Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

جيل وتنقية، وتوصيف الأنواع الغازية خلية البروتين DISC1

doi: 10.3791/4132 Published: August 30, 2012

Summary

الجيل، وتنقية الخلايا غزو، السيتوبلازمية داخل الخلايا كامل طول البروتين aggresomes DISC1 من مزارع الخلايا لو، multimeric المسمى المؤتلف جزء من البروتين في DISC1

Abstract

وينظر تجميع البروتين باعتباره السمة المميزة العامة المزمن، وظروف الدماغ التنكسية مثل، على سبيل المثال، في أمراض الاعصاب مرض الزهايمر (Aβ، تاو)، ومرض باركنسون (α-synuclein)، مرض هنتنغتون (polyglutamine، huntingtin)، وغيرها. ويعتقد تجميع البروتين لتحدث نتيجة لاضطراب proteostasis، أي عدم التوازن بين الناشئة وتدهور البروتينات تتجمع. من المذكرة، تم العثور على البروتينات نفس تجميعها في أشكال متفرقة من هذه الأمراض التي هي متحولة في المتغيرات النادرة من أشكال العائلية.

الفصام هو حالة مزمنة الدماغ التقدمية التي في كثير من الحالات يسير جنبا إلى جنب مع العجز المعرفي دائمة لا رجعة فيها. في نهج مرشح الجينات، ونحن التحقيق ما إذا كان يمكن العثور على تعطل في والفصام 1 (DISC1)، استنساخ الجين في أسرة الاسكتلندي مع الربط للأمراض العقلية المزمنة 1 و 2، وغير قابلة للذوبان المجاميع في المخن من حالات متفرقة من الفصام 3. باستخدام CC SMRI، حددنا في ما يقرب من 20٪ من الحالات ولكن ليس مع CMD الضوابط العادية أو المرضى الذين يعانون من أمراض الاعصاب تفاعلية مناعية DISC1 sarkosyl غير قابلة للذوبان بعد تجزئة البيوكيميائية. كشفت دراسات لاحقة في المختبر أن تأثر الميل تجميع DISC1 من تعدد الأشكال من الأمراض المرتبطة بها S704C والتي ولدت DISC1 aggresomes في المختبر كانت الخلية الغازية على غرار ما كان قد تعرض لAβ تاو 7-9، α synuclein-10، polyglutamine 11، أو المجاميع SOD1 12. دفعت هذه النتائج لنا أن أقترح أن ما لا يقل عن مجموعة فرعية من الحالات مع CMD، مع تلك DISC1 المجمعة قد تكون اضطرابات البروتين بتكوين.

نحن هنا وصف الطريقة التي تولد DISC1 aggresomes في خلايا الثدييات، تنقية لهم على التدرج السكروز واستخدامها لخلية الغزو ستوديوفاق. وبالمثل، نحن تصف كيفية إنشاء multimeric حصريا محطة C-DISC1 جزء، والتسمية وتطهيره للدراسات الغزو الخلية. باستخدام multimers المؤتلف من DISC1 نحقق مماثلة الغزو خلية أما جزء α-synuclein الاصطناعية المسمى بالمثل. نعرض أيضا أن يتم أخذ هذه القطعة حتى عندما تم حقنها في الجسم الحي stereotactically في الدماغ من الحيوانات المتلقية.

Protocol

1. إعداد الخلايا المانحة Aggresome: ترنسفكأيشن من البروتين موحودي نيون الأحمر (mRFP) أو المحسن بروتين الفلورية الخضراء (EGFP)-الموسومة كامل المدة الإنسان (FL) DISC1

  1. البذور 1،5 سم × طبق 10 6/10 الإنسان العصبية جبهة التحرير الوطني (جبهة التحرير الوطني؛ مستشفى الاطفال في فيلادلفيا، فيلادلفيا، PA) الخلايا في عشر أطباق 10 سم وتنمو بين عشية وضحاها. يتم استزراع خلايا جبهة التحرير الوطني في المتوسط ​​RPMI-1640 تستكمل مع FBS 10٪، البنسلين / Strepomycin، الجلوتامين L-. في اليوم التالي، يجب أن تكون على خلايا 70-80٪ confluency.
  2. عابر بالنقل كل طبق 10 سم مع 15 ميكروغرام DNA البلازميد وMetafectene كاشف ترنسفكأيشن (Biontex، Martinsried، ألمانيا). وباختصار، لطبق 10 سم، وتمت اضافة 15 ميكروغرام DNA البلازميد و 30 ميكرولتر Metafectene إلى 750 ميكرولتر OPTI-MEM، مختلطة وحضنت في RT لمدة 20 دقيقة. وتقاس مع أطباق 5 pcDNA3.1 mRFP / EGFP الموسومة الإنسان (FL) DISC1 و 5 أطباق مع وحده EGFP-البلازميد.

