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Biology

Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

doi: 10.3791/4132 Published: August 30, 2012

Summary

Die Erzeugung, Reinigung und Zellinvasion von intrazellulären, zytoplasmatischen voller Länge DISC1 Protein Aggresomen aus Zellkulturen und einer markierten, multimere rekombinante DISC1 Proteinfragment in

Abstract

Proteinaggregation wird als allgemeines Kennzeichen von chronischen, degenerativen Gehirn Verhältnissen, beispielsweise bei den neurodegenerativen Erkrankungen Morbus Alzheimer (Aß, tau) gesehen, Parkinson-Krankheit (α-Synuclein), Huntington-Krankheit (Polyglutamin, Huntingtin), und andere. Proteinaggregation angenommen wird, entstehen durch gestörte proteostasis, dh das Ungleichgewicht zwischen dem Entstehen und Abbau von falsch gefalteten Proteinen. Zu beachten ist, sind die gleichen Proteine ​​gefunden aggregiert sporadische Formen dieser Krankheiten, die Mutante in seltenen Varianten von familiären Formen sind.

Schizophrenie ist eine chronische, fortschreitende Gehirn Bedingung, dass in vielen Fällen geht einher mit einer dauerhaften und irreversiblen kognitives Defizit. In einem Kandidatengen Ansatz untersuchten wir, ob Störungstag-in-Schizophrenie 1 (DISC1), ein Gen in einer schottischen Familie mit Anbindung an chronischen psychischen Erkrankung 1, 2 geklont, als unlösliche Aggregate im brai gefunden werden konnten der sporadischen Fälle von Schizophrenie 3. Mit dem SMRI CC, identifizierten wir in etwa 20% der Fälle mit CMD aber nicht normalen Kontrollen oder Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen Sarkosyl unlösliche DISC1 Immunreaktivität nach biochemischer Fraktionierung. Nachfolgende Studien in vitro zeigten, dass die Aggregation Neigung DISC1 durch krankheits-assoziierte Polymorphismus S704C 4 beeinflusst wurde, und dass DISC1 Aggresomen in vitro generiert wurden Zell-invasive 5, ähnlich dem, was war für Aß 6 gezeigt, tau 7-9, α -Synuclein 10, Polyglutamin 11 oder SOD1 Aggregate 12. Diese Ergebnisse schlagen vor veranlasste uns, dass mindestens eine Untermenge von Fällen mit CMD solche mit aggregierten Proteins DISC1 könnte konformationelle Erkrankungen.

Hier beschreiben wir, wie wir DISC1 Aggresomen in Säugetierzellen zu erzeugen, reinigen sie auf einem Saccharose-Gradienten und nutzen sie für Zell-Invasivität studies. Ebenso beschreiben wir, wie wir eine ausschließlich multimeren C-terminalen DISC1 Fragment, Label generiert und reinigen es für die Zelle Invasivität Studien. Mit den rekombinanten Multimere DISC1 erreichen wir ähnliche Zell Invasivität wie bei einer ähnlich bezeichneten synthetischen α-Synuclein-Fragment. Wir zeigen, daß dieses Fragment sich in vivo aufgenommen wenn stereotaktisch in das Gehirn des Empfängers Tiere injiziert.

Protocol

Ein. Vorbereitung der Aggresomen Spenderzellen: Transfektion von monomerem Red Fluorescent Protein (mRFP) oder Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-markierten menschlichen Full Length (FL) DISC1

  1. Seed 1,5 x 10 6/10 cm Schale humanen Neuroblastom NLF (NLF; Kinderkrankenhaus von Philadelphia, Philadelphia, PA) Zellen in zehn 10 cm Gerichte und über Nacht wachsen. NLF Zellen werden in RPMI-1640-Medium mit 10% FBS kultiviert, Penicillin / Strepomycin, L-Glutamin. Am nächsten Tag sollten die Zellen bei 70-80% Konfluenz sein.
  2. Transient zu transfizieren jede 10 cm Schüssel mit 15 ug Plasmid-DNA und Metafectene Transfektionsreagenz (Biontex, Martinsried, Deutschland). In kurzen, für eine 10 cm Schale wurden 15 ug Plasmid-DNA und 30 ul Metafectene bis 750 ul Opti-MEM zugegeben, gemischt und bei RT für 20 min. 5 Gerichte wurden mit pcDNA3.1 mRFP / eGFP-markierten menschlichen (FL) DISC1 und 5 Gerichte mit eGFP-Plasmid allein transfiziert.

2. AggresomenReinigung aus transfizierter Donorzellen

Die hier beschriebene Protokoll ist eine Kombination eines Verfahrens, um Lewy-Bodies aus Gehirngewebe 13 und einem Protokoll, um große Aggregate und Aggresomen 14 isolieren reinigen. Da bereits bestehender Verfahren auf die Verwendung von Reinigungsmitteln, die Isolierung von Detergens-freien Protein für die Anwendung bei der Zell-Assays basieren Invasivität ist kritisch.

  1. 48 h nach der Transfektion, zur Überwachung der Expression des eGFP und mRFP/eGFP-DISC1 und bestätigen die Bildung von Aggresomen unter einem Fluoreszenz-Mikroskop (Abbildung 1).
  2. Waschen Sie die Zellen mit PBS pH 7,4, kratzen mit 400 ul PBS jeder, fügen 1X Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN) und stören die Zellen unter Verwendung eines Precellys24 Homogenisator (Bertin Technologien, Frankreich). Kurz, 1 ml Zellsuspension auf eine 2 ml Lyse überführen und 10 Keramikkugeln. Lyse der Zellen mit 3 x 60 sec Impulse. Die mechanische Kraft des Prozesses kannErhöhung der Temperatur in der Probe oberhalb 37 ° C, so ist darauf zu achten, um die Probe auf Eis nach dem Lyseverfahren Chill werden.
  3. Kühlen Sie die Zellen auf Eis und mit 10 mM MgCl 2, 40 U / ml DNase A und inkubieren für 60 min bei 37 ° C
  4. Planen Lösungen von 80%, 50%, 20% Sucrose (w / v) in PBS pH 7,4 (10 ml).
  5. Vorbereiten des Saccharosegradienten in einem 15 ml Falcon-Röhrchen, beginnend mit 2 ml 80% Saccharose, gefolgt von 50% und 20%. Gießen Sie die Steigung langsam und vorsichtig sein, nicht bereits gegossen Schichten stören. Schicht das verdaut Lysat auf der Oberseite des Gradienten und Zentrifuge für 15 min bei 1000 xg bei 4 ° C.
  6. Sorgfältig sammeln Zwischenphase zwischen der 50-80% Saccharose-Schicht mit einer Pipette und gemischt mit 5 Volumina PBS pH 7,4. Zentrifuge für 15 min bei 1000 × g bei 4 ° C. Wiederholen Waschen zwei weitere Male. In dieser Zwischenphase sind Aggresomen fluoreszierenden und visualisiert werden kann in einem Mikroskop unter UV-Licht.
  7. Überstand verwerfen unddas Pellet in 250-500 ul PBS pH 7,4. Dieses Pellet enthält das gereinigte Aggresomen (Abbildung 2).

3. Die Behandlung des Empfängers SH-SY5Y Zellen mit mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen

  1. Samen 5 x 10 4 Empfängers SH-SY5Y menschlichen Neuroblastomzellen konstitutiv GFP-DISC1 (598-854) auf sterilen Deckgläschen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. SH-SY5Y-Zellen werden in Medium mit DMEM/F-12 Penicillin / Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) und 10% FBS kultiviert.
  2. 24 Stunden später, mit 10 ul in jede Vertiefung und inkubieren für 48-72 Std.
  3. Waschen Sie die Zellen 3 x mit PBS pH 7,4 und stillen extrazellulären Fluoreszenz mit 0,04% Trypanblau für 5 min.
  4. Befestigen Sie die Zellen mit 4% PFA in PBS pH 7,4 für 10 min auf Eis, einmal gründlich mit sterilem H 2 O und montieren Sie die Deckgläser auf Glasplättchen mit ProLong Gold mit DAPI Montage-Medium (Invitrogen, USA).
  5. Bestätigen Sie die Aufnahme /Invasion von exogen applizierten Aggresomen durch Kolokalisation mit rekrutiert Proteine ​​Empfänger-Zellen in Z-Stapel-Bildern ausgedrückt.

Dennoch könnte Aufnahme / Invasion von exogenen Proteins nicht wesentlich parallel mit einer Rekrutierung von Wirtszellprotein detektiert werden. In unserem Beispiel mRFP-markierten DISC1 Aggresomen Rekruten lösliche GFP-markierten DISC1 (598-854)-Protein von der Wirtszelle (siehe Abbildung 3) ausgedrückt. Die Bilder wurden auf einem Zeiss LSM 510 konfokalen-oder Zeiss Axiovision Apotome2 Lupe genommen.

4. Erzeugung von rekombinanten DISC1 (598-785)

In einer früheren Veröffentlichung analysierten wir die Fähigkeit verschiedener DISC1 Proteinfragmente Selbständige interagieren bezogen auf das Vorhandensein von Selbstassoziation Domänen. Unter allen Proteinfragmenten getestet menschlichen DISC1 (598-785) zeigten die stärksten Multimerisierung Anschaffungsneigung 4 (Abbildung 4). Daher wurde die menschliche DISC1 (598-785) in pET15b kloniert (NoVagen, Madison, Wisconsin) mit einem N-terminalen 6-Histidin-Tag, ausgedrückt in E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA), und unter denaturierenden Bedingungen in 8 mol / l Harnstoff als 4 beschrieben gereinigt. Kurz gesagt, wird das Protokoll unten beschrieben.

  1. BL21-(IDE3) Rosetta E. coli wurden in 2 x 500 ml 2YT gezüchtet, das 5 mM-Arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml Chloramphenicol bis zu einer OD 600: 0,6-0,8 und DISC1 (598-785) die Expression induziert mit 1 mM IPTG.
  2. DISC1 (598-785) für 4 h bei 37 ° C exprimiert wird, wurde die Expression durch Ernten der Bakterien durch Zentrifugation beendet.
  3. Das Bakterienpellet wurde in 50 ml TE-Puffer (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) und 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml Lysozym, 20 mM MgCl 2 und 400 ml resuspendiert U/50 DNase I. Um vollständige Lyse zu gewährleisten, wurde die Reaktion für 30 min bei RT unter vorsichtigem Rühren inkubiert.
  4. Hinzufügen 10 mM β-Mercaptogruppeoethanol (ME) und 500 mM NaCl und Inkubation für weitere 30 min.
  5. Spindown bakteriellen Einschlusskörperchen bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C.
  6. Pellet in 50 ml Extraktionspuffer, enthaltend 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff und 10 mM β-ME und entfernen Verunreinigungen durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C.
  7. Waschen das Ni-NTA-Agarose-Matrix mit Extraktionspuffer. Inkubieren der resuspendierten, vorgereinigtes Proteinextrakt mit Ni-NTA-Matrix für 2 h bei RT.
  8. Waschen das Ni-NTA-Matrix mit Extraktionspuffer, enthaltend 12 mM Imidazol.
  9. Eluieren des Proteins langsam mit 15 ml Elutionspuffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA und 10 mM β-ME.
  10. Dialysieren das Protein schrittweise auf PBS pH 7,4 mit 10 mM β-ME.

Aus 1 L bakteriellen Startkultur ist es möglich, Isolat bis zu 50 mg rekombinanter DISC1 (598-785) protEin.

α-Synuclein Rückfaltung

Für Experimente mit α-Synuclein, 500 ug des rekombinanten Proteins (Sigma-Aldrich, USA) wurde in PBS in einer Konzentration von 1 mg / ml gelöst. Um Oligomere zu erhalten, Rückfaltung wurde über Nacht bei 37 ° C, wie in einer früheren Veröffentlichung 10 beschrieben.

5. Kennzeichnung von rekombinanten DISC1 (598-785) mit DyLight594

  1. Vor der anschließenden Labelling-Verfahren, DISC1 (598-785)-Protein ist das von β-ME befreit werden. Daher wird das Protein 3 mal in PBS pH 7,4 dialysiert bei einer Verdünnung von 1:2.000.
  2. Label 1 mg DISC1 (598-785) mit DyLight 594 Maleimid (Thermo Scientific, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, löst 1 mg / ml Protein in PBS pH 7.4 und 5 mM TCEP hinzuzufügen, um freie Thiolgruppen zu erholen. Fügen Sie 20 ul der DMF gelösten Farbstoff der Reaktion und inkubieren für 2 h bei RT.
  3. Dialysieren das Protein 3 x PBS pH7,4 in einem Verhältnis von 1:2000 für 2 Stunden jeweils.

Zur weiteren Steigerung der Reinheit des markierten Proteins einen His 6-Tag basierte Affinitätsreinigung auf eine Ni-NTA-Säule durchgeführt wird.

  1. Waschen 1 ml Ni-NTA-Matrix (Qiagen, Deutschland) mit 10 ml PBS pH 7,4.
  2. Anwenden des markierten, dialysierte Protein an der Säule und ließ es über die Säule langsam laufen.
  3. Waschen des Proteins mit 3 x 20 ml PBS pH 7,4
  4. Eluieren des Proteins mit PBS pH 7,4, 500 mM Imidazol tropfenweise während der Überwachung des farbigen Band auf der Ni-NTA-Säule, das Eluat Volumen zu reduzieren.
  5. Dialysieren des Eluats 3 x bis 10 mM NaPi pH 7,4 bei einer Verdünnung von 1:2000 für 2 Stunden jeweils.
  6. Verwenden Sie eine sterile 0,45 um Spritzenfilter das Eluat, Aliquot in 5 x 100 ul Proben und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff zu filtern. 1 pg / ml in je 100 ul Aliquot - Die Gesamtmenge des Proteins sollte 0,5 sein.

optional konzentration Schritt

  1. Für stereotaktische rat Injektionen, wurde das Protein 10-fach in einer Speed-Vac (Eppendorf Concentrator 5301) konzentriert. Der letzte Puffer Bedingung war 100 mM NaPi.

α-Synuclein Labeling

Die Markierung und Reinigung (Ni-NTA-Säule) des rekombinanten α-Synuclein wurde parallel zur DISC1 (598-785) durchgeführt. Die gesamte Ausgangsmaterial war 500 ug statt 1 mg DISC1 (598-785).

6. Die Behandlung des Empfängers SH-SY5Y Zellen mit markierten rekombinanten DISC1 (598-785) Protein

  1. Saatgut 5x10 4 Empfängers SH-SY5Y menschlichen Neuroblastomzellen konstitutiv GFP-DISC1 (598-854) auf sterilen Deckgläschen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen.
  2. Hinzufügen markiertes Protein zu dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von 5-10 ug / ml und 48 bis 72 Stunden inkubieren.
  3. Waschen Sie die Zellen 3 x mit PBS pH 7,4 und stillen Extraktionellular Fluoreszenz mit 0,04% Trypanblau für 5 min.
  4. Befestigen Sie die Zellen mit 4% PFA in PBS pH 7,4 für 10 min auf Eis, einmal gründlich mit sterilem H 2 O und montieren Sie die Deckgläser auf Glasplättchen mit ProLong Gold mit DAPI Montage-Medium (Invitrogen, USA).
  5. Bestätigen Sie die Aufnahme / Invasion von exogen applizierten rekombinanten Proteins durch Kolokalisation mit rekrutiert Proteine ​​Empfänger-Zellen in Z-Stapel-Aufnahmen von Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie generiert ausgedrückt. Noch, Rekrutierung von endogenem Protein nicht könnten wesentlichen parallel Invasion Wirtszellprotein detektiert werden können Z-Stapel noch bestätigen die invasive Natur des Proteins.

In unserem Beispiel rec. DISC1 (598-785) * zumindest teilweise löslich Rekruten DISC1 (598-854)-Protein durch die Wirtszelle (siehe 5A) ausgedrückt GFP-markierten. Für die rekombinante α-Synuclein Invasion, aber keine Einstellungen angezeigt wird (Abbildung 5B). Bilder aufgenommen wurdenauf einem Zeiss LSM 510 konfokalen-oder ein Zeiss Axiovision Apotome2 Mikroskop.

Die Injektion der konzentrierten (ca. 4 ul von 2,5 ug / ul), beschriftet DISC1 (598-785) * in die mPFC Ergebnisse bei der Verbreitung des Proteins an der Einstichstelle, die auch nach Perfusion des Tieres mit erfasst werden kann 4% PFA in PBS pH 7,4 mit einem Rhodamin Filtersatz. In unserem Beispiel DISC1 (598-785) eingerichtet ist, durch eine bestimmte Anzahl von Neuronen entnommen und kann mit Z-Stapel bildgebenden (Abbildung 6) überwacht werden.

Im Allgemeinen haben die Injektion von anderen Proteinen dann diejenigen welche hier nicht unbedingt auf Zell-Invasion führen. Die Invasion Ereignis ist im wesentlichen abhängig von der Art des Proteins, ist trotzdem eine saubere Reinigung eine Voraussetzung für eine weitere Analyse.

7. Repräsentative Ergebnisse

Aggresomen bestehend aus rekombinantem FL DISC1-eGFP gereinigte vom NLF Zellen eingedrungen Empfänger SH-SY5Y cells bei niedrigen Wirkungsgrad (ca. 0,3% 5) durch Kolokalisation mit der konfokalen Mikroskopie (Abbildung 3). Wie bereits berichtet, äußerte DISC1 (598-785) und gereinigt aus E. coli gebildet Multimere 4 waren gleich Zell-invasiven bei einem Wirkungsgrad von ca. 20% 5 (5A) ähnlich dem von α-Synuclein, die parallel als positive Kontrolle (5B) verwendet wurde. Markierten rekombinanten DISC1 (598-785) exprimiert und aus E. coli war auch Zell-invasive Neuronen in vivo, wenn das multimere Protein wurde stereotaktisch in den medialen präfrontalen Kortex einer Ratte (Abbildung 6; Pum, Bader, Huston, Korth, unveröffentlicht) injiziert.

Abbildung 1
Abbildung 1. NLF Neuroblastomzellen transient exprimierenden FP-DISC1 (rot). Rot fluoreszierende Aggresomen kann VerschlechterungCTED innerhalb der Zellen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Gereinigtes DISC1 Aggresomen nach der Reinigung in einem Sucrosegradienten mRFP-tagged.

Abbildung 3
Abbildung 3. Fluorescent Bild überfallen Aggresomen. mRFP-markierten flDISC1 Aggresomen wurden gereinigt und mit SH-SY5Y Neuroblastomzellen inkubiert überexprimierenden lösliche GFP-markierten DISC1 (598-854). Eine Aufnahme von markiertem Aggresomen wird durch Z-Stapel Bildgebung an einem Laser-Scan-Mikroskops (Zeiss LSM 510) überwacht.

Abbildung 4
Abbildung 4. SEC-Profil rec. DISC1 (598-785), das den C704 S704 und die single nucleotide polymorphisms (SNPs). Beide Varianten weisen eine Unterbrechung von geordneten Oligomerisierung und die Bildung von hochmolekularen multIMers (roter Pfeil). Dieses Bild ist von der Veröffentlichung Leliveld et al., Biochemistry 2009 geändert.

Abbildung 5
Abbildung 5. Fluorescent Z-Stapel Bild invasive DyLight-markierten rekombinanten DISC1 (598-785). SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellen, löslichen GFP-DISC1 (598-854) wurden inkubiert mit markierten, rekombinanten Proteins in einer Konzentration von 5 pg / ml. (A) Red Aggregate zeigt die Invasion der rec. DISC1 (598-785)-Protein und gelben Punkte zeigen eine Rekrutierung von löslichem GFP-DISC1 (598-854) in Aggregaten. (B) Rekombinante α-Synuclein (rot) dringt die Zellen ohne Rekrutierung mit einer Frequenz von etwa 20%. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 6
Abbildung 6. Immunfluoreszenz Bilddas injizierte markierten rekombinanten DISC1 (598-785)-Protein. Z-Stapel Bildgebung bestätigt das Vorhandensein von rec. DISC1 (598-785)-Protein von Ratten kortikalen Neuronen mit einem Antikörper gegen neuronale Kerne (NeuN, grün) angefärbt.

Discussion

In dieser Studie beschreiben wir die Reinigung von mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen aus einer transfizierten Neuroblastom-Zelllinie, die Vorbereitung und Kennzeichnung eines rekombinanten DISC1 Proteinspezies und deren Anwendung in der Zell-Invasion Versuche des Empfängers Zellen in vitro und in vivo.

Die Reinigung des nativen mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen wurde aus Protokollen entwickelt, Lewy-Körper-ähnliche Strukturen und größere Aggregate 13, 14 isolieren, aber modifiziert, um die Verwendung von Detergenzien zu vermeiden und die Gefahr von falsch-positiven Zell-Invasion, die auftreten könnten minimieren durch Detergens-erleichterte Membranpenetration.

Eine mögliche zukünftige Verbesserung könnte der in eine weitere Erhöhung der Reinheit der Aggresomen durch Beschallung vollständig getrennten restlichen Membranen und Zytoskelett von den Aggresomen sein. Durch Erhöhung Gesamtreinheit, die Anzahl der gesamten Invasion Ereignisse, die für große Aggresomen ma aufgezeichneteny 5 erhöht werden. Ob die eingeschränkte Definition der von uns vorgeschlagenen 3-Phasen-Saccharose ausreichend für Aggresomen andere Protein-Spezies ist muss geprüft werden, in diesem Sinne das Protokoll hier skizzierten sollte als Ausgangspunkt für individuelle Optimierung berücksichtigt werden. Die gereinigten Aggresomen erwies sich als sehr robust in unseren Händen, zusätzliche Waschschritte (ohne Reinigungsmittel), um Spuren von Saccharose nicht signifikant reduzieren die Gesamtausbeute zu beseitigen.

In einer früheren Veröffentlichung wir beschrieben, dass Oligomeraufbau des DISC1 abhängig deutliche Multimerisierungsdomänen in der C-Terminus 4 (Abbildung 4). Wir entschieden uns für dieses Fragment für die rekombinante lösliche Expression in E. coli und anschließender und Ni-NTA-Reinigung. Seine Multimerisierung überwachen und ihre Invasivität Zelle mit einer Zelle beschrieben invasive Protein wie α-Synuclein vergleichen, etikettiert wir DISC1 (598-785) mit dem Fluoreszenzfarbstoff DyLight594 und verglichen ihreZell-Invasivität mit der gleichen Bezeichnung α-Synuclein. Das Zell-Invasivität des rekombinanten DISC1 Fragment wurde dramatisch im Vergleich zu der von nativem, in voller Länge DISC1 Aggresomen, wahrscheinlich aufgrund seiner geringeren Größe und viel höhere Reinheit erhöht. Wieder scheint Reinheit eine entscheidende Rolle bei der Zell-Invasivität zu spielen.

In unserem Beispiel die invasiven Aggresomen rekrutiert lösliche Protein-Homolog des Ziel-Zelllinie, die rekombinant in einer löslichen, dh Zell-dispergierter Form exprimiert wurde. Die Expression eines fluoreszierenden Proteins (zB GFP oder RFP) in den Empfänger-Zelllinie ist ein Vorteil, da sie die Co-Lokalisation von invasiven Aggresomen und rekombinanten Proteine ​​innerhalb der Empfängerzelle Grenzwert über-Z-Stapel Bildgebung ermöglicht.

Cell-invasive DISC1 Aggresomen und multimeren Fragmenten exprimiert und aus E. coli konnte ein bestimmendes Merkmal eines Proteins Konformationsänderungen Erkrankungen im Zusammenhang mit DISC1, DI werdenSC1opathies 15.

Fehlersuche:

Low Aggresomen Ausbeute nach Saccharosegradienten Reinigung:

Die Saccharose-Gradienten in diesem Protokoll eingeführt funktioniert gut mit eGFP/mRFP-DISC1 (FL) Aggresomen. Aggresomen aus anderen Proteinen könnte der variable Dimensionen daher die Saccharose-Konzentrationen sollten durch andere Benutzer optimiert werden.

Ungenügende Reinigung von rekombinanten Proteins:

Irgendwelche bakteriellen Kontaminanten in dem Reinigungsverfahren des rekombinanten Proteins wird auch in späteren Schritten des Protokolls zu kennzeichnen. Um Verschmutzungen zu vermeiden, laufen die das Protein auf einem SDS-PAGE und bestätigen, dass das rekombinante Protein mindestens 95% rein ist durch Färbung mit Coomassie-Blau. Um höchste Qualität und Ausbeute zu gewährleisten, muss das Protokoll für jedes einzelne Protein optimiert werden.

Low Kennzeichnung efzienz von rekombinanten Proteinen:

Etwaige Verunreinigungen, die freien SH-Gruppen enthalten verringert effiziente Markierung des Proteins. Daher ist extensive Dialyse und Ni-NTA-basiertes Reinigungsverfahren erforderlich.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NEURON-ERANET entdecken (BMBF 01EW1003) an CK und JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) finanziert, um CKVB wird durch einen Zuschuss der Forschungskommission der Medizinischen Fakultät der Universität Düsseldorf unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093 Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
DMEM/F-12 Invitrogen 11320-033 Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
PBS Invitrogen 14190-250
Metafectene Biontex T020-1.0 Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol.
Ni-NTA agarose Qiagen 30210 The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well.
DNase I Roche 04716728001 There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Opti-MEM Invitrogen 31985-062 Serum-free medium works as well
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122 Supplement for SH-SY5Y and NLF medium
Non-essential-amino-acids (NEAA) Sigma-Aldrich M7145 Supplement for SH-SY5Y medium
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154 Toxic reagent
DyLight 594 Maleimide Thermo-Fisher Scientific 46608 Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors.
ProLong Gold with DAPI Invitrogen P36935 This antifade liquid mountant gave superior results in our hands.
Protease Inhibitor cocktail Roche 11873580001 Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution.
Synthetic a-synuclein Sigma S7820 Refold as described in text.
Table of specific reagents.
Precellys 24 Bertin Technologies 03119.200.RD000 We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol.
5301 Concentrator (speedvac) Eppendorf 5301 000.210 Only necessary if protein has to be concentrated.
LSM 510 and Axiovision Apotome2 Zeiss See manufacturers catalog Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events.
Cell culture plastic material Nunc 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here.
Table of specific material and equipment.
Number Buffer name content Comments
1. Bacterial growth medium 16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml carbencillin, 35 μg/ml chloramphenicol Grow bacteria to OD600: 0.6-0.8 induce expression with 1 mM IPTG.
2. Bacterial resuspension buffer 50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lysozyme, 20 mM MgCl2 and 400 U/50 ml DNase I Resupend bacterial pellet from 1 L overnight culture in 50 ml resuspension buffer.
3. Protein extraction buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME
4. Ni-NTA column wash buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME, 12 mM imidazole Modified extraction buffer with 12 mM imidazole added.
5. Ni-NTA column elution buffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA and 10 mM b -ME The elution buffer contains 10 mM b -ME, which is dialyzed later on.
6. PBS 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4, adjust to pH 7.4
7. Labeling buffer PBS containing 5 mM TCEP
Table of recipes.

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References

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Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies
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Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).More

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).

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