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Biology

जनरेशन, शोधन, सेल इनवेसिव DISC1 प्रोटीन प्रजाति की विशेषता और

doi: 10.3791/4132 Published: August 30, 2012

Summary

intracellular, cytoplasmic पूर्ण सेल संस्कृतियों से लंबाई DISC1 प्रोटीन aggresomes और एक लेबल, multimeric रीकॉम्बीनैंट DISC1 प्रोटीन में टुकड़ा के उत्पादन, शोधन, और सेल आक्रमण

Protocol

1. Aggresome दाता कोशिकाओं की तैयारी: monomeric लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mRFP) या बढ़ी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) टैग मानव पूर्ण लंबाई (FL) DISC1 अभिकर्मक

  1. 1.5 बीज x 10/10 6 सेमी डिश मानव neuroblastoma NLF (NLF, फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल, फिलाडेल्फिया, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) दस 10 सेमी व्यंजनों में कोशिकाओं और रात में हो जाना. NLF कोशिकाओं RPMI +१,६४० 10% के साथ पूरक मध्यम में संवर्धित कर रहे हैं FBS, पेनिसिलीन / Strepomycin, एल Glutamine. अगले दिन, कोशिकाओं 70-80% confluency पर होना चाहिए.
  2. Transiently 15 ग्राम प्लास्मिड डीएनए और Metafectene अभिकर्मक अभिकर्मक (Biontex, Martinsried, जर्मनी) के साथ प्रत्येक 10 सेमी डिश transfect. संक्षेप में, एक 10 सेमी डिश के लिए, 15 ग्राम प्लास्मिड डीएनए और 30 μl Metafectene 750 μl Opti-सदस्य जोड़ा गया था, मिश्रित और आरटी पर 20 मिनट के लिए incubated. 5 व्यंजन pcDNA3.1 mRFP / EGFP टैग मानव (FL) अकेले EGFP-प्लाज्मिड साथ DISC1 और 5 व्यंजन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे.

2. Aggresomeट्रांसफ़ेक्ट दाता कोशिकाओं से शोधन

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल 13 मस्तिष्क ऊतक और एक बड़े समुच्चय और 14 aggresomes अलग प्रोटोकॉल से Lewy निकायों को शुद्ध करने के लिए विधि का एक संयोजन है. चूंकि पहले से ही मौजूदा तरीकों डिटर्जेंट, डिटर्जेंट मुक्त सेल invasiveness assays में आवेदन के लिए प्रोटीन के अलगाव के उपयोग के आधार पर कर रहे हैं महत्वपूर्ण है.