2. Aggresomeتنقية من الخلايا المانحة بالنقل

بروتوكول الموصوفة هنا هو مزيج من أسلوب لتنقية يوي-الهيئات من أنسجة المخ 13 و بروتوكول لعزل المجاميع الكبيرة وaggresomes 14. وتستند طرق منذ الموجودة بالفعل على استخدام المنظفات، والعزل من المنظفات الخالية من البروتين للتطبيق في الخلية الغزو المقايسات أمر بالغ الأهمية.

  1. 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ورصد التعبير عن EGFP وmRFP/eGFP-DISC1 وتأكيد تشكيل aggresomes تحت المجهر مضان (الشكل 1).
  2. غسل الخلايا مع درجة الحموضة PBS، 7.4 كشط مع 400 ميكرولتر PBS لكل منهما، إضافة 1X كوكتيل مثبط البروتياز (روش، إنديانابوليس، IN) وتعطيل الخلايا باستخدام الخالط Precellys24 (بيرتن التكنولوجيات، فرنسا). لفترة وجيزة، إضافة 1 مل تعليق الخلية إلى أنبوب 2 مل تحلل وإضافة 10 حبات السيراميك. ليز الخلايا مع 3 ثوانى البقول X 60. يجوز للقوة الميكانيكية للعمليةزيادة درجة الحرارة داخل العينة أعلاه 37 درجة مئوية لذا يجب الحرص على البرد العينة على الجليد بعد العملية تحلل.
  3. تبريد الخلايا على الجليد وإضافة 10 ملم MgCl 40 U / مل الدناز A واحتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 ° C
  4. إعداد الحلول من 80٪، 50٪، 20٪ سكروز (ث / ت) في درجة الحموضة PBS 7.4 (10 مل لكل منهما).
  5. إعداد التدرج السكروز في أنبوب 15 مل الصقر، بدءا السكروز مل 2 80٪، تليها 50٪ و 20٪. صب الانحدار ببطء ويجب الحرص على عدم سكب طبقات لزعزعة بالفعل. طبقة المحللة هضمها على رأس التدرج وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1000 XG في 4 درجات مئوية.
  6. جمع بعناية الطور البيني بين طبقة السكروز 50-80٪ مع ماصة وتخلط مع 5 مجلدات من درجة الحموضة PBS 7.4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1000 XG في C. ° 4 تكرار غسل مرتين إضافية. في هذا الطور البيني، هي aggresomes الفلورسنت ويمكن تصور في المجهر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  7. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني ميكرولتر 250-500 درجة الحموضة 7.4. هذا بيليه يحتوي على aggresomes المطهرون (الشكل 2).

3. علاج الخلايا SH-SY5Y المتلقي مع mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes

  1. بذور 5 × 10 4 المتلقي SH-SY5Y الخلايا العصبية البشرية معربا عن GFP-جوهري DISC1 (598-854) على coverslips زجاجية معقمة في كل بئر من لوحة 24 أيضا. يتم استزراع SH-SY5Y خلية في DMEM/F-12 المتوسطة تستكمل مع / الستربتوميسين الأحماض البنسلين غير الضرورية، الأمينية (NEAA) وFBS 10٪.
  2. 24 ساعة في وقت لاحق، إضافة إلى 10 ميكرولتر لكل بئر واحتضان ل 48-72 ساعة.
  3. غسل الخلايا 3 × مع درجة الحموضة 7.4 و PBS إخماد مضان خارج الخلية مع الأزرق التريبان 0.04٪ لمدة 5 دقائق.
  4. إصلاح الخلايا مع PFA 4٪ في الرقم الهيدروجيني 7،4 PBS لمدة 10 دقيقة على الجليد، وغسل مرة واحدة مع العقيمة O 2 H وتحميل coverslips على الشرائح الزجاجية مع إطالة الذهب مع تصاعد دابي المتوسطة (إينفيتروجن، الولايات المتحدة الأمريكية).
  5. تأكيد امتصاص /غزو ​​خارجيا aggresomes التي تطبقها colocalization مع البروتينات المعينين من قبل خلايا المتلقي أعرب في Z-كومة الصور.

