Summary
Поколения, очистки и клеточной вторжения внутриклеточных, цитоплазматические полную длину DISC1 белка aggresomes из клеточных культур и помечены, мультимерные рекомбинантного DISC1 фрагмент белка в
Abstract
Агрегации белков рассматривается как общий признак хронических дегенеративных заболеваний мозга, как, например, в нейродегенеративных заболеваний, болезни Альцгеймера (Ар, тау), болезнь Паркинсона (α-синуклеина), болезнь Хантингтона (полиглутаминовых, гентингтина), и другие. Агрегации белков, как полагают, происходят из-за нарушения proteostasis, то есть дисбаланс между возникновением и деградации неправильно свернутых белков. Следует отметить, что те же белки находятся собраны в спорадическими формами этих заболеваний, которые мутанта в редких вариантах семейных формах.
Шизофрения является хроническим прогрессирующим состояние мозга, что во многих случаях идет вместе с постоянными и необратимыми когнитивного дефицита. В подходе гена кандидата, мы исследовали, может ли Нарушенные-в-шизофрения 1 (DISC1), ген, клонированный в шотландской семьи с привязкой к хроническим психическим заболеванием 1, 2, может быть найдено в виде нерастворимых агрегатов в Braiп спорадических случаев шизофрении 3. Использование CC SMRI, мы определили примерно в 20% случаев с CMD, но не нормальное управление или пациентов с нейродегенеративных заболеваний sarkosyl нерастворимые DISC1 иммунореактивности после биохимического фракционирования. Последующие исследования в пробирке показали, что агрегация склонность DISC1 под влиянием болезни связанные полиморфизма S704C 4, и что DISC1 aggresomes генерируется в пробирке клетки были инвазивные 5, подобное тому, что было показано для Ар 6, тау 7-9, α -синуклеина 10, полиглутаминовых 11, или SOD1 агрегатов 12. Эти результаты побудили нас предположить, что по крайней мере подмножество случаев с CMD, те, с общей DISC1 может быть белка конформационные нарушения.
Здесь мы расскажем, как мы генерируем DISC1 aggresomes в клетках млекопитающих, очистить их от градиента сахарозы и использовать их для клеточной инвазии StudiES. Кроме того, мы расскажем, как мы создаем исключительно мультимерные С-концевой фрагмент DISC1, этикетки и очистить его для исследования клетки инвазивности. Использование рекомбинантных мультимеры DISC1 мы достичь аналогичных инвазивности клетки, как и для аналогичной надписью синтетических α-синуклеина фрагмент. Мы также показываем, что этот фрагмент взят в естественных условиях, когда стереотаксически вводили в мозг получателя животных.
Protocol
1. Подготовка Aggresome клетки донора: Трансфекция мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP) или расширенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP)-отмеченном человека Full Length (Флорида) DISC1
- Семенной 1,5 х 10 6/10 см блюдо нейробластомы человека NLF (НПР; Детской больницы Филадельфии, Филадельфия, Пенсильвания) клеток в десяти 10 см блюд и расти в течение ночи. NLF клетки культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS, пенициллин / Strepomycin, L-глютамин. На следующий день, клетки должны быть на уровне 70-80% слияния.
- Временно трансфекции каждые 10 см Блюдо с 15 мкг плазмидной ДНК и Metafectene реагентов трансфекции (Biontex, Martinsried, Германия). Короче говоря, для 10 см блюдо, 15 мкг плазмидной ДНК и 30 мкл Metafectene были добавлены к 750 мкл Opti-MEM, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин. 5 блюд трансфицировали pcDNA3.1 mRFP / УЗФБ с метками человека (Флорида) DISC1 и 5 блюд с EGFP-плазмиды в одиночку.
2. AggresomeОчистка от трансфицированных клеток донора
Протокол, описанный здесь, является сочетание методов для очистки Леви-органов из мозговой ткани 13 и протокол выделить крупные агрегаты и aggresomes 14. Так как уже существующие методы основаны на использовании моющих средств, изоляции моющие средства без белков для применения в клеточной инвазии анализа имеет решающее значение.
- 48 ч после трансфекции, следить за выражением УЗФБ и mRFP/eGFP-DISC1 и подтвердить образование aggresomes под флуоресцентным микроскопом (рис. 1).