  1. अभिकर्मक के बाद 48 घंटा, EGFP और mRFP/eGFP-DISC1 अभिव्यक्ति की निगरानी और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (1 चित्रा) तहत aggresomes के गठन की पुष्टि.
  2. पीएच 7.4 पीबीएस, 400 μl प्रत्येक पीबीएस के साथ परिमार्जन के साथ कोशिकाओं को धो, 1X Protease एफडीए कॉकटेल जोड़ने (रॉश, इंडियानापोलिस, में) और एक Precellys24 homogenizer (Bertin प्रौद्योगिकियों, फ्रांस) का उपयोग कोशिकाओं को बाधित. संक्षेप में, एक 2 मिलीलीटर lysis ट्यूब 1 मिलीग्राम सेल निलंबन जोड़ने और 10 सिरेमिक मोती जोड़ने. 3 x 60 सेकंड दालों के साथ कोशिकाओं lyse. प्रक्रिया के यांत्रिक शक्ति हो सकता हैनमूना भीतर 37 से ऊपर के तापमान में वृद्धि ° C तो ध्यान lysis प्रक्रिया के बाद बर्फ पर नमूना ठंडा करने के लिए लिया जाना चाहिए.
  3. बर्फ पर कोशिकाओं को शांत करने के लिए और 37 में 10 मिमी 2 MgCl, 40 यू / मिलीलीटर DNase एक और सेते जोड़ने के लिए 60 मिनट के लिए ° C
  4. 80%, 50% के समाधान, पीबीएस 7.4 पीएच (10 मिलीलीटर प्रत्येक) में 20% (w / v) sucrose तैयार.
  5. एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में sucrose ढाल तैयार, 2 मिलीलीटर 80% sucrose के साथ शुरू, 50% और 20% द्वारा पीछा किया. ढाल धीरे डालो और पहले से ही डाला परतों को परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहना. 4 में 1000 XG पर 15 मिनट के लिए ढाल और अपकेंद्रित्र के शीर्ष पर पचा lysate परत ° सी.
  6. ध्यान से 50-80% sucrose परत के बीच एक और पीबीएस पीएच 7.4 5 संस्करणों के साथ विंदुक मिश्रण के साथ अंतरावस्था इकट्ठा. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1000 XG पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र दो अतिरिक्त बार धोने दोहराएँ. इस अंतरावस्था, aggresomes फ्लोरोसेंट हैं और यूवी प्रकाश के तहत एक माइक्रोस्कोप में देखे जा सकते हैं.
  7. तैरनेवाला त्यागें और250-500 μl पीबीएस 7.4 पीएच में गोली resuspend. यह गोली शुद्ध aggresomes (2 चित्रा) शामिल हैं.

3. प्राप्तकर्ता एसएच SY5Y कोशिकाओं की mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes के साथ उपचार

  1. 5 बीज x 10 4 एसएच SY5Y प्राप्तकर्ता मानव neuroblastoma कोशिकाओं constitutively एक 24 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से बाँझ कांच coverslips पर व्यक्त GFP DISC1 (598-854). एसएच SY5Y सेल DMEM/F-12 पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) और 10% FBS के साथ पूरक मध्यम में संवर्धित कर रहे हैं.
  2. 24 घंटे बाद, एक अच्छी तरह से 10 μl जोड़ने और 48-72 घंटे के लिए सेते हैं.
  3. कोशिकाओं पीबीएस पीएच 7.4 के साथ 3 एक्स धो और 5 मिनट के लिए 0.04% Trypan ब्लू के साथ बाह्य प्रतिदीप्ति बुझा लेते हैं.
  4. पीबीएस पीएच 7.4 में 4% पीएफए ​​के साथ बर्फ पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, बाँझ एच 2 हे के साथ एक बार धोने और DAPI बढ़ते मध्यम (Invitrogen, यूएसए) के साथ गोल्ड लम्बा साथ कांच स्लाइड पर coverslips माउंट.
  5. / तेज की पुष्टिexogenously लागू aggresomes की भर्ती की Z-ढेर छवियों में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा व्यक्त प्रोटीन के साथ colocalization से आक्रमण.

फिर भी, / exogenous प्रोटीन के तेज आक्रमण को अनिवार्य रूप से मेजबान सेल प्रोटीन की भर्ती के साथ समानांतर में नहीं पता लगाया जा सकता है. हमारे उदाहरण में mRFP टैग DISC1 aggresomes की भर्ती घुलनशील GFP टैग DISC1 (598-854) मेजबान सेल (चित्र देखें 3) द्वारा व्यक्त प्रोटीन. तस्वीरे एक Zeiss LSM 510 confocal या एक Zeiss AxioVision Apotome2 माइक्रोस्कोप पर ले जाया गया.

4. संयोजक DISC1 की जनरेशन (598-785)

पिछले एक प्रकाशन में हम स्वयं संघ के डोमेन की उपस्थिति के आधार पर स्वयं बातचीत करने के लिए विभिन्न DISC1 प्रोटीन टुकड़े की क्षमता का विश्लेषण किया. सभी प्रोटीन के अलावा टुकड़े परीक्षण DISC1 मानव (598-785) मजबूत multimerization प्रवृत्ति प्रदर्शित 4 (चित्रा 4). इसलिए, मानव DISC1 (598-785) pET15b में क्लोन किया गया था (नहींVagen, मैडिसन) 6 हिस्टडीन टैग एन टर्मिनल, ई. में व्यक्त युक्त BL21 - कोलाई (lDE3) Rosetta (Novagen, अमेरिका), और 8 / mol एल यूरिया में denaturing शर्तों के रूप में 4 वर्णित के तहत शुद्ध. संक्षेप में, प्रोटोकॉल नीचे उल्लिखित है.