بعد، قد لا امتصاص / غزو البروتين الخارجية أساسا يتم الكشف عن بالتوازي مع توظيف بروتين الخلية المضيفة. في مثالنا mRFP الموسومة DISC1 aggresomes تجنيد للذوبان GFP الموسومة DISC1 (598-854) البروتين التي أعربت عنها الخلية المضيفة (انظر الشكل 3). أخذت الصور على LSM زايس 510 مبائر أو مجهر زايس Apotome2 Axiovision.

4. جيل من DISC1 المؤتلف (598-785)

في منشور السابقة قمنا بتحليل قدرة مختلف أجزاء البروتين DISC1 للتفاعل ذاتي قائم على وجود الذات رابطة المجالات. بين جميع البروتين شظايا اختبار الإنسان DISC1 (598-785) عرض الميل الأقوى multimerization 4 (الشكل 4). ولذلك، تم استنساخ الإنسان DISC1 (598-785) في pET15b (لا يوجدvagen، ماديسون، ويسكونسن) التي تحتوي على محطة N-6-الحامض الاميني العلامة، التي أعرب عنها في E. القولونية BL21-(lDE3) رشيد (Novagen، الولايات المتحدة)، وتنقيته في ظل ظروف يبدل طبيعة اليوريا مول / L 8 كما هو موضح 4. وباختصار، هو مبين أدناه البروتوكول.

  1. BL21-(IDE3) E. رشيد كانت تزرع القولونية في 2 مل 500 × 2YT تحتوي على 5 ملم أرجينين، حمض الهيدروكلوريك، 5MM MGSO4، ميكروغرام 100 / مل carbencillin، ميكروغرام / 35 مل الكلورامفينيكول تصل إلى OD 600: كان المستحث 0،6-0،8 وDISC1 (598-785) التعبير مع IPTG مم 1.
  2. وأعرب عن DISC1 (598-785) لمدة 4 ساعة عند C ° 37، إنهاء التعبير حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي.
  3. كان بيليه معلق جرثومي في 50 مل العازلة TE (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 5 ملم EDTA)، بالإضافة إلى 2 مم PMSF، 1٪ TX-100، 250 ميكروغرام / مل الليزوزيم، 20 ملم MgCl 2 و 400 مل U/50 I. الدناز لضمان تحلل كامل، وحضنت رد فعل لمدة 30 دقيقة في RT مع التحريك لطيف.
  4. إضافة β-10 ملي mercaptoethanol (ME) و 500 ملي مول كلوريد الصوديوم واحتضان لمدة 30 دقيقة.
  5. تدور باستمرار إدراج الهيئات البكتيرية على 20.000 ز لمدة 30 دقيقة في C. ° 4
  6. إعادة تعليق بيليه في 50 مل العازلة التي تحتوي على استخراج الرقم الهيدروجيني 8،0 تريس 50MM، 5 إيميدازول مم، 500 مم كلوريد الصوديوم، 8 M اليوريا و 10 ملي β-ME وإزالة الحطام بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  7. غسل ني NTA الاغاروز مصفوفة مع العازلة الاستخراج. احتضان معلق، مستخلصات البروتين توضيحه مسبقا مع ني NTA مصفوفة لمدة 2 ساعة في RT.
  8. غسل مصفوفة ني NTA مع العازلة التي تحتوي على استخراج 12 مم الاميدازول.
  9. أزل البروتين ببطء مع 15 مل العازلة التي تحتوي على 50 ملي شطف تريس، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 300 مم إيميدازول، 8 M اليوريا، 1 ملم PMSF، 5 مم وEDTA 10 ملي β-ME.
  10. Dialyze البروتين تدريجي لدرجة الحموضة 7،4 PBS تحتوي على 10 ملي β-ME.

ثقافة البكتيرية من 1 L بدءا من الممكن عزل تصل إلى 50 ملغ من البروتوكول الاضافي المؤتلف (598-785) DISC1عين.

