Summary
Et spektrofluorometrisk protokol for målingen af mitokondriel permeabilitetsovergang pore åbning i isoleret muse hjerte mitokondrier er præsenteret her. Assayet involverer samtidig måling af mitokondrier Ca
Abstract
Den mitokondriel permeabilitetsovergang pore (mtPTP) er en ikke specifik kanal, der dannes i den indre mitokondriemembran at transportere opløste stoffer med en molekylvægt mindre end 1,5 kDa. Selv om den endelige molekylære identitet af pore er stadig under debat, proteiner, såsom cyclophilin D, VDAC og ANT bidrage til mtPTP formation. Mens inddragelsen af mtPTP åbning i celledød er veletableret 1, akkumulere beviser tyder på, at mtPTP serverer en fysiologisk rolle under mitochondrial Ca 2 + homeostase 2, bioenergetik og redox signalering 3.
mtPTP åbning udløses af matrix Ca2 +, men dets aktivitet kan moduleres ved en række andre faktorer, såsom oxidativt stress, adeninnukleotid udtømning, høje koncentrationer af Pi, mitokondriel membrandepolarisering eller frakobling, og langkædede fedtsyrer 4. in vitro mtPTP åbningen kan være achieved ved at forøge Ca2 +-koncentration inden for mitochondrial matrix via exogene tilsætninger af Ca2 + (calcium tilbageholdelseskapacitet). Når Ca2 + niveauer inde mitokondrier når en bestemt tærskel, mtPTP åbnes og fremmer Ca2 +-frigivelse, dissipation af proton motorkraft, membranpotentiale kollaps og en stigning i mitochondrial matrix volumen (hævelse), som i sidste ende fører til brud på ydre mitochondriemembran og uopretteligt tab af organel funktion.
Her beskriver vi et fluorometrisk assay, som tillader en omfattende karakterisering af mtPTP åbning i isolerede mus hjerte mitokondrier. Assayet involverer samtidig måling af 3 mitokondrielle parametre, der ændres, når mtPTP åbning opstår: mitochondrial Ca2 + håndtering (optagelse og frigivelse som målt ved Ca2 +-koncentration i assaymediet), mitokondriemembranspændingen, og mitochondrial volumen. Farvestofferne anvendes til Ca2 +-målingen i assaymediet og mitokondriemembranspændingen er Fura FF, en membran impermeabel, ratiometrisk indikator, der undergår en ændring i excitations-bølgelængden i nærvær af Ca2 +, og JC-1, et kationisk, ratiometrisk indikator, som danner grønne monomerer eller røde aggregater med lav og høj membranpotentiale hhv. Ændringer i mitochondrie volumen måles ved en registrering lysspredning af mitochondrial suspension. Da høj kvalitet, funktionelle mitokondrier er nødvendige for mtPTP åbning assay, vi beskriver også de trin, der er nødvendige for at opnå intakt, stærkt koblet og funktionelle isolerede hjerte mitokondrier.
Protocol
1. Isolering af Mitokondrier fra mus Heart
- For at isolere hjerte mitokondrier, bedøver og ofre mus i overensstemmelse med de procedurer, der er godkendt af din lokale Institutional Animal Care og Use Udvalg.
Bemærk: Alle trin i mitokondrier isoleret protokollen skal udføres på is. Brug is kolde buffere og præ-kølet Petriskaale Falcon rør og Eppendorf rør. De mængder der er angivet i protokollen er for en prøve indeholdende 2 mus hjerter.
- Fjern hjerter, læg dem i koldt Mitokondrier Isolation Buffer (300 mM sucrose, 10 mM Na-HEPES, 200 pM EDTA, pH 7,4) og skylles blod.
Bemærk: For optimale resultater skulle pH-værdien af mitokondrielle puffere indstilles med KOH og eddikesyre.
- Placer hjerter på en kold petriskål, fjerne fedt og forkamre, og hakkekød fint med en kniv indtil fåING et homogent produkt.
- Overførsel hakket hjerter til et 50 ml Falcon-rør, der tilsættes 10 ml Mitokondrier Isolation puffer med 0,1 mg / ml trypsin og lade prøven at fordøje på is i 10 min.
Bemærk: Trypsin under isoleringsproceduren forøger udbyttet af isolerede mitokondrier og bør holdes konstant mellem mitokondriske præparater. Det anbefales at teste mitochondriale funktioner på isolerede præparater er fraværet af trypsin til at sikre, at enzymet ikke påvirker funktionaliteten.