  1. BL21 (IDE3) Rosetta ई. कोलाई 2 x 500 मिलीलीटर 2YT में बड़े हो रहे थे 5 मिमी arginine एचसीएल, 5mm MgSO4, 100 छ / मिलीलीटर carbencillin, 35 ग्राम / मिलीलीटर chloramphenicol युक्त एक 600 आयुध डिपो: 0.6-0.8 और DISC1 (598-785) अभिव्यक्ति प्रेरित किया गया था 1 मिमी IPTG साथ.
  2. DISC1 (598-785) 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर व्यक्त किया गया था, अभिव्यक्ति centrifugation द्वारा बैक्टीरिया कटाई से समाप्त किया गया.
  3. बैक्टीरियल गोली 50 मिलीलीटर ते बफर (50 मिमी Tris एचसीएल 8.0 पीएच, 5 मिमी EDTA) प्लस 2 मिमी, 1% TX-100, 250 छ / मिलीलीटर lysozyme, 20 मिमी MgCl 2 और 400 U/50 मिलीलीटर PMSF में resuspended DNase मैं पूरा lysis सुनिश्चित करने, प्रतिक्रिया आरटी पर 30 मिनट के लिए कोमल सरगर्मी के साथ incubated किया गया था.
  4. 10 β mercapt मिमी जोड़ें(इ) oethanol और 500 मिमी NaCl और एक और 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नीचे बैक्टीरियल समावेश शरीर स्पिन 20.000 जी
  6. Resuspend गोली 50 मिलीलीटर निष्कर्षण 50mm Tris 8.0 पीएच, 5 मिमी imidazole, 500 मिमी NaCl, 8 एम यूरिया और 10 β इ मिमी और 20.000 जी 4 पर centrifugation द्वारा मलबा हटाने के 30 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस युक्त बफर में
  7. निष्कर्षण बफर के साथ नी NTA agarose मैट्रिक्स धो लें. Resuspended, नी NTA RT 2 घंटे के लिए मैट्रिक्स के साथ precleared प्रोटीन निकालने सेते हैं.
  8. निकासी 12 मिमी imidazole युक्त बफर के साथ नी NTA मैट्रिक्स धो लें.
  9. प्रोटीन धीरे धीरे Elute साथ 15 मिलीलीटर क्षालन बफर युक्त 50 मिमी Tris, 500 मिमी NaCl, 300 मिमी imidazole, 8 एम यूरिया, 1 मिमी PMSF, 5 मिमी EDTA और 10 β इ मिमी.
  10. पीबीएस पीएच 7.4 stepwise 10 β इ मिमी प्रोटीन युक्त Dialyze.

1 एल जीवाणु संस्कृति शुरू करने से यह संभव है रीकॉम्बीनैंट DISC1 prot (598-785) के 50 मिलीग्राम को अलगEin.

α-synuclein refolding

Α-synuclein, पुनः संयोजक प्रोटीन की 500 ग्राम (सिग्मा Aldrich, यूएसए) के साथ प्रयोगों पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में भंग कर दिया गया था. Oligomers प्राप्त करने के लिए, refolding रातोंरात 37 में प्रदर्शन किया था छाए एक पिछले 10 प्रकाशन में वर्णित है.

5. पुनः संयोजक DISC1 (598-785) के साथ DyLight594 की लेबलिंग

  1. पहले बाद लेबलिंग प्रक्रिया, DISC1 (598-785) प्रोटीन β-ME से मुक्त हो. इसलिए, प्रोटीन 3 बार 1:2,000 की एक कमजोर पड़ने पर पीबीएस पीएच 7.4 dialyzed है.
  2. 1 लेबल DyLight maleimide 594 (थर्मो वैज्ञानिक, यूएसए) के साथ DISC1 (598-785) मिलीग्राम निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार. संक्षेप में, 1 मिलीग्राम / पीबीएस पीएच 7.4 मिलीग्राम प्रोटीन भंग करने और 5 मिमी TCEP जोड़ने के लिए मुक्त thiol समूहों को ठीक करने के लिए. प्रतिक्रिया और rt में 2 घंटे के लिए सेते DMF भंग डाई के 20 μl जोड़ें.
  3. पीबीएस पीएच प्रोटीन x 3 Dialyze7.4 के लिए 2 1:2000 के अनुपात में प्रत्येक घंटा.

आगे नामक प्रोटीन की शुद्धता को बढ़ाने के उनकी 6 टैग नी NTA स्तंभ किया जाता है पर आधारित आत्मीयता शुद्धि.

  1. 10 मिलीलीटर पीबीएस पीएच 7.4 के साथ 1 मिलीग्राम नी NTA मैट्रिक्स (Qiagen, जर्मनी) धो लें.
  2. स्तंभ लेबल, dialyzed प्रोटीन लागू करते हैं और यह स्तंभ पर धीरे धीरे चलाना.
  3. 3 x 20 मिलीलीटर पीबीएस 7.4 पीएच के साथ प्रोटीन धोने
  4. पीबीएस 7.4 पीएच, 500 मिमी imidazole dropwise के साथ प्रोटीन Elute जबकि नी NTA स्तंभ पर रंग बैंड की निगरानी करने के लिए प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक मात्रा को कम.
  5. प्रत्येक के लिए 2 घंटा 1:2000 का एक कमजोर पड़ने पर प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक 3 x 10 मिमी Napi पीएच 7.4 Dialyze.
  6. एक बाँझ 0.45 सुक्ष्ममापी फिल्टर सिरिंज का उपयोग प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक, 5 x 100 μl तरल नाइट्रोजन में और तस्वीर फ्रीज नमूनों में अशेष भाजक फिल्टर. 1 / प्रत्येक 100 μl अशेष भाजक में ग्राम मिलीलीटर प्रोटीन की कुल राशि 0.5 होना चाहिए.

वैकल्पिक concentrव्यावहारिक कदम

  1. इंजेक्शन के लिए stereotactical चूहे, प्रोटीन 10 गुना गति Vac (Eppendorf 5301 Concentrator) में ध्यान केंद्रित किया गया था. अंतिम बफर 100 मिमी हालत Napi था.

α-synuclein लेबल

लेबलिंग और पुनः संयोजक α synuclein का शोधन (नी NTA स्तंभ) समानांतर में DISC1 (598-785) के लिए किया गया था. कुल प्रारंभिक सामग्री 500 ग्राम के बजाय DISC1 (598-785) के लिए 1 मिलीग्राम था.

6. प्राप्तकर्ता एसएच SY5Y प्रकोष्ठों के लेबल्ड संयोजक (598-785) DISC1 प्रोटीन के साथ उपचार