α-synuclein طوي ثانية

لتم حله مع التجارب α-synuclein، 500 ميكروغرام من البروتين المؤتلف (سيغما الدريخ، الولايات المتحدة الأمريكية) في برنامج تلفزيوني في تركيز 1 ملغ / مل. للحصول على oligomers، تم إجراء طوي ثانية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية كما هو موضح في نشرة السابقة 10.

5. وضع العلامات من DISC1 المؤتلف (598-785) مع DyLight594

  1. قبل عملية وضع العلامات اللاحقة، DISC1 (598-785) بروتين يحتوي على اطلاق سراح من ME-β. لذلك، مدال بروتين 3 مرات لدرجة الحموضة PBS 7،4 في التخفيف من 1:2،000.
  2. التسمية 1 ملغ DISC1 (598-785) مع DyLight 594 maleimide (الحرارية العلمية، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. وباختصار، حل 1 ملغ / مل البروتين في درجة الحموضة 7.4 و PBS إضافة 5 ملي TCEP لاسترداد مجموعات ثيول مجانا. إضافة 20 ميكرولتر من الصبغة DMF حل للتفاعل واحتضان لمدة 2 ساعة في RT.
  3. Dialyze البروتين 3 × لدرجة الحموضة PBS7،4 في نسبة 1:2000 لمدة 2 ساعة لكل منهما.

لمزيد من زيادة نقاء من البروتين المسمى لصاحب 6 الموسومة القائمة على النسب على تنقية يتم تنفيذ عمود ني NTA.

  1. غسل 1 مل ني NTA مصفوفة (QIAGEN، ألمانيا) مع 10 مل PBS درجة الحموضة 7.4.
  2. تطبيق المسمى، مدال بروتين إلى العمود والسماح لها دهس العمود ببطء.
  3. غسل البروتين مع 3 × 20 مل PBS درجة الحموضة 7،4
  4. أزل البروتين مع درجة الحموضة PBS، 7.4 500 ملي نقطه نقطه الاميدازول في حين رصد الفرقة الملونة على العمود ني NTA للحد من حجم شطافة.
  5. Dialyze على شطافة إلى 3 × 10 ملم NaPi درجة الحموضة 7.4 في التخفيف من 1:2000 لمدة 2 ساعة لكل منهما.
  6. حقنة معقمة تستخدم ميكرون 0.45 فلتر لتصفية شطافة، قسامة في 5 عينات 100 × ميكرولتر وتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل. يجب أن المبلغ الإجمالي للبروتين تكون 0،5 حتي 1 ميكروغرام / مل في كل 100 ميكرولتر قسامة.

اختياري concentrأوجه خطوة

  1. لحقن الفئران stereotactical، وتركز على البروتين بمقدار 10 أضعاف في (المكثف إيبندورف 5301) للسرعة بطالة. وكان الشرط عازلة النهائي 100 ملي NaPi.

α-synuclein وصفها

تم إجراء وضع العلامات وتنقية (ني NTA العمود) من synuclein-α المؤتلف بالتوازي مع DISC1 (598-785). كان مجموع المواد ابتداء 500 ميكروغرام بدلا من 1 ملغ للDISC1 (598-785).

6. علاج الخلايا SH-SY5Y المتلقي مع DISC1 المؤتلف عليه (598-785) البروتين

  1. البذور 5x10 4 المتلقي SH-SY5Y الخلايا العصبية البشرية معربا عن GFP-جوهري DISC1 (598-854) على coverslips زجاجية معقمة في كل بئر من لوحة 24 أيضا.
  2. إضافة البروتين إلى الخلية المسمى ثقافة المتوسط ​​بتركيز 5-10 ميكروغرام / مل واحتضان ل 48-72 ساعة.
  3. غسل الخلايا 3 × مع درجة الحموضة 7.4 و PBS إخماد المقتطفellular مضان مع الأزرق التريبان 0.04٪ لمدة 5 دقائق.
  4. إصلاح الخلايا مع PFA 4٪ في الرقم الهيدروجيني 7،4 PBS لمدة 10 دقيقة على الجليد، وغسل مرة واحدة مع العقيمة O 2 H وتحميل coverslips على الشرائح الزجاجية مع إطالة الذهب مع تصاعد دابي المتوسطة (إينفيتروجن، الولايات المتحدة الأمريكية).
  5. تأكيد امتصاص / غزو خارجيا تطبيقها من قبل البروتين المؤتلف مع البروتينات colocalization المعينين من قبل خلايا المتلقي أعرب في Z-كومة الصور التي تم إنشاؤها بواسطة الليزر المجهر متحد البؤر. حتى الآن، قد لا تعيين البروتين الذاتية أساسا يتم الكشف عن بالتوازي مع الغزو من البروتين الخلية المضيفة، ويمكن Z-كومة الصور لا تزال تؤكد طبيعة الغازية من البروتين.

