Generation, rening och karakterisering av Cell-invasiva arter DISC1 Protein

Summary

Produktion, rening och cell invasion av intracellulära, cytoplasmiska fulla protein längd DISC1 aggresomes från cellkulturer och en märkt, multimert rekombinant DISC1 proteinfragment i

Abstract

Proteinaggregation ses som en allmän kännetecken av kroniska, degenerativa hjärnan tillstånd som, till exempel, i de neurodegenerativa sjukdomar Alzheimers sjukdom (Ap, tau), Parkinsons sjukdom (α-synuklein), Huntingtons sjukdom (polyglutamine, huntingtin), och andra. Proteinaggregering tros uppstå på grund av störd proteostasis, dvs obalansen mellan uppkomsten och nedbrytning av felveckade proteiner. Av notera är samma proteiner hittades aggregeras i sporadiska former av dessa sjukdomar som är mutant i sällsynta varianter av familjär former.

Schizofreni är en kronisk progressiv hjärna tillstånd som i många fall går längs med en permanent och oåterkallelig kognitiva underskott. I en kandidat gen metod undersökte vi om Störd-i-schizofreni 1 (DISC1), en gen klonad i en skotsk familj med koppling till kronisk psykisk sjukdom ^{1, 2,} kunde hittas som olösliga aggregat i brain sporadiska fall av schizofreni ^3. Med hjälp av SMRI CC identifierade vi i ungefär 20% av fallen med CMD men inte normala kontroller eller patienter med neurodegenerativa sjukdomar sarkosyl olöslig DISC1 immunreaktivitet efter biokemisk fraktionering. Senare studier in vitro visade att sammanläggning benägenhet DISC1 påverkades av sjukdomsassocierad polymorfism S704C ⁴ och att DISC1 aggresomes genereras in vitro var cell-invasiv ^5, liknande vad som visats för Ap ^{6, 7-9} tau, α -synuklein ^{10, 11} polyglutamine, eller SOD1 aggregat ^12. Dessa fynd fick oss att föreslå att åtminstone en delmängd av fall med CMD kan de med aggregerad DISC1 vara protein konformationella störningar.

Här beskriver vi hur vi skapar DISC1 aggresomes i däggdjursceller, rena dem på en sackarosgradient och använda dem för cell-invasivt studies. Likaså beskriver vi hur vi skapar ett exklusivt multimera C-terminala DISC1 fragment, etikett och rena det för studier cell invasivitet. Använda rekombinanta multimerer av DISC1 vi uppnå samma cell invasivitet som för en liknande märkt syntetisk α-synuklein fragmentet. Vi visar också att detta fragment tas upp in vivo när stereotaktiskt injiceras i hjärnan hos mottagande djur.

Protocol

1. Framställning av Aggresome givarceller: Transfektion av Monomer Röd fluorescerande protein (mRFP) eller Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)-märkta humant Full Length (FL) DISC1

1. Frö 1,5 x 10 ^6/10 cm skål mänskligt neuroblastom NLF (NLF, barnsjukhuset i Philadelphia, Philadelphia, PA) celler i tio 10 cm skålar och växa över natten. NLF celler odlas i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% FBS, penicillin / Strepomycin, L-Glutamin. Nästa dag, bör cellerna vara vid 70-80% konfluens.
2. Övergående transfektion varje 10 cm skålen med 15 ug plasmid-DNA och Metafectene transfektion reagens (Biontex, Martinsried, Tyskland). I korthet, för en 10 cm skål, var 15 pg plasmid-DNA och 30 pl Metafectene till 750 pl Opti-MEM, blandades och inkuberades vid RT under 20 minuter. 5 rätter transfekterades med pcDNA3.1 mRFP / EGFP-märkta humana (FL) DISC1 och 5 rätter med EGFP-plasmiden ensam.

2. AggresomeRening från transfekterade donatorceller

Protokollet som beskrivs här är en kombination av en metod för att rena Lewy-kroppar från hjärnvävnad ¹³ och ett protokoll för att isolera stora aggregat och aggresomes ^14. Eftersom redan existerande metoder är baserade på användningen av detergenter, isoleringen av detergent-fritt protein för tillämpning i cell-invasivt analyser är kritisk.

1. 48 timmar efter transfektion, övervaka uttrycket av EGFP och mRFP/eGFP-DISC1 och bekräfta bildningen av aggresomes under ett fluorescensmikroskop (figur 1).
2. Tvätta cellerna med PBS pH 7,4, skrapa med 400 | il PBS vardera, lägg 1X cocktail Protease Inhibitor (Roche, Indianapolis, IN) och sönderdela cellerna med användning av en homogenisator Precellys24 (Bertin Technologies, Frankrike). Kortfattat, tillsätt 1 ml cellsuspension till en 2 ml lys rör och tillsätt 10 keramiska kulor. Lysera cellerna med 3 x 60 sek pulser. Den mekaniska kraft processen kanöka temperaturen i provet över 37 ° C så försiktighet bör vidtas för att kyla provet på is efter lys förfarandet.
3. Kyl cellerna på is och tillsätt 10 mM MgClj _2, 40 U / ml DNas A och inkubera under 60 min vid 37 ° C
4. Bered lösningar av 80%, 50%, 20% sackaros (vikt / volym) i PBS pH 7,4 (10 ml vardera).
5. Förbered sackarosgradient i en 15 ml Falcon-rör, med början med 2 ml 80% sackaros, följt av 50% och 20%. Häll gradienten långsamt och vara noga med att inte störa redan hälls lager. Skiktet digererade lysatet på toppen av gradienten och centrifugera i 15 min vid 1000 xg vid 4 ° C.
6. Försiktigt samla interfasen mellan 50-80% sackaros skikt med en pipett och blanda med 5 volymer av PBS pH 7,4. Centrifugera i 15 minuter vid 1000 xg vid 4 ° C. Upprepa tvätta ytterligare två gånger. I detta interfas, aggresomes är fluorescerande och kan visualiseras i ett mikroskop under UV-ljus.
7. Kasta bort supernatanten ochåtersuspendera pelleten i 250-500 ^ il PBS pH 7,4. Denna pellet innehåller renade aggresomes (figur 2).

3. Behandling av mottagare SH-SY5Y celler med mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes

1. Frö 5 x 10 ⁴ mottagande SH-SY5Y humana neuroblastomceller konstitutivt uttrycker GFP-DISC1 (598-854) på sterila täckglas i varje brunn i en platta med 24 brunnar. SH-SY5Y-cell odlas i DMEM/F-12 medium kompletterat med penicillin / streptomycin, icke-essentiella aminosyror (NEAA) och 10% FBS.
2. 24 h senare, tillsätt 10 | il till varje brunn och inkubera under 48-72 timmar.
3. Tvätta cellerna 3 x med PBS, pH 7,4 och släcka extracellulär fluorescens med 0,04% Trypan Blue under 5 min.
4. Fixera cellerna med 4% PFA i PBS pH 7,4 under 10 min på is, tvätta en gång med sterilt H ₂ O och montera täckglasen på glasskivor med förlänga guld med DAPI monteringsmedium (Invitrogen, USA).
5. Bekräfta upptaget /invasion av exogent tillämpade aggresomes genom samlokalisering med rekryterade proteiner som uttrycks av mottagande celler i Z-stack bilder.

Ändå kan upptag / invasion av exogent protein inte väsentligen detekteras parallellt med rekrytering av värdcellens proteiner. I vårt exempel mRFP-märkt DISC1 aggresomes rekrytera löslig GFP-märkta DISC1 (598-854) protein som uttrycks av värdcellen (se figur 3). Bilder togs på en Zeiss LSM 510 konfokala-eller en Zeiss AxioVision Apotome2 mikroskop.

4. Generering av rekombinant DISC1 (598-785)

I en tidigare publikation vi analyserat förmågan hos olika DISC1 proteinfragment att själv interagera bygger på förekomsten av själv-föreningen domäner. Bland alla proteinfragment testade humana DISC1 (598-785) visade den starkaste multimerisering benägenheten ⁴ (Figur 4). Därför var mänsklig DISC1 (598-785) klonad in pET15b (NejVagen, Madison, Wisconsin) innehållande en N-terminal 6-histidin-tag, uttryckt i E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA) och renades under denaturerande betingelser i 8 mol / l urea som beskrivs ^4. I korthet, är det protokoll som beskrivs nedan.

1. BL21-(IDE3) Rosetta E. E. coli odlades i 2 x 500 ml 2YT innehållande 5 mM-arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbencillin, 35 pg / ml kloramfenikol upp till ett OD _600: 0,6-0,8 och DISC1 (598-785) expression inducerades med 1 mM IPTG.
2. DISC1 (598-785) uttrycktes under 4 h vid 37 ° C, uttrycket avslutades genom skörd av bakterierna genom centrifugering.
3. Den bakteriella pelleten återsuspenderades i 50 ml TE-buffert (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) plus 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 | ig / ml lysozym, 20 mM MgClj och ₂ 400 U/50 ml DNas I. För att säkerställa fullständig lys, reaktionen inkuberades under 30 min vid RT under försiktig omrörning.
4. Lägg 10 mM β-mercaptoethanol (ME) och 500 mM NaCl och inkubera under ytterligare 30 minuter.
5. Centrifugera ner bakteriella inklusionskroppar vid 20,000 g under 30 minuter vid 4 ° C.
6. Återsuspendera pelleten i 50 ml extraktionsbuffert innehållande 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M urea och 10 mM β-ME och avlägsna skräp genom centrifugering vid 20,000 g under 30 minuter vid 4 ° C.
7. Tvätta Ni-NTA-agarosmatrisen med extraktionsbuffert. Inkubera återsuspenderade, förklarnades proteinextrakt med Ni-NTA-matrisen för 2 h vid RT.
8. Tvätta Ni-NTA-matris med extraktionsbuffert innehållande 12 mM imidazol.
9. Eluera proteinet långsamt med 15 ml elueringsbuffert innehållande 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M karbamid, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA och 10 mM β-ME.
10. Dialysera proteinet stegvis till PBS pH 7,4 innehållande 10 mM β-ME.

Från 1 L bakteriell startkultur är det möjligt att isolera upp till 50 mg rekombinant DISC1 (598-785) protein.

α-synuklein återveckning

För experiment med α-synuklein, 500 pg av det rekombinanta proteinet (Sigma-Aldrich, USA) löstes i PBS vid en koncentration av 1 mg / ml. För att erhålla oligomerer har återveckning genomfördes över natten vid 37 ° C såsom beskrivits i en tidigare publikation ^10.

5. Märkning av rekombinant DISC1 (598-785) med DyLight594

1. Innan den efterföljande märkning processen DISC1 (598-785) proteinet har befrias från β-ME. Därför proteinet dialyseras 3 ggr med PBS pH 7,4 vid en utspädning av 1:2000.
2. Etikett 1 mg DISC1 (598-785) med DyLight 594 maleimid (Thermo Scientific, USA) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet, lös 1 mg / ml protein i PBS, pH 7,4 och tillsätt 5 mM TCEP att återvinna fria tiolgrupper. Tillsätt 20 | il av den upplösta DMF färgämnet till reaktionen och inkubera i 2 h vid RT.
3. Dialysera proteinet 3 x med PBS pH7,4 vid ett förhållande av 1:2000 under 2 timmar vardera.

För att ytterligare öka renheten hos det märkta proteinet en His _6-märkt baserade affinitets-rening på en Ni-NTA-kolonn utförs.

4. Tvätta 1 ml Ni-NTA-matris (Qiagen, Tyskland) med 10 ml PBS, pH 7,4.
5. Applicera märkta, dialyserade proteinet till kolonnen och låt den gå över kolonnen långsamt.
6. Tvätta proteinet med 3 x 20 ml PBS, pH 7,4
7. Eluera proteinet med PBS pH 7,4, 500 mM imidazol droppvis under övervakning av färgade bandet på Ni-NTA-kolonn för att minska volymen eluatet.
8. Dialysera eluatet 3 x till 10 mM NaPi, pH 7,4 vid en utspädning av 1:2000 under 2 timmar vardera.
9. Använd en steril 0,45 | im sprutfilter för att filtrera eluatet, alikvoten i 5 x 100 ul prov och snap frysa i flytande kväve. Den totala mängden protein bör vara 0,5 till 1 pg / ml i varje 100 pl alikvot.

tillval concentrtion steg

10. För stereotactical råtta injektioner var proteinet koncentrerades 10-faldigt i en Speed-vac (Eppendorf Concentrator 5301). Den slutliga bufferten villkoret var 100 mM NaPi.

α-synuklein Labeling

Den märkning och rening (Ni-NTA-kolonn) av den rekombinanta α-synuklein utfördes parallellt med DISC1 (598-785). Den totala utgångsmaterialet var 500 pg istället för 1 mg för DISC1 (598-785).

6. Behandling av mottagare SH-SY5Y celler med märkt rekombinant DISC1 (598-785) Protein

1. Seed 5x10 ⁴ mottagande SH-SY5Y humana neuroblastomceller som uttrycker konstitutivt GFP-DISC1 (598-854) på sterila täckglas i varje brunn i en platta med 24 brunnar.
2. Lägg märkta proteinet till cellodlingsmediet vid en koncentration av 5-10 pg / ml och inkubera under 48-72 timmar.
3. Tvätta cellerna 3 x med PBS, pH 7,4 och släcka utvinningellular fluorescens med 0,04% Trypan Blue under 5 min.
4. Fixera cellerna med 4% PFA i PBS pH 7,4 under 10 min på is, tvätta en gång med sterilt H ₂ O och montera täckglasen på glasskivor med förlänga guld med DAPI monteringsmedium (Invitrogen, USA).
5. Bekräfta upptaget / invasionen av exogent tillämpas rekombinant protein genom samlokalisering med rekryterade proteiner som uttrycks av mottagande celler i Z-stack bilder som genereras av laser scanning konfokalmikroskopi. Ändå, kan rekryteringen av endogent protein inte väsentligt detekteras parallellt med invasion av värdcellprotein, kan Z-stack bilder bekräftar fortfarande den invasiva naturen hos proteinet.

I vårt exempel rec. DISC1 (598-785) * åtminstone delvis rekryterar lösliga GFP-märkta DISC1 (598-854) protein som uttrycks av värdcellen (se figur 5A). För rekombinant α-synuklein invasionen men ingen rekrytering visas (Figur 5B). Bilder togspå en Zeiss LSM 510 konfokala-eller en Zeiss AxioVision Apotome2 mikroskop.

Injektionen av den koncentrerade (ca 4 pl 2,5 pg / pl), märkt DISC1 (598-785) * i de mPFC resulterar i spridning av proteinet runt injektionsstället som kan detekteras även efter perfusion av djuret med 4% PFA i PBS pH 7,4 med en rodamin filterset. I vårt exempel DISC1 (598-785) tas upp av en distinkt antal nervceller och kan övervakas med Z-stack imaging (Figur 6).

I allmänhet injektion av proteiner andra då de används här inte nödvändigtvis leda till cell-invasion. Invasionen händelsen är i huvudsak beroende på arten av det protein, är ändå en ren rening en förutsättning för vidare analys.

7. Representativa resultat

Aggresomes bestående av rekombinant FL DISC1-EGFP renat från NLF celler invaderade mottagare SH-SY5Y ceLLS vid låg verkningsgrad (ca 0,3% ⁵⁾ ses som genom samlokalisering med konfokalmikroskopi (Figur 3). Som tidigare rapporterats, DISC1 (598-785) uttryckt och renat från E. E. coli bildade multimerer ⁴ var lika cell-invasiv vid en effektivitet av cirka 20% ⁵ (figur 5A) som liknar den hos α-synuklein som användes parallellt som positiv kontroll (figur 5B). Märkt rekombinant DISC1 (598-785) uttryckt och renat från E. coli var också cell-invasiv till neuroner in vivo när det multimera proteinet stereotaktiskt injiceras i mediala prefrontala cortex hos en råtta (Figur 6, Pum, Bader, Huston, Korth, opublicerad).

Figur 1. NLF neuroblastomceller som uttrycker transient FP-DISC1 (röd). Röda fluorescerande aggresomes kan försämcted inuti cellerna.

Figur 2. Renad mRFP-märkt DISC1 aggresomes efter rening i en sackarosgradient.

Figur 3. Fluorescerande bild av invaderade aggresomes. mRFP-märkta flDISC1 aggresomes renades och inkuberades med SH-SY5Y neuroblastomceller överuttrycker löslig GFP-märkta DISC1 (598-854). En upptaget av märkta aggresomes övervakas av Z-stapel avbildning på en laser-Scan mikroskop (Zeiss LSM 510).

Figur 4. SEC-profil rec. DISC1 (598-785) innehåller S704 och C704 (single nucleotide polymorphisms SNP). Båda varianterna visar en störning av beställda oligomerisering och bildningen av högmolekylära multimers (röd pil). Denna bild är modifierad från offentliggörandet av Leliveld et al. Biochemistry 2009.

Figur 5. Lysrör Z-stack bild av invasiv DyLight märkt rekombinant DISC1 (598-785). SH-SY5Y neuroblastomceller som uttrycker lösligt GFP-DISC1 (598-854) inkuberades med märkt, rekombinant protein vid en koncentration av 5 pg / ml. (A) Röda aggregat visar invasionen av rek. DISC1 (598-785) protein och gula prickar visar en rekrytering av lösligt GFP-DISC1 (598-854) i aggregat. (B) Rekombinant α-synuklein (röd) invaderar cellerna utan rekrytering med en frekvens på ca 20%. Klicka här för att se större bild .

Figur 6. Immunofluorescent bild avden injicerade märkta rekombinant DISC1 (598-785) protein. Z-stack avbildning bekräftar närvaron av rek. DISC1 (598-785)-proteinet i råtta kortikala neuroner färgade med en antikropp mot neuronal kärnor (NeuN, grön).

Discussion

I denna studie beskriver vi rening av mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes från en transfekterad neuroblastomcellinje, förberedelse och märkning av ett rekombinant DISC1 protein arter och deras tillämpning i cell-invasionen experiment mottagande celler in vitro och in vivo.

Reningen av nativa mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes utvecklades från protokoll för att isolera Lewy body-liknande strukturer och större aggregat ^{13, 14,} men modifierad för att undvika användning av detergenter och för att minimera risken för falska positiva cell-invasion som kan uppstå på grund av tvättmedel-underlättad membran penetration.

En möjlig framtida förbättringar kan vara i att ytterligare öka renheten hos de aggresomes genom sonikering att helt separata kvarvarande membran och cytoskeleton från aggresomes. Genom att öka totala renhet, det totala antalet invasion händelser som registrerats för stora aggresomes may ökas ^5. Huruvida den begränsade definitionen av vårt förslag 3-fas sackaros är tillräcklig för aggresomes av andra proteiner arter måste testas, i denna mening det protokoll som beskrivs här ska ses som en utgångspunkt för individuell optimering. De renade aggresomes visade sig vara ganska robusta i våra händer, ytterligare steg tvätt (utan rengöringsmedel) för att eliminera spår av sackaros inte signifikant minska den totala avkastningen.

I en tidigare publikation beskrev vi att oligomer montering av DISC1 är beroende distinkta multimerisering domäner i C-terminalen ⁴ (Figur 4). Vi valde detta fragment för rekombinant löslig uttryckning i E. coli och efterföljande och Ni-NTA-rening. Att övervaka multimerisering och jämföra sin cell invasivitet med beskrivna cell-invasiv protein som α-synuklein, märkt vi DISC1 (598-785) med fluorescerande färgämne DyLight594, och jämfört sincell-invasivitet med den av lika märkt α-synuklein. Cell-invasivitet av den rekombinanta DISC1 fragmentet dramatiskt jämfört med den hos nativ, fullängds DISC1 aggresomes, sannolikt på grund av dess mindre storlek och mycket högre renhet. Återigen verkar renhet att spela en avgörande roll i cell-invasivitet.

I vårt exempel de invasiva aggresomes rekryterade lösligt homolog protein av mål-cellinjen som rekombinant uttrycktes i en löslig, dvs cell-dispergerad form. Uttryckningen av ett fluorescerande protein (t.ex. GFP eller RFP) i den mottagande cellinjen är en fördel eftersom den möjliggör samlokalisering av invasiva aggresomes och rekombinanta proteiner inom den mottagande cellen gränsen via Z-stack avbildning.

Cell-invasiva DISC1 aggresomes och multimera fragment uttrycks och renas från E. E. coli kan vara ett utmärkande drag av ett protein konformationssjukdomar sjukdomar relaterade till DISC1, DISC1opathies ^15.

Felsökning:

Låg aggresome utbyte efter sackarosgradient rening:

Den sackarosgradient införas i detta protokoll fungerar bra med eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes bestående av andra proteiner kan vara av varierande dimensioner därför sackaros koncentrationerna bör optimeras av andra användare.

Otillräcklig rening av rekombinant protein:

Eventuella bakteriella föroreningar i reningsprocessen av det rekombinanta proteinet kommer också att märkas i senare steg i protokollet. För att undvika kontaminering, köra proteinet på en SDS-PAGE och bekräfta att det rekombinanta proteinet är åtminstone 95% ren genom färgning med Coomassie-blått. För att säkerställa högsta kvalitet och avkastning har protokollet optimeras för varje enskild protein.

Låg märkning efningsgrad av rekombinanta proteiner:

Eventuella föroreningar som innehåller fria SH-grupper kommer att minska effektiv märkning av proteinet. Därför är omfattande dialys och Ni-NTA baserad rening obligatorisk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093	Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
DMEM/F-12	Invitrogen	11320-033	Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
PBS	Invitrogen	14190-250
Metafectene	Biontex	T020-1.0	Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol.
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210	The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well.
DNase I	Roche	04716728001	There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062	Serum-free medium works as well
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122	Supplement for SH-SY5Y and NLF medium
Non-essential-amino-acids (NEAA)	Sigma-Aldrich	M7145	Supplement for SH-SY5Y medium
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154	Toxic reagent
DyLight 594 Maleimide	Thermo-Fisher Scientific	46608	Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors.
ProLong Gold with DAPI	Invitrogen	P36935	This antifade liquid mountant gave superior results in our hands.
Protease Inhibitor cocktail	Roche	11873580001	Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution.
Synthetic a-synuclein	Sigma	S7820	Refold as described in text.
Table of specific reagents.
Precellys 24	Bertin Technologies	03119.200.RD000	We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol.
5301 Concentrator (speedvac)	Eppendorf	5301 000.210	Only necessary if protein has to be concentrated.
LSM 510 and Axiovision Apotome2	Zeiss	See manufacturers catalog	Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events.
Cell culture plastic material	Nunc	10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475	The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here.
Table of specific material and equipment.
Number Buffer name content Comments 1. Bacterial growth medium 16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml carbencillin, 35 μg/ml chloramphenicol Grow bacteria to OD600: 0.6-0.8 induce expression with 1 mM IPTG. 2. Bacterial resuspension buffer 50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lysozyme, 20 mM MgCl2 and 400 U/50 ml DNase I Resupend bacterial pellet from 1 L overnight culture in 50 ml resuspension buffer. 3. Protein extraction buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME 4. Ni-NTA column wash buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME, 12 mM imidazole Modified extraction buffer with 12 mM imidazole added. 5. Ni-NTA column elution buffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA and 10 mM b -ME The elution buffer contains 10 mM b -ME, which is dialyzed later on. 6. PBS 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4, adjust to pH 7.4 7. Labeling buffer PBS containing 5 mM TCEP Table of recipes.