- Der tilsættes 10 ml Mitokondrier Isolation puffer med 0,1% fedtsyrefrit BSA og 5 mg trypsininhibitor (sojabønne) og blandes ved at vende røret flere gange for at neutralisere trypsin.
Bemærk: Mitokondrier Isolation Buffer kan fremstilles i forvejen og kan opbevares ved -20 ° C. Tjek pH ved optøning. Trypsin, trypsininhibitor eller BSA skal være endded til Mitokondrier Isolation Buffer på dagen for forsøget.
- Inddrive det fordøjede væv ved lav til medium hastighed centrifugering i 1 min ved 4 ° C.
- Resuspender væv i 8 ml Mitokondrier Isolation puffer med 0,1% fedtsyrefrit BSA og homogeniseres under anvendelse af en motoriseret Dounce-homogenisator med en teflon pistil (4-6 passager ved 1,200-14,00 rpm). Hold prøven på is under homogenisering.
- Overfør homogenat i et 15 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 800 x g i 10 minutter ved 4 ° C for at pelletere kernerne og vævsrester.
- Opsaml supernatanten indeholdende mitokondrier i Eppendorf-rør og centrifugeres ved 8000 xg i 15 minutter, ved 4 ° C.
- Fjern forsigtigt det øverste hvide lag og vask den resterende mørkere pellet indeholdende mitokondrier i 1 ml mitokondrier Isolation Buffer.
- Der centrifugeres ved 8000xg i 15 minutter ved 4 ° C. Kasser supernatanten og resuspender mitokondrier pellet i 150 ul Mitochondrial Isolation Buffer. Hold mitochondrier på is i yderligere assays.
Bemærk: For det bedste resultat i løbet af funktionelle assays, mitokondrier anvendes inden 4 timer af isolation.
- Kvantificere mitochondrial protein ved Bradford-analysen.
2. Kvalitetskontrol af isolerede mitokondrier
2.1. Måling af respiratorisk kontrol ratio (RCR)
- Kalibrere Oxytherm oxygenelektrode med luft-mættet vand til at etablere det maksimale oxygen linje. Når et stabilt niveau af oxygen opnås der tilsættes 100 gl af en frisk fremstillet 10 mM natriumhydrosulfit løsning til at etablere nul-oxygen linje. Foretages målinger på 30 ° C.
- Tilsæt 2 ml Mitokondrier Respiration Buffer (125 mM KCI, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl2, 400 pM EGTA, 300 pM DTT, 5 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) med 1 uM rotenon til Oxytherm kammeret, forsegles kammeret og start recording.
- Når oxygen signalet er stabilt, tilsættes 250 ug mitokondrier og optage basal respiration i 1 min. Den respiration på dette punkt bør være meget lav som mitochondrier er respirerende på endogene substrater (State 1 respiration).
- Tilsæt 5 mM succinat og optage signalet i 1 min. Oxygen forbrug bør stige under stat 2 respiration.
- Fremkald Tilstand 3 respiration ved tilsætning af 150 pM ADP. På dette tidspunkt ilt forbrug skulle stige på grund af ATP syntese gennem oxidativ phosphorylering. Optag signal indtil respiration langsommere, hvilket indikerer ADP forbrug og overgang til stat 4 respiration. Record State 4 respiration i mindst 1 min.
- Tilsæt 1 uM CCCP og optage signal i 1 min. Ukoblet respiration bør være maksimal.
Bemærk: Effekten af CCCP på mitochondrial respiration er dosisafhængig: høje koncentrationer af CCCP kan hæmme iltforbrug og bør derfor nøje titrated.
- Beregn den respiratoriske kontrol ratio (RCR) ved at dividere oxygenforbrugshastighed under state 3 respiration ved oxygenforbrugshastigheden under State 4 respiration. Et mål RCR skal være ≥ 4.
2.2. Vurdering af mitokondriel membran integritet (cytochrom c-test)
- Vaskes Oxytherm kammer med 70% ethanol og vand og gentage trin 2.1.2 -2.1.4.
- Tilsæt 1 mM ADP og optage ilt forbrug i 1 min.
- Tilsættes 10 uM cytochrom c. Da cytochrom c er uigennemtrængelig for intakte mitochondriske membraner, en forøgelse af respiration indikerer knækket eller beskadiget mitochondriske membraner.
3. Måling af mitokondriel permeabilitetsovergang pore åbning
- Opsætte spektrofluorometer til multi-parameter måling af mtPTP åbning. Ved hjælp af FelixGx program, en ny hardwarekonfiguration oprette (Quanta mester steady state) omfatter lyskilden, excitation monochromator, prøverum og to detektorer anbragt ved 90 ° og 270 ° i forhold til excitations monochromator (figur 4). For at opnå maksimal tidsopløsning, skal begge emissioner monochromatorer (90 ° og 270 °) blive deaktiveret, og emissions filtrene ved 90 ° og 270 ° i stikprøven rum aktiveret i hardwarekonfigurationen menuen. Dette skridt vil fjerne den motorisk kontrol af emissions-bølgelængder og fastsætte hver monochromator ved en bestemt bølgelængde. Hvis emissionen monochromatorer ikke er deaktiveret, vil hver detektor cyklus mellem de to bølgelængder og duplikerede målinger vil blive registreret.
- Opret en ny erhvervelse protokol ved hjælp af Multi Dye type og indtast følgende farvestoffer:
- Fura (høj Ca + +): excitation 340 nm, emission 525 nm (detektor 1)
- Fura (lav Ca + +): excitation 380 nm, emission 525 nm (detektor 1)
- JC1 (samlet): excitation 543 nm, Emission 595 nm (detektor 2)
- JC1 (monomer): excitation 498 nm, emission 525 nm (detektor 1)
- Hævelse: excitation 525 nm, emission 525 nm (detektor 1)
- Indstille excitations-og emissions-spalter til 1 nm og temperaturen til 37 ° C.
- Til opnåelse af ratiometrisk signal for Fura og JC-1, genererer to afledte spor: Fura (høj Ca + +) / Fura (lav Ca + +) og JC1 (samlet) / JC1 (monomer).
- Manuelt justere emissionsbølgelængde af detektorer 1 og 2 til 525 nm og 595 nm.
- Bland 1 ml Mitokondrier Assay Buffer (120 mM KCI, 10 mM NaCI, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) med 1 uM rotenon, 5 mM succinat og 800 nM Fura FF i en engangs 4-sidet methacrylat kuvette. Tilsættes 250 ug mitokondrier og sted prøve i prøverummet. Sørge for, at den magnetiske omrører er tændt.
- Start optagelsen. Efter 1 min, erhvervelse pause, tilsæt 500 nM JC-1 og derefter genstarte encquisition. The JC-1 forhold signal bør stige, hvilket indikerer farvestofoptagelse ved aktiv mitochondria. Optegnelsen fortsættes, indtil JC-1-signalet har nået et plateau (som regel indenfor 5 min).
- Tilsæt 20 uM CaCl2. En øjeblikkelig forøgelse af Fura FF forholdet signal skal overholdes af forøget Ca2 + tilstedeværelse i assaypuffer efterfulgt af en gradvis reduktion grund mitochondrial Ca2 +-optagelse. Det JC-1-forhold signal bør udvise en kort forbigående fald indikerer svag mitochondriemembran depolarisering.
- Vente til fura FF forholdssignal vender tilbage til basisniveauet inden tilsætning af en anden CaCl2 impuls (1-1,5 min). Fortsæt pulsering med faste intervaller, indtil mitokondrier ikke kan ophobes Ca2 + og begynde at frigive Ca2 + i assaypuffer. mtPTP åbning er visualiseret ved en samtidig stigning i Fura FF forholdet signal på grund af Ca2 + release, et fald i JC-1-signal forhold som følge af membran potential sammenbrud, og et fald i lysspredning som følge af mitokondriel opsvulmen (figur 5).
- Efter mtPTP aktivering specificiteten af Fura FF, JC-1 og hævelse signaler kontrollere henholdsvis 1 mM EGTA, 1 uM CCCP og 5 ug / ml alamethicin.
- At kontrollere specificiteten af mtPTP åbning, gentage trin fra 3,6 til 3,9 i nærvær af 1 uM af cyclophilin D inhibitor cyclosporin A (cyclophilin D er en komponent i mtPTP). I nærvær af cyclosporin A, åbning af mtPTP kræver betydeligt mere CaCl2 pulser end kontrolprøver (figur 6).
4. Repræsentative resultater
Figur 2 viser en typisk respiratorisk styring af isolerede muse hjerte mitokondrier. Tilstand 3 respiration opnås ved tilsætning af ADP til mitochondrier respirerende på succinat, og er kendetegnet ved signifikant forøget oxygenforbrug i forhold til substrate alene. Udtømning af tilsat ADP initierer State 4 respiration, hvor iltforbruget forsinker og kan sammenlignes med rates opnået før ADP tilsætning. RCR fremkommer ved at dividere oxygenforbrugshastigheden for stat 3 åndedræt af en indsats fra State 4 åndedræt. The cytochrom c test bruges til at assay integriteten af den ydre mitokondriemembran: hvor cytochrom c er sat til mitokondrier respirerende på succinat-og ADP, ingen yderligere stigning i respiration observeres, hvilket indikerer en intakt ydre mitokondriske membraner (figur 3).
Et repræsentativt billede til mtPTP åbning i isolerede hjerte mitokondrier er vist i fig. 4. I dette tilfælde mtPTP åbning blev udløst ved tilsætning af 4 CaCl2 pulser (20 pM hver) med 1,5 minutters intervaller. mtPTP åbning fremgår af den næsten samtidige frigivelse af mitochondrial Ca2 + (forøgelse af Fura FF forholdssignal), sammenbrud mitochondriale membranpotentiale (fald i JC-1 forhold signal) og øget mitokondriel volumen (fald i hævelsen signal). Når cyclosporin A tilsættes, som binder til cyclophilin D komponent mtPTP, mtPTP åbning kræver 7 impulser af CaCl2 i stedet for 4 (figur 5).
Fig. 1. Rutediagram over de multi-parameter mitokondriel permeabilitetsovergang pore åbning protokol for isolerede hjerte mitokondrier. Hjerte høstes fra mus og mitokondrier isoleres ved differentialcentrifugering. Den mitokondriske Tilberedningen kvalitativt evalueret ved polarografisk måling af respiratorisk kontrol-forholdet og mitokondriske membran intakthed i nærvær af cytochrom c. Mitokondriel permeabilitetsovergang pore åbning i isolerede mitokondrier udløses ved sekventiel cacl 2 tilføjelser og måles med en spektrofluorometer ved at overvåge Ca 2 + frigivelse fra mitokondrier, membranpotential sammenbrud og hævelse af mitokondrie matrix.
Figur 2. Måling af respiratorisk styring ratio (RCR) af isolerede hjerte mitokondrier. Oxygenforbruget af isolerede hjerte mitokondrier måles under state 3 respiration i nærværelse af succinat-og ADP, og under State 4 respiration efter ADP forbrug. Reaktionen af isolerede mitokondrier med uncouplers måles ved tilsætning af CCCP. Tal på grafen er satserne for iltforbrug ved isolerede mitokondrier i nmol / min / mg protein.
Figur 3. Mål ling af membranintegritet af isolerede hjerte mitokondrier. Mitochondriemembranen integritet bestemmes ved måling af oxygenforbruget i isolerede mitokondrier i nærværelse af succinat-og ADP og efter tilsætning af cytochrom c. Tal på grafen er satserne for iltforbrug ved isolerede mitokondrier i nmol / min / mg protein.
Figur 4. Spektrofluorometer hardwarekonfigurationen for den multi-parameter måling af mtPTP åbning. Hardwarekonfiguration for spektrofluorometer indbefatter en lyskilde, en excitation monochromator, en prøve rum og to detektorer med faste emissionsbølgelængder ved 525 nm og 595 nm. Detektoren 1 anvendes til signaldetektering af Fura FF høj og lav Ca2 +, JC-1 monomer og ekspandering signal. Detektor 2 måler JC-1 samlet signal.
Figur 5. Multi-parameter måling af mtPTP åbning i isolerede hjerte mitokondrier. mtPTP åbning blev udløst af sekventielle tilsætninger af 20 uM CaCl2 og blev karakteriseret ved Ca2 +-frigivelse fra mitochondrier, mitokondriemembranspændingen kollaps og øget mitochondrial matrix volumen (hævelse). Extramitochondrial Ca2 + og membranpotentiale blev målt med ratiometrisk indikatorer Fura FF (grøn spor) og JC-1 (red trace). Hævelse af mitokondrier blev målt ved at optage lysspredning ved 525 nm (sorte spor). Specificitet af JC-1 og hævelse signaler blev testet med 1 uM CCCP og 5 ug / ml alamethicin (et mikrobielt toksin).
Figur 6. Multi-Parameter måling af mtPTP åbning i isolerede hjerte mitokondrier i nærværelse af cyclosporin A. Cyclosporin A (1 uM) forøger antallet af CaCl2 pulser, der er nødvendige for at åbne mtPTP i isolerede hjerte mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her beskriver de nødvendige eksperimentelle procedure for at vurdere permeabilitetsovergang pore åbning i isolerede hjerte mitokondrier (figur 1 og figur 4): fremgangsmåden til isolering af muse-hjerte mitokondrier, de respiratoriske kontrol, der sikrer deres integritet og funktionalitet, de mitochondriale parametre overvåges under mtPTP åbning og farvestofferne anvendt for deres måling, oprettelsen af den spektrofluorometrisk instrumentering og karakterisering af mtPTP åbning. Den spektrofluorometer anvendt i denne protokol giver mulighed for hurtig måling af disse tre parametre samtidigt. Imidlertid kan den grundlæggende protokol anvendes ved anvendelse af andre kommercielt tilgængelige instrumenter, om end med reduceret tidsopløsning. Ikke-ratiometrisk farvestoffer kan også anvendes, men ikke tillader kvantitative målinger af både Ca2 + og mitokondriemembranspændingen 5.
Agod kvalitet mitochondrial præparat er afgørende, når assaye mtPTP åbning, da både evne til at akkumulere Ca2 + og opretholde et membranpotentiale er tæt sammen. For eksempel fandt vi, at mitokondrier med et lavt RCR udviser reduceret JC-1 akkumulering og dårlig Ca2 + mobilisering. Den procedure, vi bruger til at isolere hjerte mitokondrier blev tilpasset fra tidligere offentliggjorte protokoller 6, 7 og viste sig at være meget konsekvent i at generere høj kvalitet mitokondrier som målt ved RCR og cytochrom c tests.
Åbning af mtPTP er et komplekst fænomen, der involverer ændringer på flere niveauer i den mitokondriske anatomi og fysiologi. Analysen beskriver vi her spektrofluorometrisk måler samtidige ændringer i extramitochondrial Ca 2 + niveauer, mitokondriemembranspændingen og mitochondriel volumen. Måling af flere parametre samtidig tilbyder en mere comprehensive billede af fænomenet end måling af individuelle parametre alene, såsom Ca2 +-mobilisering eller hævelse. Desuden er brugen af ratiometrisk farvestoffer Fura FF og JC-1 for Ca2 + og membranpotentiale målinger begrænser eksperimentel artefakt relateret til farvning koncentration, optagelse eller fotoblegning. Disse farvestoffer kan også let kalibreres for at opnå flere kvantitative målinger. En vigtig observation er, at alle farvestofkoncentrationer bør holdes så lavt som muligt for at undgå interferens med mitokondrier åndedræt og membranpotentialet samt sensibilisere mtPTP åbning. I vore hænder, reducere JC-1 koncentrationer over 1 uM antallet af impulser, der er nødvendige for at åbne mtPTP med 1-2 impulser. Derfor passende kontrol bør udføres ved at udelukke farvestoffer og registrering af andre parametre (såsom hævelse alene) for at være sikker på, at antallet af impulser, der er nødvendige for at åbne PTP forbliver konsistente.
I hele denne protokolVi har målt mtPTP åbning for mitokondrier respirerende på komplekse II substrat succinat i nærvær af rotenon, som inhiberer revers elektrontransport fra komplekset II til komplekse I. Andre respiratoriske substrater kan ligeledes anvendes, såsom pyruvat / malat som støtter respiration på komplekse I. Imidlertid substrat-relaterede forskelle i antallet af Ca2 +-pulser, der er nødvendige for at åbne mtPTP er rapporteret 8. Den samme protokol til måling af mtPTP åbning kan anvendes med mitokondrier isoleret fra forskellige væv eller cellelinier. Har vi med succes anvendt denne protokol for lever, muskel og hjerne mitokondrier, selv om antallet af Ca2 + pulser er nødvendige for at udløse mtPTP åbning var væv afhængig som tidligere rapporteret 9, 10. Mitokondrierne isolation protokollen skal tilpasses og optimeres for hvert væv eller cellelinie på grund af særlige krav til homogenisering procedure og isolation buffere 11, 12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af HL094536 (BJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. Jr The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