- Вымойте клетки с PBS рН 7,4, царапина с 400 мкл PBS каждому, добавить 1X коктейля ингибитора протеазы (Roche, Indianapolis, IN) и разрушают клетки, используя Precellys24 гомогенизатора (Бертен технологий, Франция). Короче говоря, добавляют 1 мл клеточной суспензии в 2-х трубной лизиса мл и добавляют 10 керамические бусины. Лизиса клеток с 3 х 60 импульсов сек. Механической силой процесса можетповышения температуры внутри образца выше 37 ° С, так следует позаботиться, чтобы охладить образец на лед после лизиса процедуры.
- Охладить клетки на льду и добавляют 10 мМ MgCl 2, 40 ед / мл ДНКазы и инкубировать в течение 60 мин при 37 ° C
- Подготовка решений 80%, 50%, 20% сахарозы (вес / объем) в PBS рН 7,4 (10 мл каждая).
- Подготовка градиента сахарозы в 15 мл трубки сокола, начиная с 2 мл 80% сахарозы, затем 50% и 20%. Залить градиентом медленно и будьте осторожны, чтобы не нарушить уже налил слоев. Слой переваривается лизат в верхней части градиента и центрифуги в течение 15 мин при 1000 мкг при 4 ° C.
- Осторожно собрать межфазных между 50-80% сахарозы слоя с помощью пипетки и смешать с 5 объемами PBS рН 7,4. Центрифуга в течение 15 мин при 1000 мкг при 4 ° C. Повторите промывание два раза. В этом интерфазе, aggresomes являются люминесцентные и могут быть визуализированы в микроскоп, под воздействием ультрафиолетового излучения.
- Удалите супернатант иресуспендируют осадок в 250-500 мкл PBS рН 7,4. Этот осадок содержит очищенный aggresomes (рис. 2).
3. Лечение получателя SH-SY5Y Клетки с mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes
- Семенной 5 х 10 4 получателем SH-SY5Y человеческих клеток нейробластомы конститутивно выражения GFP-DISC1 (598-854) на стерильные покровные стекла в каждую лунку 24-луночный планшет. SH-SY5Y клетки культивируют в DMEM/F-12 среде с добавлением пенициллина / стрептомицина, без незаменимых аминокислот (NEAA) и 10% FBS.
- 24 час позже, добавьте 10 мкл в каждую лунку и инкубировать в течение 48-72 часов.
- Вымойте клетки: 3 х PBS рН 7,4 и утолить внеклеточной флуоресценции с 0,04% трипановым синим в течение 5 мин.
- Исправить клетки с 4% PFA в PBS рН 7,4 в течение 10 мин на льду, мыть один раз стерильной H 2 O и установить покровные на предметные стекла с золотой продлить с DAPI монтаж среды (Invitrogen, США).
- Подтвердите поглощение /вторжение экзогенно применяется aggresomes по колокализации работу с белками выраженных клеток реципиента в Z-стек изображений.
Тем не менее, поглощение / Вторжение экзогенных белков не может быть обнаружено по существу параллельно с набором хозяин клеточного белка. В нашем примере mRFP с метками DISC1 aggresomes новобранца растворимые GFP с метками DISC1 (598-854) белок выразил в клетку-хозяина (см. Рисунок 3). Представленные фотографии были сделаны на Zeiss LSM 510 конфокальной или микроскоп Zeiss AxioVision Apotome2.
4. Поколение рекомбинантных DISC1 (598-785)
В предыдущей публикации мы проанализировали способность различных DISC1 фрагменты белка самостоятельно взаимодействовать на основе наличия самоассоциации области. Среди всех белковых фрагментов испытания человека DISC1 (598-785) отображается самая сильная склонность мультимеризацию 4 (рис. 4). Таким образом, человек DISC1 (598-785), был клонирован в pET15b (нетVagen, Madison, Wisconsin), содержащих N-терминал 6-гистидин тегов, выраженное в E. палочки BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, США), и очищенный в денатурирующих условиях в 8 моль / л мочевины, как описано 4. Короче говоря, протокол приводится ниже.
- BL21-(IDE3) Rosetta E. палочки были выращены в 2 х 500 мл 2YT, содержащего 5 мМ-аргинин-HCl, 5 мМ MgSO4, 100 мкг / мл carbencillin, 35 мкг / мл хлорамфеникола до OD 600: 0.6-0.8 и DISC1 (598-785) выражение индуцированного с 1 мМ IPTG.
- DISC1 (598-785) была высказана в течение 4 часов при 37 ° C, выражение было прекращено, собирая бактерии путем центрифугирования.
