella parametrar som förändras när mtPTP öppning inträffar: mitokondriell Ca 2 + hantering (upptag och frisättning, såsom mätt genom Ca 2 +-koncentrationen i analysmedium), mitokondriell membranpotential, och mitochondrial volym. De färgämnen som används för Ca 2 + mätning i analysmediet och mitokondriell membranpotential är Fura FF, ett membran ogenomträngligt, kvotmetrisk indikator som genomgår en förändring i excitationsvåglängd i närvaro av Ca 2 +, och JC-1, en katjonisk, ratiometrisk indikator som bildar gröna monomerer eller röda aggregat vid låg och hög membranpotential, respektive. Förändringar i mitokondriernas volym mäts genom att registrera ljusspridning av det mitokondriella fjädring. Eftersom hög kvalitet, funktionell mitokondrier krävs för mtPTP öppna analysen beskriver vi också de åtgärder som krävs för att få intakt, mycket kopplat och funktionell isolerad hjärta mitokondrier.
Protocol
1. Isolering av mitokondrier från mushjärta
- För att isolera hjärta mitokondrier, söva och offra möss enligt de förfaranden som godkänts av den lokala institutionella Animal Care och användning kommittén.
Obs: Alla steg i mitokondrierna isolering protokollet måste utföras på is. Använd iskalla buffertar och pre-kylda petriskålar, Falcon rör och Eppendorf rör. De volymer som anges i protokollet är för ett prov som innehåller 2 mus hjärtan.
- Ta hjärtan, placera dem i kallt Mitokondrier Isolation buffert (300 mM sackaros, 10 Na-HEPES mm, 200 M EDTA, pH 7,4) och skölj av blod.
Obs: För bästa resultat bör pH mitokondriella buffertar justeras med KOH och ättiksyra.
- Placera hjärtan på en kall petriskål, ta bort fett och Atria och finhacka fint med en kniv tills fåING en homogen produkt.
- Överför hackad hjärtan till en 50 ml Falcon-rör, tillsätt 10 ml av mitokondrier Isolering buffert med 0,1 mg / ml trypsin och låta provet att smälta på is i 10 min.
Obs: Trypsin under isoleringsförfarandet ökar utbytet av isolerade mitokondrier och ska hållas konstant mellan mitokondriella preparat. Vi rekommenderar testning mitokondriella funktioner på isolerade preparat är frånvaron av trypsin för att säkerställa att enzymet inte stör funktionalitet.
- Tillsätt 10 ml Mitokondrier Isolering buffert med 0,1% fettsyrafri BSA och 5 mg trypsininhibitor (sojaböna) och blanda genom att vända röret flera gånger för att neutralisera trypsin.
Obs: Mitokondrier Isolering buffert kan framställas i förväg och kan lagras vid -20 ° C. Kontrollera pH-värdet vid tining. Trypsin, trypsininhibitor eller BSA måste vara endded den Mitokondrier isolering buffert på dagen för experimentet.
- Återställa de uppdelade vävnaden genom lägsta till medelhög hastighet centrifugering i 1 min vid 4 ° C.
- Resuspendera vävnad i 8 ml Mitokondrier Isolering buffert med 0,1% fettsyrafri BSA och homogenisera med en motordriven Dounce-homogenisator med en Teflon mortelstöt (4-6 passager vid 1,200-14,00 rpm). Håll provet på is under homogenisering.
- Överför homogenatet i en 15 ml Falcon-rör och centrifugera vid 800 x g under 10 minuter vid 4 ° C för att pelletera kärnor och vävnadsrester.
- Återvinn supernatanten innehållande mitokondrier i Eppendorf-rör och centrifugera vid 8.000 xg under 15 minuter, vid 4 ° C.
- Ta försiktigt upp vita lagret och tvätta den återstående mörkare pellets innehåller mitokondrierna i 1 ml Mitokondrier Isolering buffert.