في مثالنا تفصيل. DISC1 (598-785) * على الأقل في جزء المجندين للذوبان GFP الموسومة DISC1 (598-854) البروتين التي أعربت عنها الخلية المضيفة (انظر الشكل 5A). لالمؤتلف الغزو α-synuclein ولكن لا يظهر التوظيف (الشكل 5B). أخذت الصورعلى LSM زايس 510 مبائر أو مجهر زايس Apotome2 Axiovision.

وحقن المركزة (حوالي 4 ميكرولتر من 2.5 ميكروغرام / ميكرولتر)، وصفت DISC1 (598-785) * في نتائج mPFC في نشر البروتين حول موقع الحقن التي يمكن أن يتم الكشف عن حتى بعد نضح من الحيوان مع 4٪ PFA في الرقم الهيدروجيني 7،4 PBS مع filterset رودامين. في مثالنا يؤخذ DISC1 (598-785) من قبل عدد من الخلايا العصبية متميزة ويمكن رصدها مع Z-كومة التصوير (الشكل 6).

وبصفة عامة، حقن البروتينات الأخرى ثم تلك التي استخدمت هنا لا يؤدي بالضرورة إلى غزو الخلايا. حالة الغزو تعتمد أساسا على طبيعة البروتين، مع ذلك تنقية نظيفة هو شرط مسبق لمزيد من التحليل.

7. ممثل النتائج

غزت Aggresomes تتكون من المؤتلف تنقية DISC1-FL EGFP من خلايا جبهة التحرير الوطني المتلقي SH-SY5Y مLLS في انخفاض الكفاءة (حوالي 0.3٪ 5) كما يراها colocalization مع المجهري متحد البؤر (الشكل 3). كما ذكر سابقا، DISC1 (598-785) أعرب وتنقيته من E. شكلت القولونية multimers استشهاد 4 بالتساوي الخلايا الغازية وكفاءة في ما يقرب من 20٪ 5 (الشكل 5A) مماثلة لتلك التي α-synuclein التي تم استخدامها بالتوازي والسيطرة الإيجابية (الشكل 5B). DISC1 المؤتلف المسمى (598-785) أعرب وتنقيته من E. وكان أيضا القولونية الخلايا الغازية إلى الخلايا العصبية في الجسم الحي عندما تم حقن البروتين stereotactically multimeric في قشرة الفص الجبهي الإنسي من الفئران (الشكل 6؛ بوم، بدر، هيوستن، Korth، غير منشور).

الشكل 1
الرقم العصبية جبهة التحرير الوطني 1. الخلايا معربا عن عابر FP-DISC1 (الحمراء). يمكن أن يكون أحمر فلوري aggresomes deteالمديرية داخل الخلايا.

الشكل 2
الشكل 2. تنقية mRFP الموسومة DISC1 aggresomes بعد التدرج في تنقية السكروز.

الشكل 3
الشكل 3. صور من نيون aggresomes غزا. وتنقيته mRFP الموسومة flDISC1 aggresomes وحضنت مع الخلايا العصبية SH-SY5Y overexpressing ذوبان GFP الموسومة DISC1 (598-854). ويتم رصد واستيعاب aggresomes صفت من قبل Z-كومة التصوير على المجهر ليزر المسح الضوئي (زايس LSM 510).

الشكل 4
الشكل 4. SEC-الشخصى تفصيل. DISC1 (598-785) الذي يحتوي على S704 والأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة C704 (SNP). كلا الخيارين تظهر تعطيل oligomerization أمر وتشكيل عالية الوزن الجزيئي multimers (السهم الأحمر). تم تعديل هذه الصورة من نشر Leliveld وآخرون، الكيمياء الحيوية عام 2009.

