Summary
Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias Ca
Abstract
El poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mtPTP) es un canal no específico que se forma en la membrana mitocondrial interna para el transporte de solutos con una masa molecular inferior a 1,5 kDa. Aunque la identidad definitiva molecular del poro está todavía en debate, proteínas como la ciclofilina D, VDAC y ANT contribuir a mtPTP formación. Si bien la participación de la apertura mtPTP en la muerte celular está bien establecida 1, la evidencia acumulada indica que la mtPTP cumple un papel fisiológico durante mitocondrial homeostasis del Ca 2 + 2, la bioenergética y señalización redox 3.
apertura mtPTP se desencadena por matriz Ca 2 +, pero su actividad puede ser modulada por varios otros factores tales como el estrés oxidativo, el agotamiento de nucleótidos de adenina, altas concentraciones de Pi, despolarización de la membrana mitocondrial o desacoplamiento, y ácidos grasos de cadena larga 4. In vitro, mtPTP apertura puede ser ACHieved mediante el aumento de la concentración de Ca2 + en el interior de la matriz mitocondrial a través de adiciones exógenas de Ca 2 + (capacidad de retención de calcio). Cuando los niveles de Ca 2 + dentro de las mitocondrias alcanzar un cierto umbral, la mtPTP abre y facilita la liberación de Ca 2 +, la disipación de la fuerza motriz de protones, la membrana potencial de colapso y un aumento de volumen de la matriz mitocondrial (hinchazón) que en última instancia conduce a la ruptura de la membrana mitocondrial externa y la pérdida irreversible de la función del orgánulo.
Aquí se describe un ensayo fluorométrico que permite una caracterización exhaustiva de apertura mtPTP en mitocondrias aisladas de corazón de ratón. El ensayo involucra la medición simultánea de 3 parámetros mitocondriales que son alterados cuando se produce la apertura mtPTP: mitocondrial de Ca 2 manejo + (absorción y liberación, medida por Ca 2 + de concentración en el medio de ensayo), el potencial de membrana mitocondrial, y mitochovolumen ndrial. Los colorantes empleados para la medición de Ca 2 + en el medio de ensayo del potencial de membrana mitocondrial son Fura FF, una membrana impermeabilizante, indicador radiométrica que sufre un cambio en la longitud de onda de excitación en presencia de Ca 2 +, y JC-1, un catiónico, indicador radiométrica que forma monómeros verdes o rojos agregados en el potencial de membrana de alta y baja, respectivamente. Cambios en el volumen mitocondrial se midió registrando dispersión de la luz por la suspensión mitocondrial. Dado de alta calidad, las mitocondrias funcionales son necesarias para el ensayo de apertura mtPTP, también se describe los pasos necesarios para obtener corazón intacto, altamente acoplado y funcional mitocondrias aisladas.
Protocol
1. Aislamiento de mitocondrias de corazón de ratón
- Para aislar las mitocondrias del corazón, anestesiar y sacrificar ratones de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Cuidado de Animales institucional local, y el empleo.
Nota: Todos los pasos del protocolo de aislamiento de las mitocondrias se debe realizar en hielo. Usar búferes frías y pre-enfriados placas Petri, tubos y tubos Falcon Eppendorf. Los volúmenes dados en el protocolo son para una muestra que contiene 2 corazones de ratón.
- Eliminar corazones, colocarlos en tampón frío Aislamiento mitocondrias (300 mM de sacarosa, 10 mM Na-HEPES, 200 mM EDTA, pH 7,4) y enjuagar la sangre.
Nota: Para obtener resultados óptimos, el pH de los tampones mitocondriales se debe ajustar con KOH y ácido acético.
- Corazones, colóquelas en una fría placa de Petri, eliminar la grasa y aurículas, y picar finamente con una cuchilla hasta obtenerING un producto homogéneo.
- Transferir los corazones desmenuzados a un tubo Falcon de 50 ml, añadir 10 ml de tampón de aislamiento mitocondrias con 0,1 mg / ml de tripsina y permitir que la muestra de digerir en hielo durante 10 min.
Nota: La tripsina durante el procedimiento de aislamiento incrementa el rendimiento de las mitocondrias aisladas y debe mantenerse constante entre las preparaciones mitocondriales. Se recomienda probar las funciones mitocondriales en preparaciones aisladas es la ausencia de tripsina para asegurar que la enzima no interfiere con la funcionalidad.
- Añadir 10 ml de tampón de aislamiento mitocondrias con graso 0,1% BSA libre de ácidos y 5 mg de inhibidor de tripsina (soja) y mezclar por veces invirtiendo el tubo varias para neutralizar la tripsina.
Nota: tampón de aislamiento mitocondrias pueden ser preparados por adelantado y se pueden almacenar a -20 ° C. Comprobar el pH después de la descongelación. Tripsina, inhibidor de tripsina o BSA debe ser undded al tampón de aislamiento mitocondrias en el día del experimento.
- Recuperar el tejido digerido por centrifugación a baja velocidad a media durante 1 min a 4 ° C.
- Resuspender el tejido en 8 ml de tampón de aislamiento de mitocondrias con 0,1% de ácido graso libre BSA y se homogeneiza utilizando un homogeneizador Dounce motorizado con una mano de mortero de teflón (4-6 pases en 1,200-14,00 rpm). Mantenga la muestra en hielo mientras se homogeneiza.
- Transferir homogeneizado en un tubo Falcon de 15 ml y se centrifuga a 800xg durante 10 min a 4 ° C para núcleos de pellets y los restos de tejido.
- Recuperar el sobrenadante que contiene la mitocondria en tubos Eppendorf y se centrifuga a 8.000 xg durante 15 min, a 4 ° C.
- Retire con cuidado la capa superior blanca y lavar el pellet restante más oscuro que contiene la mitocondria en 1 ml de tampón de aislamiento mitocondrias.
- Centrifugar a 8000 xg durante 15 min a 4 ° C. Deseche las mitocondrias pellet sobrenadante y resuspender en 150 l Isola mitocondrialción Buffer. Mantener la mitocondria en hielo durante ensayos adicionales.
Nota: Para obtener los mejores resultados durante los ensayos funcionales, utilice las mitocondrias dentro de las 4 horas de aislamiento.
- Cuantificar proteína mitocondrial utilizando el ensayo de Bradford.
2. Control de calidad de las mitocondrias aisladas
2,1. Medición de la relación del control respiratorio (RCR)
- Calibrar el electrodo de oxígeno Oxytherm con agua saturada de aire para establecer la línea de oxígeno máximo. Cuando un nivel estable de oxígeno se obtiene añadir 100 l de una solución recién preparada 10 mM hidrosulfito de sodio para establecer la línea de oxígeno cero. Realizar mediciones a 30 ° C.
- Añadir 2 ml de tampón de respiración mitocondrias (125 mM KCl, 20 mM de HEPES, 3 mM MgCl 2, 400 mM EGTA, 300 mM TDT, 5 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) con rotenona mu M 1 a la cámara de Oxytherm, sellar la cámara y el inicio Recording.
- Cuando la señal de oxígeno es estable, añadir 250 g mitocondrias y la respiración basal registro durante 1 min. La respiración en este punto debe ser muy baja como las mitocondrias se respiran en sustratos endógenos (estado 1 respiración).
- Añadir 5 mM de succinato y señal de grabación durante 1 min. El consumo de oxígeno debe aumentar durante el Estado 2 respiración.
- Inducir el estado 3 respiración mediante la adición de ADP 150 m. En este punto el consumo de oxígeno debe aumentar debido a la síntesis de ATP mediante la fosforilación oxidativa. Record señal hasta que la respiración se ralentiza, lo que indica el consumo de ADP y la transición al estado 4 respiración. Estado Record 4 respiración durante al menos 1 min.
- Añadir 1 mM CCCP y señal de grabación durante 1 min. Desacoplado respiración debe ser máxima.
Nota: El efecto de CCCP sobre la respiración mitocondrial es dependiente de la dosis: altas concentraciones de CCCP puede inhibir el consumo de oxígeno y por lo tanto debe ser cuidadosamente titrated.
- Calcular la relación del control respiratorio (RCR), dividiendo tasa de consumo de oxígeno durante el estado 3 respiración por la tasa de consumo de oxígeno durante la respiración Estado 4. A RCR objetivo debe ser ≥ 4.
2,2. Evaluación de la integridad de la membrana mitocondrial (citocromo c de prueba)
- Lave bien la cámara Oxytherm con 70% de etanol y agua y repita los pasos 2.1.2 -2.1.4.
- Añadir 1 mM ADP y consumo récord de oxígeno durante 1 min.
- Añadir 10 mM citocromo c. Puesto que el citocromo c es impermeable al intactas las membranas mitocondriales, un aumento de la respiración indica roto o dañado membranas mitocondriales.
3. La medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial
- Configure el espectrofluorómetro para la medición de múltiples parámetros de apertura mtPTP. Utilizando el programa FelixGx, crear una nueva configuración de hardware (Quanta sta maestro establete) que comprende la fuente de luz, monocromador de excitación, compartimento de la muestra y dos detectores posicionados a 90 ° y 270 ° con respecto al monocromador de excitación (Figura 4). Para conseguir una resolución máxima de tiempo, los dos monocromadores de emisión (90 ° y 270 °) debe estar desactivado y los filtros de emisión a 90 ° y 270 ° en el compartimiento de la muestra activada en el menú de configuración de hardware. Este paso se eliminará el control motor de las longitudes de onda de emisión y fijar cada monocromador en una longitud de onda particular. Si los monocromadores de emisión no está incapacitado, cada detector de ciclo entre las dos longitudes de onda y mediciones duplicadas se registró.
- Crear un nuevo protocolo de adquisición utilizando el tipo de tinte multi e introduzca los siguientes colorantes:
- Fura (alta Ca + +): excitación 340 nm, emisión 525 nm (detector 1)
- Fura (bajo Ca + +): excitación 380 nm, emisión 525 nm (detector 1)
- JC1 (agregado): excitación 543 nm, De emisión 595 nm (detector 2)
- JC1 (monómero): excitación 498 nm, emisión 525 nm (detector 1)
- Hinchazón: excitación 525 nm, emisión 525 nm (detector 1)
- Establecer las rendijas de excitación y emisión a 1 nm y la temperatura a 37 ° C.
- Para obtener la señal radiométrica para Fura y JC 1-, generan dos trazos derivados: Fura (alto Ca + +) / Fura (bajo Ca + +) y JC1 (total) / JC1 (monómero).
- Ajustar manualmente la longitud de onda de emisión de los detectores 1 y 2 a 525 nm y 595 nm, respectivamente.
- Mezclar 1 ml de tampón de ensayo Las mitocondrias (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) con rotenona 1 mM, 5 mM de succinato y 800 nM Fura FF en un desechable de 4-lados metacrilato de cubeta. Añadir 250 g de muestra mitocondrias y colocar en el compartimento de la muestra. Asegúrese de que el agitador magnético está encendido.
- Inicie la grabación. Después de 1 min, una pausa en la adquisición, añadir 500 nM JC-1 y reinicie el acquisition. La señal de JC-1 proporción debe aumentar, lo que indica la absorción de colorante por activa mitocondrias. Continuar el registro hasta JC-1 señal ha alcanzado una meseta (usualmente dentro de 5 min).
- Añadir 20 mM CaCl 2. Un aumento instantáneo de la señal en relación Fura FF debe ser observado por el aumento de Ca 2 + en presencia del tampón de ensayo, seguido de una disminución gradual debido a mitocondrial de Ca 2 + captación. La señal de JC-1 relación debe exhibir una disminución transitoria breve indicativo de la despolarización leve membrana mitocondrial.
- Esperar hasta que la señal vuelve Fura FF relación al nivel basal antes de la adición de otro pulso de CaCl 2 (1-1.5 min). Continúe pulsando a intervalos fijos hasta que las mitocondrias no pueden acumular Ca 2 + y comenzará las pruebas de Ca 2 + en el tampón de ensayo. apertura mtPTP es visualizado por un aumento simultáneo de la señal de relación Fura FF debido a la liberación de Ca 2 +, una disminución de la relación señal JC-1 debido a pote membranacolapso ntial, y una disminución de la dispersión de la luz debido a la hinchazón mitocondrial (Figura 5).
- Después de la activación mtPTP, verificar la especificidad de Fura FF, JC 1-y señales de inflamación, respectivamente con 1 mM EGTA, CCCP 1 mM y 5 mg / ml alameticina.
- Para verificar la especificidad de apertura mtPTP, repetir los pasos desde 3,6 hasta 3,9 en presencia de 1 mM de inhibidor de la ciclofilina D ciclosporina A (ciclofilina D es un componente de la mtPTP). En la presencia de ciclosporina A, la apertura de la mtPTP requiere significativamente más CaCl 2 pulsos que las muestras de control (Figura 6).
4. Los resultados representativos
La Figura 2 muestra un típico control respiratorio de corazón de ratón mitocondrias aisladas. Estado respiración 3 se consigue mediante la adición de ADP a mitocondrias que respiran en succinato, y se caracteriza por el consumo de oxígeno aumentó significativamente con respecto a la SubstraTE solo. El agotamiento de añadido ADP Estado iniciados 4 respiración, durante la cual el consumo de oxígeno disminuye y es comparable a los índices obtenidos antes de la adición de ADP. RCR se obtiene dividiendo la tasa de consumo de oxígeno para la respiración por Estado 3 Estado 4 que de respiración. El ensayo de citocromo c se usa para ensayar la integridad de la membrana mitocondrial externa: cuando citocromo c se añade a mitocondrias que respiran en succinato y ADP, ningún aumento adicional en la respiración se observa, lo que indica un intacta membranas externas mitocondrial (Figura 3).
Una imagen representativa de la apertura mtPTP en mitocondrias aisladas de corazón se muestra en la Figura 4. En este caso la apertura mtPTP fue desencadenada por la adición de 4 CaCl 2 pulsos (20 mM cada uno) a intervalos de 1,5 min. apertura mtPTP es evidente por la liberación casi simultánea de mitocondrial de Ca 2 + (aumento de la señal Fura relación FF), el colapso de mitochondpotencial de membrana rial (disminución de JC-1 señal de relación) y aumento del volumen mitocondrial (disminución en la señal de hinchazón). Cuando se añade ciclosporina A, que se une al componente de la ciclofilina D de mtPTP, apertura mtPTP requiere 7 pulsos de CaCl 2 en lugar de 4 (Figura 5).
Figura 1. Diagrama de flujo del multi-parámetro protocolo transición de permeabilidad mitocondrial apertura de los poros de las mitocondrias aisladas corazón. Corazón se cosecha a partir de ratones y las mitocondrias se aislaron mediante centrifugación diferencial. La preparación mitocondrial es entonces cualitativamente evaluadas por medición polarográfica de la relación del control respiratorio y intactness membrana mitocondrial en presencia de citocromo c. Transición mitocondrial apertura del poro de permeabilidad en las mitocondrias aisladas se desencadena por secuencial CaCl 2 adiciones y se mide con un espectrofluorómetro mediante el control de liberación de Ca 2 + de la mitocondria colapso membrana, el potencial y la inflamación de la matriz mitocondrial.
Figura 2. Medición de relación del control respiratorio (RCR) del corazón mitocondrias aisladas. El consumo de oxígeno por mitocondrias aisladas de corazón se mide durante 3 Estado de respiración en la presencia de succinato y ADP, y durante el Estado 4 respiración después del consumo de ADP. La respuesta de las mitocondrias aisladas a desacopladores se mide por la adición de CCCP. Los números en el gráfico son las tasas de consumo de oxígeno por las mitocondrias aisladas en nmol / min / mg de proteína.
Figura 3. Medida ción de la integridad de membrana de mitocondrias aisladas de corazón. Integridad de la membrana mitocondrial se determinó midiendo el consumo de oxígeno en mitocondrias aisladas en presencia de succinato y ADP y después de la adición del citocromo c. Los números en el gráfico son las tasas de consumo de oxígeno por las mitocondrias aisladas en nmol / min / mg de proteína.
Figura 4. Espectrofluorómetro configuración de hardware para la medición de múltiples parámetros de apertura mtPTP. La configuración de hardware de la espectrofluorómetro incluye una fuente de luz, un monocromador de excitación, un compartimento de muestra y dos detectores con longitudes de onda de emisión fija de 525 nm y 595 nm. Detector 1 se utiliza para la detección de la señal de Fura FF de alto y bajo Ca 2 +, monómero de JC-1, y la señal de hinchazón. Detector 2 mide la señal JC-1 agregado.
Figura 5. Multi-parámetro de medición de apertura mtPTP en mitocondrias aisladas de corazón. apertura mtPTP fue provocada por adiciones secuenciales de 20 mM CaCl 2 y se caracteriza por Ca 2 + liberación de colapso mitocondrias, potencial de membrana mitocondrial y el aumento de volumen de la matriz mitocondrial (hinchazón). Extramitocondrial Ca 2 + y el potencial de membrana se midió con los indicadores ratiometric Fura FF (verde traza) y JC-1 (curva roja). Hinchazón de las mitocondrias se midió registrando dispersión de luz a 525 nm (negro traza). Especificidad de JC-1 y las señales de inflamación fue probado con CCCP 1 mM y 5 mg / ml alameticina (una toxina microbiana).