- Centrifugera vid 8000xg under 15 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera mitokondrier pelleten i 150 ul mitokondrie Isolaning Buffer. Håll mitokondrierna på is för ytterligare analyser.
Obs: För bästa resultat under funktionella analyser, använd mitokondrier inom 4 timmar av isolering.
- Kvantifiera mitokondrieprotein användning av Bradford-analysen.
2. Kvalitetskontroll av isolerade mitokondrier
2,1. Mätning av respiratorisk kontroll (RCR)
- Kalibrera Oxytherm syreelektroden med luft-mättat vatten för att fastställa gränsvärdena syre linjen. När en stabil nivå av syre erhålls tillsätt 100 pl av en nyframställd 10 mM natriumhydrosulfit-lösning för att fastställa noll syre linjen. Utföra mätningar vid 30 ° C.
- Tillsätt 2 ml Mitokondrier Respiration buffert (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM MgCb 2, 400 iM EGTA, 300 pM DTT, 5 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) med 1 pM rotenon till Oxytherm kammaren, täta kammaren och start RECORding.
- När syre signalen är stabil, tillsätt 250 | ig mitokondrier och spela basala andning under 1 min. Det andning vid denna punkt bör vara mycket låg eftersom mitokondrier som respirerande på endogena substrat (staten 1 andning).
- Lägg 5 mM succinat och inspelningssignalen under 1 min. Syreförbrukning bör öka under staten 2 andning.
- Inducera staten 3 andning genom att lägga 150 iM ADP. Vid denna punkt syreförbrukning skulle öka till följd av syntes av ATP genom oxidativ fosforylering. Inspelningssignalen tills andning saktar, vilket indikerar ADP konsumtion och övergång till tillstånd 4 andning. Rekord staten 4 andning under minst 1 minut.
- Tillsätt 1 M CCCP och inspelningssignalen i 1 min. Okopplade andning ska vara maximal.
Obs: Effekten av CCCP på mitokondriell andning är dosberoende: höga koncentrationer av CCCP kan hämma syreförbrukning och bör därför noggrant titrated.
- Beräkna luftvägarna kontroll (RCR) genom att dividera takt syreförbrukning under statens 3 andning genom syreförbrukningshastigheten under staten 4 andning. Ett mål RCR bör vara ≥ 4.
2,2. Bedömning av mitokondriemembranbarriären (cytokrom c-test)
- Skölj Oxytherm kammaren med 70% etanol och vatten och upprepa steg 2.1.2 -2.1.4.
- Tillsätt 1 mM ADP och spela syreförbrukning under 1 min.
- Lägg 10 iM cytokrom c. Eftersom cytokrom c är ogenomträngligt för intakta mitokondriemembranen, indikerar en ökning av andning brutna eller skadade mitokondriemembranen.
3. Mätning av mitokondrie Permeabilitet Transition poröppning
- Ställa in spektrofluorometer för flera parametrar mätning av mtPTP öppning. Med hjälp av FelixGx programmet, skapa en ny hårdvarukonfiguration (Quanta Master stadig state) innefattande ljuskällan, excitation monokromator, provsektionen och två detektorer placerade vid 90 ° och 270 ° med avseende på excitations monokromatorn (figur 4). För att uppnå maximal tidsupplösning, måste båda utsläpp monokromatorer (90 ° och 270 °) vara inaktiverat och utsläpp filter vid 90 ° och 270 ° i urvalet facket aktiverad i maskinvaran konfigurationsmenyn. Detta steg kommer att ta bort motorstyrning av emissionsvåglängderna och fixa varje monokromator vid en viss våglängd. Om utsläpp monokromatorer inte är inaktiverade kommer varje detektor cykel mellan de båda våglängderna och dubbla mätningar kommer att registreras.