الشكل 5
الشكل 5. نيون Z-مكدس صورة الغازية التي تحمل علامات DyLight DISC1 المؤتلف (598-785). وحضنت الخلايا العصبية SH-SY5Y معربا عن GFP-DISC1 القابلة للذوبان (598-854) مع المسمى، المؤتلف البروتين بتركيز من 5 ميكروغرام / مل. (A) المجاميع الأحمر يدل على غزو تفصيل. DISC1 (598-785) والبروتين النقاط الصفراء تشير إلى وجود تجنيد GFP-DISC1 القابلة للذوبان (598-854) في المجاميع. (B) المؤتلف α-synuclein (أحمر) يغزو الخلايا دون تردد مع تجنيد نحو 20٪. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 6
الشكل 6. صور مناعي منوصفت حقن، DISC1 المؤتلف (598-785) البروتين. Z-كومة التصوير يؤكد وجود تفصيل. DISC1 (598-785) البروتين في الخلايا العصبية القشرية الفئران ملطخة جسم مضاد ضد نوى الخلايا العصبية (NeuN والأخضر).

Discussion

في هذه الدراسة وصفنا عملية تنقية mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes من الخلايا العصبية خط بالنقل، إعداد ووضع العلامات من نوع البروتين المؤتلف DISC1 وتطبيقها في الخلية الغزو تجارب الخلايا المتلقية في التجارب المختبرية والحية.

وقد تم تطوير عملية تنقية aggresomes mRFP/eGFP-DISC1 الأصلية من البروتوكولات لعزل ليوي الجسم مثل الهياكل وأكبر المجاميع 13 و 14، ولكن تعديل لتجنب استخدام المنظفات وتقليل خطر إيجابية كاذبة الخلية الغزو التي قد تحدث بسبب اختراق الغشاء المنظفات الميسرة.

يمكن للمرء تحسين محتملة في المستقبل يكون في لزيادة نقاء aggresomes من صوتنة إلى الأغشية منفصلة تماما المتبقية والهيكل الخلوي من aggresomes. بواسطة نقاء العام زيادة، وعدد من الأحداث التي سجلت إجمالي غزو لأماه aggresomes كبيرةيمكن زيادة Y 5. وينبغي النظر في ما إذا كان تعريف محدود من السكروز لدينا 3-المرحلة اقترح كافية لaggresomes الأنواع الأخرى البروتين لابد من اختبارها، وبهذا المعنى البروتوكول المذكورة هنا كنقطة انطلاق لتعظيم الاستفادة الفردية. أثبتت aggresomes المنقى أن تكون قوية جدا في أيدينا، غسل خطوات إضافية (بدون المنظفات) للقضاء على آثار من السكروز لم تقلل كثيرا من العائد الكلي.

في منشور السابقة صفنا هذا التجميع قليل وحدات من DISC1 يعتمد على المجالات multimerization متميزة في محطة سي 4 (الشكل 4). اخترنا هذا الجزء لالمؤتلف التعبير القابلة للذوبان في E. القولونية وتنقية لاحقة وني NTA. لرصد وmultimerization لمقارنة الغزو في الخلية مع خلية البروتين الغازية مثل وصف α-synuclein، وصفت ونحن DISC1 (598-785) مع صبغة الفلورسنت DyLight594، ومقارنة لهاخلية الغزو مع أن المسمى بنفس القدر من α-synuclein. وزادت بشكل كبير من الخلايا الغازية من جزء DISC1 المؤتلف مقارنة بما كان عليه من طول، الوطنية الكاملة DISC1 aggresomes، من المحتمل بسبب صغر حجمها ونقاوة أعلى من ذلك بكثير. مرة أخرى، يبدو أن نقاء تلعب دورا حاسما في الغزو الخلية.

في مثالنا جند aggresomes الغازية القابلة للذوبان البروتين نديد هدف خط الخلية التي أعرب recombinantly في ذوبان، وشكل خلية فرقت أي. التعبير عن بروتين الفلورية (مثل GFP أو RFP) في المتلقي خط الخلية هي ميزة لأنها تسمح للcolocalization من aggresomes الغازية والبروتينات المؤتلف ضمن المستفيدة الحد الخليوي عبر Z-كومة التصوير.

aggresomes DISC1 الخلايا الغازية وشظايا multimeric أعرب وتنقيته من E. يمكن أن تكون الإشريكية السمة المميزة لأمراض البروتين المتصلة بتكوين DISC1، DISC1opathies 15.