- Бактериальных ресуспендировали в 50 мл ТЕ-буфера (50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 5 мМ EDTA) плюс 2 мМ PMSF, 1% TX-100, 250 мкг / мл лизоцима, 20 мМ MgCl 2 и 400 мл U/50 ДНКазы I. Для обеспечения полного лизиса, реакция инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
- Добавить 10 мМ β-mercaptoethanol (ME) и 500 мМ NaCl и инкубировать в течение еще 30 мин.
- Спином вниз бактериальных телец включения при 20000 г в течение 30 мин при 4 ° C.
- Ресуспендируют гранул в 50 мл экстракционного буфера содержащего 50 мМ Трис, рН 8,0, 5 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 8 М мочевины и 10 мМ β-ME и удаления мусора с помощью центрифугирования при 20000 г в течение 30 мин при 4 ° C.
- Вымойте Ni-NTA агарозы матрицу с буфером для экстракции. Инкубируйте ресуспендированных, precleared экстракт белка с Ni-NTA матрицы в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Вымойте Ni-NTA матрица с добычей буфера, содержащего 12 мМ имидазола.
- Элюируйте белка медленно с 15 мл элюции буфером, содержащим 50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазола, 8 М мочевины, 1 мМ PMSF, 5 мМ ЭДТА и 10 мМ β-ME.
- Диализировать белка поэтапно в PBS рН 7,4, содержащем 10 мМ β-ME.
Из 1 л бактериальной культуры, начиная можно выделить до 50 мг рекомбинантного DISC1 (598-785), протЭйн.
α-синуклеина рефолдинг
Для экспериментов с α-синуклеина, 500 мкг рекомбинантного белка (Sigma-Aldrich, США) растворяли в PBS в концентрации 1 мг / мл. Для получения олигомеров, рефолдинг была выполнена в течение ночи при 37 ° C, как описано в предыдущей публикации 10.
5. Маркировка рекомбинантного DISC1 (598-785) с DyLight594
- До последующего процесса маркировки, DISC1 (598-785) белка быть освобождены от β-ME. Таким образом, белок диализуют 3 раза PBS рН 7,4 в разведении 1:2000.
- Метка 1 мг DISC1 (598-785) с DyLight 594 малеимида (Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, растворить 1 мг / мл белка в PBS рН 7,4 и добавьте 5 мМ TCEP восстановить бесплатное тиоловых групп. Добавить 20 мкл ДМФ растворяли краски реакции и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Диализировать белка 3 х в PBS рН7,4 при соотношении 1:2000 в течение 2 часов каждая.
Для дальнейшего повышения чистоты меченых белков Его 6-отмеченных привязку очистки на Ni-NTA колонке выполняется.
- Вымойте 1 мл Ni-NTA матрицы (Qiagen, Германия) с 10 мл PBS рН 7,4.
- Применение меченых, диализуют белка в колонну и дайте ему поработать над колонной медленно.
- Вымойте белка с 3 х 20 мл PBS рН 7,4
- Элюируйте белка с PBS рН 7,4, 500 мМ имидазола по каплям при мониторинге цветные полосы на Ni-NTA колонке для уменьшения объема элюата.
- Диализировать элюата 3 х до 10 мМ NaPi рН 7,4 в разведении 1:2000 в течение 2 часов каждая.
- С помощью стерильного шприца 0,45 мкм фильтр для фильтрации элюата, аликвоты в 5 х 100 мкл образцов и оснастки замораживание в жидком азоте. Общее количество белка должно составлять 0,5 - 1 мкг / мл в каждый 100 мкл.
дополнительно концентрATION шаг
- Для стереотаксической инъекции крыс, белок был сосредоточен 10-кратный в скорости переменного тока (Eppendorf Концентратор 5301). Окончательные условия буфер 100 мМ NaPi.
α-синуклеина маркировки
Маркировки и очистки (Ni-NTA колонке) рекомбинантного α-синуклеина был выполнен параллельно с DISC1 (598-785). Общее исходное вещество было 500 мкг вместо 1 мг для DISC1 (598-785).
6. Лечение получателя SH-SY5Y Клетки с Маркированный рекомбинантного DISC1 (598-785) Протеин
- Семенной 5x10 4 получателем SH-SY5Y человеческих клеток нейробластомы конститутивно выражения GFP-DISC1 (598-854) на стерильные покровные стекла в каждую лунку 24-луночный планшет.
- Добавить меченого белка в среде для культивирования клеток в концентрации 5-10 мкг / мл и инкубируют в течение 48-72 часов.
- Вымойте клетки: 3 х PBS рН 7,4 и утолить добычеellular флуоресценции с 0,04% трипановым синим в течение 5 мин.
- Исправить клетки с 4% PFA в PBS рН 7,4 в течение 10 мин на льду, мыть один раз стерильной H 2 O и установить покровные на предметные стекла с золотой продлить с DAPI монтаж среды (Invitrogen, США).
- Подтвердите поглощение / вторжения экзогенно применяется рекомбинантный белок по колокализации работу с белками выраженных клеток реципиента в Z-стек изображения, создаваемые при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Тем не менее, набор эндогенного белка не может быть обнаружено по существу параллельно с вторжением хозяин клеточного белка, Z-стек изображений все еще может подтвердить инвазивный характер белка.
В нашем примере рек. DISC1 (598-785) * по крайней мере в части новобранцев растворимые GFP с метками DISC1 (598-854) белок выразил в клетку-хозяина (рис. 5А). Для рекомбинантного α-синуклеина вторжения, но не призыв показано на рисунке (рис. 5б). Представленные фотографии были сделанына Zeiss LSM 510 конфокальной или Zeiss AxioVision Apotome2 микроскоп.
Введение концентрированного (около 4 мкл 2,5 мкг / мкл), обозначенный DISC1 (598-785) * в MPFC результаты в распространении белка вокруг места инъекции, которые могут быть обнаружены даже после перфузии животных с 4% PFA в PBS рН 7,4 с родамина filterset. В нашем примере DISC1 (598-785) занимают различные числа нейронов и могут быть проверены с Z-стека изображений (рис. 6).
В целом, введение белков, отличных от тех, которые используются здесь, не обязательно приводят к клеточной вторжения. Вторжение событие существенно зависит от природы белка, тем не менее, чистый очистка является необходимым условием для дальнейшего анализа.
7. Представитель Результаты
Aggresomes, состоящий из рекомбинантного FL DISC1-EGFP очищенный из клеток NLF вторглись получателя SH-SY5Y сеООО с низкой эффективностью (около 0,3% 5), как показано на колокализации с конфокальной микроскопии (рис. 3). Как сообщалось ранее, DISC1 (598-785) выразили и очищают от E. палочки образуется мультимеров 4 были одинаково клетки-инвазивных при КПД около 20% 5 (рис. 5А) похож на α-синуклеина, который был использован в параллельном качестве положительного контроля (рис. 5В). Маркированный рекомбинантного DISC1 (598-785) выразили и очищают от E. палочка была также клетки-инвазивной для нейронов в естественных условиях, когда мультимерные белка стереотаксически вводят в медиальной префронтальной коре крыс (рис. 6; Pum, Bader, Хьюстон, Korth, не опубликовано).
Рисунок 1. Клеток нейробластомы NLF временно выражения FP-DISC1 (красный). Красные флуоресцентные aggresomes может быть детеИДКТК в клетках.
Рисунок 2. Очищенный mRFP с метками DISC1 aggresomes после очистки в градиенте сахарозы.
Рисунок 3. Флуоресцентная картина вторглись aggresomes. mRFP с метками flDISC1 aggresomes были очищены и инкубировали с SH-SY5Y клеток нейробластомы гиперэкспрессией растворимые GFP с метками DISC1 (598-854). Поглощения меченого aggresomes контролируется Z-стек изображений на Laser-Scan микроскоп (Zeiss LSM 510).
Рисунок 4. SEC-профиль рек. DISC1 (598-785), содержащих S704 и C704 одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP). Оба варианта показывают нарушение приказал олигомеризации и формирования высокого молекулярного веса мультimers (красная стрелка). Эта картина изменилась с момента публикации Leliveld и соавт., Биохимии 2009 года.
Рисунок 5. Флуоресцентные Z-стек картина инвазивных DyLight-меченых рекомбинантных DISC1 (598-785). SH-SY5Y клеток нейробластомы выразив растворимой GFP-DISC1 (598-854) инкубируют с меченым, рекомбинантного белка в концентрации 5 мкг / мл. (A) Красный агрегатов показывает вторжение в Рек. DISC1 (598-785), белки и желтые точки показывают набора растворимых GFP-DISC1 (598-854) в агрегатах. (B) рекомбинантного α-синуклеина (красный) проникает в клетки без набора с частотой около 20%. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 6. Иммунофлуоресцентного картинувводили меченый, рекомбинантный DISC1 (598-785) белка. Z-стек изображений подтверждает наличие рек. DISC1 (598-785) белков в нейронах коры головного мозга крысы окрашивали антителами против нейронов ядер (NeuN, зеленый).
Discussion
В этой работе мы описываем очистки mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes из трансфицированных линии клеток нейробластомы, подготовка и маркировки рекомбинантного белка DISC1 видов и их применение в клеточной вторжения экспериментов клетки реципиента в пробирке и в естественных условиях.
Очистка родной mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes была разработана с протоколами, чтобы изолировать тело Леви-структур и крупных агрегатов 13, 14, но изменен, чтобы избежать использования моющих средств и минимизировать риск ложных положительных клеток вторжения, которые могут возникнуть в связи с моющим средством при содействии проницаемости мембран.
Одним из возможных улучшение будущем может быть, чтобы еще больше повысить чистоту aggresomes с помощью ультразвука полностью отделить оставшиеся мембраны и цитоскелета от aggresomes. При увеличении общей чистоты, общее количество событий вторжения, зафиксированного на большой aggresomes маУ быть увеличена 5. Если ограниченное определение из предложенных 3-фазный сахарозы является достаточным для aggresomes других видов белка должна быть проверена, в этом смысле протокол изложенные здесь следует рассматривать в качестве отправной точки для индивидуальной оптимизации. Очищенный aggresomes оказались весьма надежными в наших руках, дополнительные шаги стирки (без моющих средств), чтобы устранить следы сахарозы не значительно уменьшить общий выход.
В предыдущей публикации мы рассказали, что олигомер сборки DISC1 зависит от различных областей мультимеризацию в С-концом 4 (рис. 4). Мы выбрали этот фрагмент для рекомбинантного растворимого выражение в E. палочки и последующих и Ni-NTA очистки. Чтобы следить за его мультимеризацию и сравнить его клетки инвазивность с описанным клеточного белка, как инвазивные α-синуклеина, мы обозначили DISC1 (598-785) с флуоресцентным красителем DyLight594, и сравнил ееклеточных инвазивность с одинаково помечены α-синуклеина. Клеточных инвазивности рекомбинантного DISC1 фрагмент резко возросло по сравнению с родным, полная длина DISC1 aggresomes, вероятно, из-за меньшего размера и намного выше чистота. Опять же, чистота, кажется, играет решающую роль в клеточной инвазии.
В нашем примере инвазивных aggresomes работу растворимого белка гомолог линии клеток-мишеней, который был рекомбинантно выражается в растворимые, то есть клетки-дисперсной форме. Выражение флуоресцентного белка (GFP например, или RFP) в клеточной линии получателем является преимуществом, так как позволяет колокализации инвазивных aggresomes и рекомбинантных белков в пределах клетки получателя с помощью Z-стек изображений.
Cell-инвазивной DISC1 aggresomes и многомерные фрагменты выразил и очищают от E. палочка может стать определяющей чертой белка конформационного заболевания, связанные с DISC1, DISC1opathies 15.
Поиск и устранение неисправностей:
Температура aggresome выход после очистки сахарозы градиент:
Градиента сахарозы введена в данный протокол хорошо работает с eGFP/mRFP-DISC1 (Флорида) aggresomes. Aggresomes, состоящие из других белков может быть переменных размеров, следовательно, концентрации сахарозы должна быть оптимизирована за счет других пользователей.
Вашем очистки рекомбинантных белков:
Любой бактериальных загрязнений в процессе очистки рекомбинантного белка также будут помечены в последующих шагов протокола. Чтобы избежать загрязнений, запустить белка на SDS-PAGE и убедитесь, что рекомбинантного белка не менее 95% чистой окрашиванием Кумасси-Blue. Для обеспечения высокого качества и урожайности, протокол должен быть оптимизированы для каждого индивидуального белка.
Температура маркировке EFтивность рекомбинантных белков:
Любые загрязнения, которые содержат бесплатные SH-групп снизит эффективную маркировку белка. Таким образом, обширная диализа и Ni-NTA основе очистки является обязательным.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Нейрон-Eranet обнаружить (BMBF 01EW1003) в СК и JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033), чтобы CKVB поддерживается грантом Forschungskommission медицинского факультета Университета Дюссельдорфа.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
References
- Millar, J. K. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).
- St Clair, D. Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet. 336, 13-16 (1990).
- Leliveld, S. R. Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease. J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).
- Leliveld, S. R. Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C. Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).
- Ottis, P. Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes. Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).
- Meyer-Luehmann, M. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, 1781-1784 (2006).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).
- Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change. J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).
- Clavaguera, F. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).
- Desplats, P. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).
- Ren, P. H. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).
- Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).
- Iwatsubo, T. Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease. Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).
- Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. Isolation of aggresomes and other large aggregates. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).
- Korth, C. DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1. Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).