- Skapa ett nytt förvärv protokoll med Multi Dye typ och ange följande färgämnen:
- Fura (hög Ca + +): excitation 340 nm, emission 525 nm (detektor 1)
- Fura (lågt Ca + +): excitation 380 nm, emission 525 nm (detektor 1)
- JC1 (totalt): excitation 543 nm, Utsläpp 595 nm (detektor 2)
- JC1 (monomer): excitation 498 nm, emission 525 nm (detektor 1)
- Svullnad: excitation 525 nm, emission 525 nm (detektor 1)
- Ställ excitation och emission slitsar till 1 nm och temperaturen till 37 ° C.
- För att erhålla den kvotmetriska signalen för Fura och JC-1, generera två härledda spår: Fura (hög Ca + +) / Fura (lågt Ca + +) och JC1 (aggregat) / JC1 (monomer).
- Manuellt justera emissionsvåglängden av detektorer 1 och 2 till 525 nm och 595 nm, respektive.
- Blanda 1 ml Mitokondrier analysbuffert (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) med 1 pM rotenon, 5 mM succinat och 800 nM Fura FF i en engångs 4-sidig metakrylat kyvett. Tillsätt 250 | ig mitokondrier och plats prov i provsektionen. Kontrollera att den magnetiska omröraren påslagen.
- Starta inspelningen. Efter 1 minut, pausar förvärvet lägger 500 nM JC-1 och sedan starta om encquisition. JC-1 ratio-signal bör öka, vilket indikerar färg upptag av aktiv mitokondrier. Fortsätta inspelningen tills JC-1-signal har nått en platå (vanligtvis inom 5 min).
- Lägg 20 iM CaCla 2. En momentan ökning Fura FF förhållande signal bör observeras av den ökade Ca 2 + närvaro i analysbufferten, följt av en gradvis minskning till följd av mitokondriell Ca 2 + upptag. JC-1-förhållande signal skall uppvisa en kort övergående minskning indikerar lätt mitokondriemembranet depolarisering.
- Vänta tills Fura FF återvänder förhållande signal till basnivå före tillsats av en annan CaCla 2 puls (1-1,5 minuter). Fortsätt pulserande vid fasta intervall tills mitokondrier inte kan ansamlas Ca 2 + och börja släppa Ca 2 + i analysbufferten. mtPTP öppning är visualiseras genom en samtidig ökning i Fura FF förhållandet signal på grund av Ca 2 + frisättning, en minskning i JC-1-signalen förhållande grund membran potential kollaps och en minskning i ljusspridning på grund mitokondriell svullnad (Figur 5).
- Efter mtPTP aktivering kontrollera specificitet Fura FF, JC-1 och svullnad signaler respektive med 1 mM EGTA, 1 M CCCP och 5 ng / ml alamethicin.
- För att verifiera specificitet mtPTP öppning upprepa steg från 3,6 till 3,9 i närvaro av 1 M av cyklofilin D-hämmare cyklosporin A (cyklofilin D är en del av mtPTP). I närvaro av cyklosporin A, öppning av mtPTP kräver betydligt mer CaCl 2 pulser än kontrollprover (Figur 6).
4. Representativa resultat
Figur 2 visar en typisk respiratorisk kontroll av isolerad mushjärta mitokondrier. Tillstånd 3 andning uppnås genom tillsats av ADP till mitokondrier respirerande på succinat, och kännetecknas av signifikant ökad syreförbrukning med avseende på substrate ensam. Utarmning av tillsatt ADP initierar State 4 andning, under vilken syreförbrukning saktar och är jämförbar med priser uppnådda före ADP tillägg. RCR erhålls genom att dividera den hastighet syreförbrukning för statligt 3 andning av den statliga 4 andning. Den cytokrom c test används för att analysera integriteten hos det yttre mitokondriemembranet: när cytokrom c sätts till mitokondrier respirerande på succinat och ADP, ingen ytterligare ökning av andning observeras, vilket indikerar en intakt yttre mitokondriemembranen (Figur 3).
En representativ bild för mtPTP öppningen i isolerat hjärta mitokondrier visas i figur 4. I detta fall mtPTP öppning utlöstes genom tillsats av 4 CaCl 2 pulser (20 pM vardera) vid 1,5 minuters intervall. mtPTP öppning framgår av den nära samtidiga lanseringen av mitokondriell Ca 2 + (öka Fura FF förhållande signal), kollaps mitochondterial membranpotential (minskning i JC-1-förhållande signal) och ökad mitokondrie volym (minskning av svullnad signalen). När cyklosporin A tillsätts binder som till cyklofilin D komponenten i mtPTP kräver mtPTP öppning 7 pulser av CaCla 2 istället för 4 (Figur 5).
Figur 1. Flödesschema för flera parametrar mitokondriell permeabilitet övergång poröppning protokoll för isolerad hjärta mitokondrier. Hjärta skördas från möss och mitokondrier är isolerade genom differentiell centrifugering. Den mitokondriella beredningen sedan kvalitativt utvärderas genom polarografisk mätning av respiratoriska kontrollen förhållandet och mitokondriemembranet intakthet i närvaro av cytokrom c. Mitokondriell permeabilitet övergång poröppning i isolerade mitokondrier utlöses av sekventiell CaCl 2 tillägg och mäts med en spektrofluorometer genom att övervaka Ca 2 + frisättning från mitokondrier, membranpotentialen kollaps och svullnad av den mitokondriella matrisen.
Figur 2. Mätning av respiratorisk kontroll (RCR) i isolerat hjärta mitokondrier. Syreförbrukning av isolerad hjärta mitokondrier mäts under statens 3 andning i närvaro av succinat och ADP, och under statens 4 andning efter ADP konsumtion. Svaret hos isolerade mitokondrier för uncouplers mäts genom tillsats av CCCP. Siffrorna i diagrammet är andelen syreförbrukning av isolerade mitokondrier i nmol / min / mg protein.
Figur 3. Mät ning av membran integritet isolerat hjärta mitokondrier. Mitokondriemembranbarriären bestäms genom att mäta syreförbrukningen i isolerade mitokondrier i närvaro av succinat och ADP och efter tillsats av cytokrom c. Siffrorna i diagrammet är andelen syreförbrukning av isolerade mitokondrier i nmol / min / mg protein.
Figur 4. Spektrofluorometer maskinvarukonfiguration för flera parametrar mätning av mtPTP öppning. Den maskinvarukonfiguration spektrofluorometer innefattar en ljuskälla, en excitation monokromator, en provsektionen och två detektorer med fasta emissionsvåglängder vid 525 nm och 595 nm. Detektor 1 används för signaldetektering av Fura FF hög och låg Ca 2 +, JC-1 monomer och den svällande signalen. Detektor 2 mäter JC-1 aggregat signal.
Figur 5. Flera parametrar mätning av mtPTP öppning i isolerat hjärta mitokondrier. mtPTP öppning utlöstes genom sekventiella tillsatser av 20 pM CaCla 2 och kännetecknas av Ca 2 + frisättning från mitokondrier, mitokondriell membranpotential kollaps och ökad mitokondriella matrisen volym (svullnad). Extramitochondrial Ca 2 + och membranpotentialen mättes med den kvotmetriska indikatorerna Fura FF (grön spår) och JC-1 (röd spår). Svullnad av mitokondrier mättes genom att registrera ljusspridning vid 525 nm (svart spår). Specificitet av JC-1 och svullnad signaler testades med 1 pM CCCP och 5 pg / ml alamethicin (en mikrobiell toxin).