اطلاق النار المتاعب:

aggresome العائد المنخفض بعد التدرج تنقية السكروز:

التدرج السكروز التي أدخلت في هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد مع aggresomes (FL) eGFP/mRFP-DISC1. قد تتكون من البروتينات Aggresomes أخرى تكون ذات أبعاد متغيرة ولذلك يجب أن يكون الأمثل للتركيز السكروز من قبل مستخدمين آخرين.

عدم كفاية البروتين المؤتلف تنقية:

وينبغي على كل الملوثات البكتيرية في عملية تنقية البروتين المؤتلف يكون المسمى في خطوات لاحقة من البروتوكول. لتجنب التلوث، تشغيل البروتين على SDS-PAGE وتؤكد أن البروتين المؤتلف هو لا يقل عن 95٪ نقية من تلطيخ مع Coomassie أزرق. لضمان أعلى مستويات الجودة والإنتاجية، وبروتوكول يجب أن يكون الأمثل لكل فرد البروتين.

انخفاض العلامات EFficiency من البروتينات المؤتلف:

فإن أي التلوث التي تحتوي على مجموعات حرة SH-تقليل كفاءة وضع العلامات من البروتين. ولذلك، غسيل الكلى واسعة وني NTA تنقية القائمة على إلزامي.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الخلايا العصبية، ERANET اكتشاف (BMBF 01EW1003) لCK وJPH، DFG (كو 1679/3-1؛ GRK1033) لCKVB معتمد من قبل منحة من Forschungskommission من كلية الطب في جامعة دوسلدورف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093 Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
DMEM/F-12 Invitrogen 11320-033 Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
PBS Invitrogen 14190-250
Metafectene Biontex T020-1.0 Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol.
Ni-NTA agarose Qiagen 30210 The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well.
DNase I Roche 04716728001 There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Opti-MEM Invitrogen 31985-062 Serum-free medium works as well
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122 Supplement for SH-SY5Y and NLF medium
Non-essential-amino-acids (NEAA) Sigma-Aldrich M7145 Supplement for SH-SY5Y medium
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154 Toxic reagent
DyLight 594 Maleimide Thermo-Fisher Scientific 46608 Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors.
ProLong Gold with DAPI Invitrogen P36935 This antifade liquid mountant gave superior results in our hands.
Protease Inhibitor cocktail Roche 11873580001 Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution.
Synthetic a-synuclein Sigma S7820 Refold as described in text.
Table of specific reagents.
Precellys 24 Bertin Technologies 03119.200.RD000 We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol.
5301 Concentrator (speedvac) Eppendorf 5301 000.210 Only necessary if protein has to be concentrated.
LSM 510 and Axiovision Apotome2 Zeiss See manufacturers catalog Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events.
Cell culture plastic material Nunc 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here.
Table of specific material and equipment.
Number Buffer name content Comments
1. Bacterial growth medium 16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml carbencillin, 35 μg/ml chloramphenicol Grow bacteria to OD600: 0.6-0.8 induce expression with 1 mM IPTG.
2. Bacterial resuspension buffer 50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lysozyme, 20 mM MgCl2 and 400 U/50 ml DNase I Resupend bacterial pellet from 1 L overnight culture in 50 ml resuspension buffer.
3. Protein extraction buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME
4. Ni-NTA column wash buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME, 12 mM imidazole Modified extraction buffer with 12 mM imidazole added.
5. Ni-NTA column elution buffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA and 10 mM b -ME The elution buffer contains 10 mM b -ME, which is dialyzed later on.
6. PBS 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4, adjust to pH 7.4
7. Labeling buffer PBS containing 5 mM TCEP
Table of recipes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Millar, J. K. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  2. St Clair, D. Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet. 336, 13-16 (1990).
  3. Leliveld, S. R. Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease. J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).
  4. Leliveld, S. R. Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C. Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).
  5. Ottis, P. Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes. Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).
  6. Meyer-Luehmann, M. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, 1781-1784 (2006).
  7. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).
  8. Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change. J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).
  9. Clavaguera, F. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).
  10. Desplats, P. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).
  11. Ren, P. H. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).
  12. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).
  13. Iwatsubo, T. Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease. Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).
  14. Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. Isolation of aggresomes and other large aggregates. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).
  15. Korth, C. DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1. Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).
جيل وتنقية، وتوصيف الأنواع الغازية خلية البروتين DISC1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).More

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter