細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

Summary

細胞培養液からの細胞内、細胞質の全長DISC1タンパク質のアグレソームのとで標識し、多量換えDISC1タンパク質断片の生成、精製および細胞浸潤

Abstract

タンパク質凝集は、アルツハイマー病（Aβ、タウ）、パーキンソン病（α-シヌクレイン）、ハンチントン病（ポリグルタミン、チンチン）、および他の神経変性疾患、例えば、変性脳の条件が好きで、慢性の一般的特質として見られている。タンパク質の凝集が妨げproteostasisが原因で発生すると考えられ、発生したと誤って折り畳まれたタンパク質の分解との間の不均衡、 すなわち 。注目すべきは、同じタンパク質が家族性の稀少変異の変異であるこれらの疾患の散発型に集約発見されています。

統合失調症は、多くの場合、永久的で不可逆的な認知障害と一緒に行くの慢性進行性の脳の状態です。候補遺伝子アプローチでは、混乱·イン·統合失調症1（DISC1）、慢性の精神疾患^1、2へのリンケージとスコットランドの家族の中でクローニングされた遺伝子が、BRAIに不溶性の凝集体として見つけることができるかどうかを検討nは統合失調症³の散発例。 SMRI CCを使用して、我々はCMDで例約20％で同定が、生化学的分画後の神経変性疾患ではない通常のコントロールや患者がサルコシル不溶性DISC1の免疫反応。 in vitroでのその後の研究は、DISC1の凝集傾向を疾患関連多型S704C ⁴の影響を受けていたことを明らかにし、in vitro で生成されたDISC1アグレソームは^Aβ6に示されていたものと同様の^5、タウ^7-9、α細胞侵襲的であったこと-シヌクレイン^10、ポリグルタミン^11、SOD1凝集体^12。これらの知見は、私たちは、CMDを持つケースの少なくとも一部、集約されたDISC1とのそれらは、タンパク質立体配座の疾患かもしれないことを提案するように求められます。

ここで我々は、哺乳動物細胞におけるDISC1アグレソームを生成する方法を説明し、ショ糖密度勾配上でそれらを浄化し、細胞浸潤のストゥディのためにそれらを使用するES。同様に、我々は我々が独占的に多量のC末端フラグメントDISC1、ラベルを生成し、細胞浸潤の研究のためにそれを浄化する方法を説明します。 DISC1の組換え多量体を用いて、我々は同様に標識合成α-シヌクレインフラグメントの場合と同様の細胞浸潤能を実現しています。我々はまた、定位レシピエント動物の脳に注入する場合は、このフラグメントを in vivo で取り上げられていることを示している。

Protocol

1。 Aggresomeドナー細胞の調製モノマー赤色蛍光タンパク質（MRFP）または強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）タグ付きヒト完全長（FL）のDISC1のトランスフェクション

1. シード1.5×10 ^6/10センチメートルディッシュヒト神経芽細胞腫のNLF（NLF、フィラデルフィアの小児病院、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）10 10cmディッシュ内の細胞と一晩増殖。 NLFの細胞は、L-グルタミン、ペニシリン/ Strepomycin、10％FBSを添加したRPMI-1640培地で培養される。翌日、細胞は70〜80％コンフルエントになっているはずです。
2. 一時的に15μgのプラスミドDNAとMetafecteneトランスフェクション試薬（Biontex、Martinsried、Germany）でそれぞれ10cmディッシュをトランスフェクション。簡単に説明すると、10cm皿に、15μgのプラスミドDNAと30μlのMetafecteneは、750μlののOpti-MEMに添加し、混合し、室温で20分間インキュベートした。 5皿をpcDNA3.1 mRFPを/ EGFPプラスミド単独でのeGFPタグ付きヒト（フロリダ州）のDISC1と5皿でトランスフェクトした。

2。 Aggresomeトランスフェクトされたドナー細胞からの精製

ここで説明されたプロトコルは、脳組織¹³と大きな凝集体とアグレソーム^14を単離するため^のプロトコルからレヴィー·ボディを浄化するための方法を組み合わせたものです。すでに既存の方法は、洗剤の使用量に基づいているので、細胞浸潤アッセイのアプリケーションのための界面活性剤を含まないタンパク質の分離は非常に重要です。

1. トランスフェクションの48時間後には、eGFPおよびmRFP/eGFP-DISC1の発現をモニターし、蛍光顕微鏡（ 図1）に基づくアグレソームの形成を確認します。
2. 1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加（ロシュ、インディアナポリス、インディアナ州）とPrecellys24ホモジナイザー（ベルタン技術、フランス）を用いて細胞を破壊し、PBS pHは7.4、400μlのPBSそれぞれとスクレープで細胞を洗浄します。簡単に言えば、2 mlの溶解チューブに1 mlの細胞懸濁液を加え、10セラミックビーズを追加します。 3×60秒パルスで細胞を溶解します。プロセスの機械的な力かもしれない37前述のサンプル内の温度を上げる℃のような注意が溶解処理後のサンプルを氷上に寒さに注意する必要があります。
3. 氷の上のセルを冷却し、37℃で60分間、10mMのMgCl _2、40 U / mlのDNaseとインキュベートを追加°C
4. 80％、50％、PBSのpHは7.4（各10ml）中の20％スクロース（w / v）の溶液を調製する。
5. 50パーセントと20パーセント、続いて2ミリリットル80％スクロースを皮切りに、15mlファルコンチューブにショ糖勾配を準備します。徐々に勾配を注ぎ、既に注ぎ層を乱さないように注意してください。 4℃で1000×gで15分間、遠心勾配の上の層消化ライセートを℃に
6. 慎重に、PBS pH7.4の5倍量とピペットとミックスで50〜80％のショ糖層との間​​の相間を収集します。 4℃、1000×gで15分間遠心さらに2回洗浄を繰り返します。この中間期では、アグレソームは蛍光であり、紫外線下で顕微鏡で可視化することができる。
7. 上清を捨て、250から500μLのPBS（pH7.4）中でペレットを再懸濁します。このペレットは、精製アグレソーム（ 図2）が含まれています。

3。 mRFP/eGFP-DISC1アグレソームと受信者のSH-SY5Y細胞の治療

1. シード5×10 ^4個の受信者のSH-SY5Yヒト神経芽腫細胞恒常的に24ウェルプレートの各ウェル中の滅菌カバーグラス上のGFP-DISC1（598から854）を発現する。 SH-SY5Y細胞は、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸（NEAA）および10％FBSを添加したDMEM/F-12培地で培養される。
2. 24時間後、各ウェルに10μlを加えると48〜72時間インキュベートする。
3. PBSのpHは3×7.4細胞を洗浄し、5分間は0.04％トリパンブルーで細胞外の蛍光を消光する。
4. 氷上で10分間PBS pH7.4中4％PFAで細胞を固定し、DAPIマウント培地（Invitrogen、米国）とゴールドを長引かせると滅菌H ₂ Oで1回洗浄し、ガラススライド上にカバースリップをマウントします。
5. /取り込みを確認するZスタック画像に受容細胞によって発現募集タンパク質との共局在化によって外因的に適用アグレソームの侵攻。

まだ、外因性タンパク質の取り込み/侵入は基本的に宿主細胞タンパク質の募集と並行して検出されないことがあります。私たちの例では、mRFPをタグ付きDISC1アグレソームリクルート可溶性GFPタグDISC1（598から854）は、宿主細胞（ 図3を参照）によって発現されたタンパク質を。写真はツァイスLSM 510共焦点またはツァイスAxioVisionのApotome2顕微鏡で撮影した。

4。組換えDISC1の世代（598から785）

前の刊行物では、自己会合ドメインの存在に基づいて、自己の対話への様々なDISC1タンパク質断片の能力を分析した。最強多量性向^4（ 図4）表示されているすべてのタンパク質の中でテストした人間のDISC1（598から785）を断片化します。従って、ヒトDISC1（598から785）は、（いいえpET15bにクローニングした大腸菌で発現し、N末端​​6 -ヒスチジンタグを含むvagen、マディソン、ウィスコンシン州）、 大腸菌 BL21-（lDE3）はロゼッタ（Novagen社製、米国）、および^4に記載され^ているよう^に 8モル/ l尿素で変性条件下で精製した。要するに、プロトコルは以下の通りです。

1. BL21-（IDE3）ロゼッタE.大腸菌を OD ₆₀₀に5mMの5 MM-アルギニン塩酸、硫酸マグネシウム、100μg/ mlのcarbencillin、35μg/ mlのクロラムフェニコールを含む2×500ミリリットル2YTで増殖させた：0.6から0.8とDISC1（598から785）の発現を誘導した1mMのIPTGで。
2. DISC1（598から785）を37℃で4時間発現させ、発現は、遠心分離により菌体を収穫によって終了されました。
3. 細菌ペレットを50mlのTE緩衝液（50mMのトリス-HCl pH 8.0、5mMのEDTA）と2mMのPMSF、1％TX-100、250μg/ mlのリゾチーム、20mMのMgCl ₂および400 U/50 mlに再懸濁した完全な溶解を確実にするためにDNアーゼIは、反応が穏やかに攪拌しながら室温で30分間インキュベートした。
4. 10mMのβ-mercaptを追加さらに30分間oethanol（ME）と500mMのNaClとインキュベートする。
5. 4℃で30分間20.000グラムで細菌封入体をスピンダウン
6. 50mMのトリスpH8.0、5mMイミダゾール、500mMのNaCl、8M尿素および10mMのβ-MEを含む、4℃で30分間20.000グラムで遠心分離して破片を除去し、50mlの抽​​出バッファーでペレットを再懸濁し℃、
7. 抽出バッファーでNi-NTAアガロースマトリックスを洗う。室温で2時間、Ni-NTAマトリックスを用いて再懸濁し、preclearedタンパク質抽出物をインキュベートする。
8. 12mMのイミダゾールを含有する抽出バッファーでNi-NTAマトリックスを洗う。
9. 50mMトリス、500mMのNaCl、300 mMイミダゾール、8M尿素、1mMのPMSF、5mMのEDTAおよび10mMのβ-MEを含む15mlの溶出緩衝液でゆっくりタンパク質を溶出する。
10. 10mMのβ-MEを含むPBS pH7.4に段階的にタンパク質を透析する。

1リットルの細菌培養液から始まるそれは、組換えDISC1（598から785）protの50 mgまで単離することが可能であるEIN。

α-シヌクレインのリフォールディング

α-シヌクレインを用いた実験のために、組換えタンパク質500μgの（Sigma-Aldrich社製、米国）を1 mg / mlの濃度でPBSに溶解した。オリゴマーを得るためには、フォールディング℃で、前の出版物¹⁰で説明した37℃で一晩行った。

5。 DyLight594有する組換えDISC1（598から785）のラベリング

1. 前に後続のラベリング処理、DISC1（598から785）タンパク質が、β-MEから解放されました。したがって、タンパク質は1:2,000の希釈で、PBS pH7.4に3回透析する。
2. ラベル1、製造業者の使用説明書に従ってDyLight 594マレイミド（サーモサイエンティフィック社、米国）とMG DISC1（598から785）。短期では、PBS（pH7.4）に1 mg / mlのタンパク質を分解し、遊離チオール基を回収するの5mM TCEPを追加します。室温で2時間反応し、インキュベートをDMF溶解染料の20μlを添加する。
3. PBSのpHにタンパク質3 xを透析2時間ごとに1:2000の割合で7.4。

実行されたNi-NTAカラムでアフィニティー精製の​​His ₆ -タグベースの標識タンパク質の純度を一層高めるために。

4. 10mlのPBS pH7.4で1ミリリットルNi-NTAマトリックス（Qiagen、ドイツ）を洗浄します。
5. 列に標識し、透析タンパク質を適用し、それが徐々に列の上に走らせた。
6. 3×20 mlのPBS pH7.4でタンパク質を洗う
7. 溶出液量を減らすために、Ni-NTAカラムに色のバンドを監視しながら、PBS pH7.4の500mMイミダゾール滴下してタンパク質を溶出する。
8. 2時間ごとに1:2000の希釈の10mM NAPI pH7.4に溶出液3 xを透析する。
9. 溶出液は、液体窒素中で5×100μlのサンプルとスナップ凍結でアリコートをフィルタ処理するためのフィルタ滅菌0.45μmのシリンジを使用しています。各100μlアリコートで1μg/ mlの - タンパク質の総量は0.5であるべきです。

オプションconcentrationステップ

10. stereotacticalラットの注射のために、タンパク質は、速度-VAC（エッペンドルフコンセントレータ5301）で10倍に濃縮した。最終バッファ条件は100mMのNAPIだった。

α-シヌクレインのラベリング

組換えα-シヌクレインのラベリングと精製は、ニッケル（Ni-NTAカラム）DISC1（598から785）に平行して行われました。合計出発材料は、500μgの代わりにDISC1（598から785）は1 mgであった。

6。ラベル付けされた組換えDISC1（598から785）タンパク質と受信者のSH-SY5Y細胞の治療

1. シード^5×4受信側のSH-SY5Yヒト神経芽腫細胞は恒常的に24ウェルプレートの各ウェル中の滅菌カバーグラス上のGFP-DISC1（598から854）を発現する。
2. 5から10μg/ mlの濃度で細胞培養培地に標識タンパク質を追加し、48〜72時間インキュベートする。
3. PBSのpHは3×7.4細胞を洗浄し、抽出が渇きを5分では0.04％トリパンブルーでellular蛍光。
4. 氷上で10分間PBS pH7.4中4％PFAで細胞を固定し、DAPIマウント培地（Invitrogen、米国）とゴールドを長引かせると滅菌H ₂ Oで1回洗浄し、ガラススライド上にカバースリップをマウントします。
5. レーザー共焦点顕微鏡を走査することによって生成されたZスタック画像に受容細胞によって発現募集タンパク質と共局在して外因的に適用組換えタンパク質の取り込み/侵攻を確認します。しかし、内因性のタンパク質の募集は基本的に宿主細胞タンパク質の侵攻と並行して検出されないことがあり、Zスタック画像はまだタンパク質の侵襲的な性質を確認することができます。

私たちの例のRECに。 DISC1（598から785）*少なくとも一部の新兵に可溶性DISC1（598から854）は、宿主細胞（ 図5Aを参照）によって発現されたタンパク質をGFPタグ付き。組換えα-シヌクレインの侵略が、ノー募集のため（ 図5B）が示されている。写真を撮ったツァイスLSM 510共焦点上またはツァイスAxioVisionのApotome2顕微鏡。

濃縮の注射でさえ動物の灌流後に検出することができる注射部位の周りにタンパク質の拡散でMPFC結果にDISC1（598から785）*を標識した（2.5μg/μLのの約4μl）を、ローダミンのfiltersetを含むPBS pH7.4中4％PFA。今回の例ではDISC1（598から785）はニューロンの異なる数によって巻き取られると、Zスタック画像（ 図6）を使って監視できます。

一般的には、他のタンパク質の注射は、次にここで使用されているものは、必ずしも細胞浸潤につながらない。侵入イベントがタンパク質の性質上基本的に依存している、それにもかかわらず、きれいな精製は、さらなる分析のための前提条件です。

7。代表的な結果

NLFの細胞から精製された組換えフロリダDISC1-EGFPから成るアグレソームは、受取人、SH-SY5Y CEを侵略共焦点顕微鏡（ 図3）との共局在化によって見られるように、低効率でLLS（約^{0.3％5）。}既報の通り、DISC1（598から785）が発現し、 大腸菌から精製⁴多量に形成された大腸菌は、ポジティブコントロール（ 図5B）のように並列で使用されていたα-シヌクレインと同様の約^20％5（ 図5A）の効率で均等に細胞侵襲的であった。標識された組換えDISC1（598から785）、Eから発現させ、精製し多量体タンパク質は、定位的にラットの内側前頭前野（; PUM、ベイダー、ヒューストン、Korth、未発表の図6）に注入したときに大腸菌は in vivo においてもニューロンに細胞侵襲的であった。

図1のNLF神経芽細胞は一過性のFP-DISC1（赤色）を発現する。赤色蛍光アグレソームはdeteすることができます細胞内CTED。

ショ糖勾配で精製後2。精製mRFPをタグ付きDISC1アグレソーム図 。

図3に侵攻アグレソームの蛍光画像。 mRFPをタグ付きflDISC1アグレソームはDISC1には、（598から854）を過剰発現する可溶性のGFPタグSH-SY5Y神経芽腫細胞を用いて精製し、インキュベートした。ラベル付きアグレソームの取り込みはレーザースキャン顕微鏡（Zeiss LSM 510）上のZ-スタックイメージングによって監視されています。

図4 recのSEC-プロファイル。 S704とC704の一塩基多型（SNP）を含むDISC1（598から785）。両方の変異体は、順序付けられたオリゴマーの中断および高分子量MULTの形成を示すimers（赤矢印）。この写真はLeliveld らの出版物。、生化学、2009年から変更されています。

図5。侵襲DyLight標識組換えDISC1（598から785）の蛍光Zスタック画像。水溶性のGFP-DISC1を（598から854）を発現するSH-SY5Y神経芽細胞は、5μg/ mlの濃度で標識された組換えタンパク質とともにインキュベートした。 （A）は赤の集計はRECの侵略を示しています。 DISC1（598から785）タンパク質と黄色のドットの集合体に水溶性のGFP-DISC1（598から854）の動員を示す。 （b）組換えα-シヌクレイン（赤）が約20％の頻度で募集せずに細胞に侵入する。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図6の免疫蛍光画像注入されたラベルが付いた組換えDISC1（598から785）タンパク質。 Z-スタックイメージングは​​RECの存在を確認する。 DISC1（598から785）の神経核（NeuN、緑）に対する抗体で染色したラット皮質ニューロンにおけるタンパク質。

Discussion

本研究では、トランスフェクトされた神経芽腫細胞株、組換えDISC1タンパク質種の準備とラベリングし、in vitro および in vivo での受容細胞の細胞侵入実験でそれぞれのアプリケーションからmRFP/eGFP-DISC1アグレソームの精製について説明します。

ネイティブmRFP/eGFP-DISC1アグレソームの精製は、レビー小体のような構造と大きな凝集体^13,14を分離するためのプロトコルから開発されたが、洗剤の使用を回避し、発生する可能性の細胞浸潤、偽陽性のリスクを最小限にするように変更されました洗剤促進性膜浸透に起因する。

一つの可能​​な将来の改善がさらに完全にアグレソームから残っている膜と細胞骨格を分離するために、超音波処理によってアグレソームの純度を高めるためにあるかもしれない。 、大アグレソームミリアンペアのために記録合計侵攻イベントの数を全体の純度を高めることによりyは^5を増加させること。私たちが提案した3相スクロースの限られた定義は、他のタンパク質種のアグレソームために十分であるかどうかをテストする必要があり、この意味では、プロトコルがここに概説さは、個々の最適化のための出発点として考慮されるべきである。精製アグレソームは、スクロースの痕跡が著しく全体の収率を低下させなかった排除するために、追加の洗浄工程（洗剤なしで）、私たちの手の中に非常に堅牢であることが判明した。

前の刊行物では、DISC1のオリゴマーアセンブリはC末端^4（ 図4）に明確な多量体化ドメインに依存していることを説明した。我々は、 大腸菌での組換え可溶性発現のために、この断片を選択しました大腸菌および後続とNi-NTA精製。その多量体化を監視するには、α-シヌクレインのように記載される細胞侵襲性のタンパク質とその細胞の浸潤を比較するために、我々は、蛍光色素DyLight594とDISC1（598から785）を標識し、比較してその均等に標識したα-シヌクレインのそれと細胞浸潤。組換えDISC1断片の細胞浸潤は劇的ネイティブ、全長DISC1アグレソームを、おそらくそれより小さいサイズとはるかに高い純度のためのそれに比べて増加した。繰り返しになりますが、純度は細胞浸潤に決定的な役割を果たしているように見える。

今回の例では侵襲アグレソームは、組換え可溶性、 すなわち細胞分散された形態で発現させた標的細胞株の可溶性ホモログタンパク質を募集した。それがZ-スタックイメージング経由受容細胞の制限内に侵襲アグレソームと組換えタンパク質の共局在化を可能にするので、レシピエント細胞ラインの蛍光タンパク質（ 例えば、GFPまたはRFP）の発現が利点です。

大腸菌から発現および精製された細胞侵襲性DISC1のアグレソームおよび多量の断片大腸菌は、DISC1、DIに関連するタンパク質コンフォメーション病の決定的な特徴かもしれませんSC1opathies ^15。

トラブルシューティング：

ショ糖勾配精製後の低aggresome収率：

このプロトコルで導入されたショ糖勾配はeGFP/mRFP-DISC1（フロリダ州）アグレソームでうまく動作します。他のタンパク質からなるアグレソームは変数の次元があるかもしれない従ってスクロース濃度は、他のユーザによって最適化されるべきである。

組換えタンパク質の精製が不十分：

組換えタンパク質の精製プロセスの任意の細菌汚染は、プロトコルの後の手順でラベル付けされます。汚染を避けるために、SDS-PAGEでタンパク質を実行し、組換えタンパク質は、クーマシーブルーで染色することにより、純粋な少なくとも95％であることを確認します。最高の品質と収量を確保するために、プロトコルは、個々の蛋白質のために最適化する必要があります。

低ラベリングEF組換えタンパク質のFICIENCY：

遊離SH基を含む任意の汚染は、タンパク質の効率的な標識を減少させるであろう。したがって、大規模な透析とNi-NTAベースの浄化は必須です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093	Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
DMEM/F-12	Invitrogen	11320-033	Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
PBS	Invitrogen	14190-250
Metafectene	Biontex	T020-1.0	Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol.
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210	The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well.
DNase I	Roche	04716728001	There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062	Serum-free medium works as well
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122	Supplement for SH-SY5Y and NLF medium
Non-essential-amino-acids (NEAA)	Sigma-Aldrich	M7145	Supplement for SH-SY5Y medium
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154	Toxic reagent
DyLight 594 Maleimide	Thermo-Fisher Scientific	46608	Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors.
ProLong Gold with DAPI	Invitrogen	P36935	This antifade liquid mountant gave superior results in our hands.
Protease Inhibitor cocktail	Roche	11873580001	Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution.
Synthetic a-synuclein	Sigma	S7820	Refold as described in text.
Table of specific reagents.
Precellys 24	Bertin Technologies	03119.200.RD000	We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol.
5301 Concentrator (speedvac)	Eppendorf	5301 000.210	Only necessary if protein has to be concentrated.
LSM 510 and Axiovision Apotome2	Zeiss	See manufacturers catalog	Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events.
Cell culture plastic material	Nunc	10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475	The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here.
Table of specific material and equipment.
Number Buffer name content Comments 1. Bacterial growth medium 16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml carbencillin, 35 μg/ml chloramphenicol Grow bacteria to OD600: 0.6-0.8 induce expression with 1 mM IPTG. 2. Bacterial resuspension buffer 50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lysozyme, 20 mM MgCl2 and 400 U/50 ml DNase I Resupend bacterial pellet from 1 L overnight culture in 50 ml resuspension buffer. 3. Protein extraction buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME 4. Ni-NTA column wash buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME, 12 mM imidazole Modified extraction buffer with 12 mM imidazole added. 5. Ni-NTA column elution buffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA and 10 mM b -ME The elution buffer contains 10 mM b -ME, which is dialyzed later on. 6. PBS 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4, adjust to pH 7.4 7. Labeling buffer PBS containing 5 mM TCEP Table of recipes.