Figur 6. Multi-Parametern mätning av mtPTP öppning i isolerat hjärta mitokondrier i närvaro av cyklosporin A. Cyklosporin A (1 | iM) ökar antalet CaCl 2 pulser som krävs för att öppna mtPTP i isolerat hjärta mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras här beskriver de nödvändiga experimentella åtgärder för att bedöma permeabilitet öppning övergång por i isolerat hjärta mitokondrier (figur 1 och figur 4): förfarandet för att isolera mus hjärta mitokondrier, de respiratoriska kontroller som säkerställer deras integritet och funktionalitet de mitokondriella parametrar övervakas under mtPTP öppning och färgämnena som används för deras mätning, inrättandet av den spektrofluorometrisk instrumentering och karakterisering av mtPTP öppning. Den spektrofluorometer används i detta protokoll möjliggör snabb mätning av dessa tre parametrar samtidigt. Emellertid kan det grundläggande protokollet kan användas med användning av andra kommersiellt tillgängliga instrument, om än med minskad tidsupplösning. Icke-kvotmetriska färgämnen kan också användas, men inte medger kvantitativa mått på både Ca 2 + och mitokondriell membranpotential 5.
ENgod kvalitet mitokondriell förberedelse är nödvändig när analys av mtPTP öppningen, eftersom både förmågan att ackumulera Ca 2 + och bibehålla en membranpotential är tätt förbundna med varandra. Till exempel fann vi att mitokondrierna med låg RCR uppvisar reducerad JC-1 ackumulering och dålig Ca 2 + mobilisering. Förfarandet vi använder för att isolera hjärta mitokondrier anpassades från tidigare publicerad protokoll 6, 7 och visade sig vara mycket konsekvent i att skapa högkvalitativa mitokondrier mätt med RCR och cytokrom C tester.
Öppnande av mtPTP är en komplex företeelse som involverar förändringar på flera nivåer i mitokondriella anatomi och fysiologi. Analysen beskriver vi här mäter spectrofluorometrically de samtidiga förändringarna i extramitochondrial Ca 2 + nivåer, mitokondriell membranpotential och mitokondriell volym. Mätningen av flera parametrar samtidigt erbjuder en mer comprehensive bild av fenomenet än mätning av enskilda parametrar enbart, såsom Ca 2 + mobilisering eller svullnad. Dessutom begränsar användningen av kvotmetriska färgämnen Fura FF och JC-1 för Ca 2 + och membranpotentialen mätningar experimentell artefakt relaterad till färgämneskoncentration, upptag eller fotoblekning. Dessa färgämnen kan också lätt kalibreras för att erhålla mer kvantitativa mätningar. En viktig iakttagelse är att alla preparat koncentrationer bör hållas så låg som möjligt för att undvika störningar mitokondrier andning och membranpotential samt sensibilisera mtPTP öppning. I vår händer JC-1 koncentrationer ovan 1 uM reduce antalet pulser needed öppna mtPTP av 1-2 pulses. Därför lämpliga kontroller bör utföras genom att utesluta färgämnena och registrering andra parametrar (såsom svullnad ensam) för att vara säker på att antalet pulser som behövs för att öppna PTP förblir konsekvent.
Under hela detta protokollVi har mätt mtPTP öppning för mitokondrier respirerande på komplexa II substrat succinat i närvaro av rotenon, som hämmar omvänt elektrontransport från komplexa II till komplexa I. andra respiratoriska substrat kan också användas, såsom pyruvat / malat som stöder andning på komplexa I. Emellertid, substrat-relaterade skillnader i antalet av Ca 2 + pulser som krävs för att öppna mtPTP har rapporterats 8. Samma protokoll för mätning av mtPTP öppningen kan användas med mitokondrier isolerade från olika vävnader eller cellinjer. Vi har framgångsrikt utnyttjat detta protokoll för lever, muskel och hjärna mitokondrier, även om antalet Ca 2 + pulser som behövs för att utlösa mtPTP öppningen var vävnad beroende som tidigare rapporterats 9, 10. Mitokondrierna isolering protokoll måste anpassas och optimeras för varje vävnad eller cellinje på grund av särskilda krav på homogenisering förfarandet och buffertar isolering 11, 12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av HL094536 (BJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. Jr The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