Figura 6. Múltiples-Parámetro de medición de apertura mtPTP corazón en mitocondrias aisladas en presencia de ciclosporina A. ciclosporina A (1 M) aumenta el número de CaCl 2 pulsos necesarios para abrir mtPTP en mitocondrias aisladas de corazón.
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Discussion
El protocolo presentado aquí describe los pasos necesarios experimentales para evaluar la permeabilidad de la apertura del poro de transición en el corazón mitocondrias aisladas (Figura 1 y Figura 4): el procedimiento para el aislamiento de corazón de ratón mitocondrias, los controles de las vías respiratorias que garanticen su integridad y funcionalidad, los parámetros monitoreados durante mitocondriales mtPTP apertura y los colorantes empleados para su medición, la creación de la instrumentación espectrofluorométrico, y la caracterización de apertura mtPTP. El espectrofluorómetro empleado en este protocolo permite la medición rápida de estos tres parámetros simultáneamente. Sin embargo, el protocolo básico se puede emplear el uso de otros instrumentos disponibles comercialmente, aunque con menor tiempo de resolución. No ratiometric colorantes se pueden emplear también, pero no permiten que las medidas cuantitativas de ambos, Ca 2 + y potencial de membrana mitocondrial 5.
Lapreparación mitocondrial buena calidad es esencial al ensayo de la apertura mtPTP, ya que tanto la capacidad de acumular Ca 2 + y mantener un potencial de membrana están estrechamente relacionados entre sí. Por ejemplo, encontramos que las mitocondrias con una exposición RCR bajo reduce la acumulación de JC-1 y pobres Ca 2 + movilización. El procedimiento que se utiliza para aislar las mitocondrias del corazón fue adaptado de protocolos publicados anteriormente 6, 7 y resultó ser muy consistente en la generación de alta calidad de las mitocondrias como se mide por RCR y pruebas de citocromo c.
Apertura de la mtPTP es un fenómeno complejo que involucra cambios en varios niveles de la anatomía y la fisiología mitocondrial. El ensayo se describe aquí espectrofluorométricamente mide los cambios simultáneos en extramitocondrial Ca 2 + niveles, la membrana mitocondrial potencial y el volumen mitocondrial. La medición de varios parámetros al mismo tiempo ofrece una comprehe másnsive imagen del fenómeno de la medición de los parámetros individuales solamente, tales como Ca 2 + movilización o hinchazón. Por otra parte, el uso de tintes radiométrica FF Fura y JC 1-por Ca 2 + y mediciones de potencial de membrana limita artefacto experimental relacionado con tinte concentración, absorción o photobleaching. Estos colorantes también se pueden calibrar fácilmente con el fin de obtener mediciones más cuantitativas. Una observación importante es que todas las concentraciones de colorante debe mantenerse tan baja como sea posible para evitar la interferencia con la respiración mitocondrial y el potencial de membrana, así como sensibilizar apertura mtPTP. En nuestras manos, JC-1 concentraciones superiores a 1 mM reducir el número de pulsos necesarios para abrir mtPTP por 1-2 pulsos. Por lo tanto los controles apropiados se debe realizar mediante la exclusión de los colorantes y el registro de otros parámetros (tales como la hinchazón solo) para estar seguro de que el número de pulsos necesarios para abrir el PTP se mantiene constante.
A lo largo de este protocolohemos medido apertura mtPTP para las mitocondrias que respiran en succinato sustrato complejo II en presencia de rotenona, que inhibe el transporte de electrones inversa de complejo II de complejos sustratos respiratorios I. Se pueden usar otros también, tales como piruvato / malato que soporta la respiración en complejo I. Sin embargo, relacionadas con sustrato-diferencias en el número de Ca 2 + impulsos necesario para abrir mtPTP se han reportado 8. El mismo protocolo para la medición de la apertura mtPTP puede ser empleado con mitocondrias aisladas de diferentes tejidos o líneas celulares. Hemos utilizado con éxito este protocolo para el hígado, músculo y cerebro mitocondrias, aunque el número de Ca 2 + impulsos necesaria para desencadenar la apertura mtPTP era dependiente del tejido como se informó anteriormente 9, 10. El protocolo de aislamiento de las mitocondrias deben ser adaptados y optimizados para cada tejido o línea celular debido a los requisitos específicos sobre el procedimiento de homogeneización y 11 memorias intermedias de aislamiento, 12
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por HL094536 (BJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
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