  1. बीज 5x10 प्राप्तकर्ता 4 एसएच SY5Y मानव neuroblastoma कोशिकाओं constitutively एक 24 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से बाँझ कांच coverslips पर व्यक्त GFP DISC1 (598-854).
  2. सेल संस्कृति मध्यम 5-10 ग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में लेबल प्रोटीन और 48-72 घंटे के लिए सेते हैं.
  3. कोशिकाओं पीबीएस पीएच 7.4 के साथ 3 एक्स धो और extrac बुझा लेते हैं5 मिनट के लिए 0.04% Trypan ब्लू के साथ ellular प्रतिदीप्ति.
  4. पीबीएस पीएच 7.4 में 4% पीएफए ​​के साथ बर्फ पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, बाँझ एच 2 हे के साथ एक बार धोने और DAPI बढ़ते मध्यम (Invitrogen, यूएसए) के साथ गोल्ड लम्बा साथ कांच स्लाइड पर coverslips माउंट.
  5. तेज / exogenously के आक्रमण की भर्ती की Z-ढेर लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा उत्पन्न छवियों में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा व्यक्त प्रोटीन के साथ colocalization से पुनः संयोजक प्रोटीन लागू की पुष्टि. फिर भी, अंतर्जात प्रोटीन की भर्ती अनिवार्य रूप से मेजबान सेल प्रोटीन के आक्रमण के साथ समानांतर में नहीं पता लगाया जा सकता है, Z-ढेर छवियाँ अभी भी प्रोटीन की आक्रामक प्रकृति की पुष्टि कर सकते हैं.

हमारे उदाहरण आरईसी में. DISC1 (598-785) * कम से कम हिस्सा रंगरूटों में घुलनशील DISC1 (598-854) मेजबान सेल (चित्रा 5A देखें) द्वारा व्यक्त प्रोटीन GFP टैग. रीकॉम्बीनैंट आक्रमण α-synuclein लेकिन कोई भर्ती के लिए (चित्रा 5 ब) दिखाया गया है. तस्वीरें ले जाया गयाएक Zeiss LSM 510 confocal या एक Zeiss AxioVision Apotome2 माइक्रोस्कोप के.

केंद्रित के इंजेक्शन (2.5 / छ μl ca. 4 μl), इंजेक्शन स्थल के चारों ओर प्रोटीन के साथ जो जानवर के छिड़काव के बाद भी पता लगाया जा सकता है के प्रसार में mPFC परिणाम में DISC1 (598-785) * लेबल 4 एक rhodamine filterset के साथ पीबीएस पीएच 7.4% पीएफए. हमारे उदाहरण में DISC1 (598-785) न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट संख्या से लिया जाता है और Z-ढेर इमेजिंग (6 चित्रा) के साथ नजर रखी जा सकती है.

सामान्य में, लोगों को यहां इस्तेमाल किया तो अन्य प्रोटीन के इंजेक्शन सेल आक्रमण करने के लिए जरूरी नहीं नेतृत्व नहीं है. आक्रमण घटना अनिवार्य रूप से प्रोटीन की प्रकृति पर निर्भर करता है, फिर भी एक साफ शोधन आगे के विश्लेषण के लिए एक शर्त है.

7. प्रतिनिधि परिणाम

NLF कोशिकाओं से पुनः संयोजक FL DISC1 EGFP विशुद्ध से मिलकर Aggresomes प्राप्तकर्ता एसएच SY5Y ce पर हमलाकम क्षमता पर और LLS (लगभग 0.3 5%) के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) के साथ colocalization से देखा. जैसा कि पहले बताया, DISC1 (598-785) व्यक्त की और ई. से शुद्ध कोलाई गठन multimers 4 लगभग 20 5% (चित्रा 5A) α synuclein का कि कि समानांतर में सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 5 ब) के रूप में इस्तेमाल किया गया था के लिए इसी तरह की दक्षता पर समान रूप से सेल आक्रामक थे. लेबल्ड रीकॉम्बीनैंट DISC1 (598-785) व्यक्त की और ई. से शुद्ध कोलाई vivo में न्यूरॉन्स सेल इनवेसिव भी था जब multimeric प्रोटीन stereotactically एक चूहे की औसत दर्जे का prefrontal प्रांतस्था (6 चित्रा, पम, Bader, Huston, Korth, अप्रकाशित) में इंजेक्ट किया गया था.

चित्रा 1
चित्रा 1. NLF neuroblastoma कोशिकाओं transiently व्यक्त FP-DISC1 (लाल). लाल फ्लोरोसेंट aggresomes देते हो सकता हैकोशिकाओं के भीतर cted.

चित्रा 2
चित्रा 2 शुद्ध एक sucrose ढाल में शुद्धिकरण के बाद DISC1 aggresomes mRFP टैग.

चित्रा 3
चित्रा 3 पर आक्रमण aggresomes फ्लोरोसेंट तस्वीर. mRFP टैग flDISC1 aggresomes थे और शुद्ध एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं के साथ incubated overexpressing घुलनशील GFP टैग DISC1 (598-854). लेबल aggresomes का एक तेज माइक्रोस्कोप लेजर स्कैन (Zeiss 510 एल एस एम) पर Z-ढेर इमेजिंग के द्वारा नजर रखी है.

चित्रा 4
चित्रा 4 आरईसी की एसईसी प्रोफ़ाइल. DISC1 (598-785) S704 और C704 एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNP) युक्त. दोनों वेरिएंट आदेश दिया oligomerization के विघटन और उच्च आणविक भार mult के गठन दिखाimers (लाल तीर). इस तस्वीर Leliveld एट अल के प्रकाशन, बायोकैमिस्ट्री 2009 से संशोधित किया गया है.

चित्रा 5
चित्रा 5 आक्रामक DyLight लेबल रीकॉम्बीनैंट DISC1 (598-785) के प्रतिदीप्त तस्वीर Z-ढेर. एसएच SY5Y neuroblastoma घुलनशील GFP DISC1 (598-854) व्यक्त कोशिकाओं लेबल साथ incubated रहे थे, 5 ग्राम / मिलीलीटर की एक एकाग्रता में पुनः संयोजक प्रोटीन. (ए) लाल समुच्चय आरईसी के आक्रमण से पता चलता है. DISC1 (598-785) प्रोटीन और पीले डॉट्स समुच्चय में घुलनशील GFP DISC1 (598-854) के एक भर्ती का संकेत मिलता है. (बी) के संयोजक α synuclein (लाल) के बारे में 20% की एक आवृत्ति के साथ भर्ती के बिना कोशिकाओं पर हमला बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
चित्रा 6 की Immunofluorescent तस्वीरइंजेक्शन लेबल, पुनः संयोजक (598-785) DISC1 प्रोटीन. Z-ढेर इमेजिंग आरईसी की उपस्थिति की पुष्टि करता है. चूहा cortical neuronal नाभिक (NeuN, हरे) के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ दाग न्यूरॉन्स में DISC1 प्रोटीन (598-785).

Discussion

इस अध्ययन में हम एक ट्रांसफ़ेक्ट neuroblastoma सेल लाइन, तैयारी और एक रीकॉम्बीनैंट DISC1 प्रोटीन प्रजातियों की लेबलिंग और इन विट्रो में और vivo में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के सेल आक्रमण प्रयोगों में उनके आवेदन से mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes की शुद्धि का वर्णन करता है.

देशी mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes की शुद्धि प्रोटोकॉल से विकसित किया गया था Lewy शरीर संरचनाओं की तरह और बड़े समुच्चय 13, 14 को अलग करने के लिए, लेकिन डिटर्जेंट के उपयोग से बचने के लिए और झूठी सकारात्मक सेल आक्रमण का खतरा है कि हो सकता है कम से कम करने के लिए संशोधित डिटर्जेंट सुगम बनाया झिल्ली प्रवेश करने के लिए कारण.

एक संभव भविष्य में सुधार के लिए आगे aggresomes से पूरी तरह से अलग शेष झिल्ली और cytoskeleton sonication द्वारा aggresomes की शुद्धता को बढ़ाने में हो सकता है. बढ़ती समग्र पवित्रता, कुल आक्रमण घटनाओं की संख्या है कि बड़े aggresomes माँ के लिए दर्जy 5 वृद्धि हुई है. क्या हमारे सुझाए sucrose 3-चरण की सीमित परिभाषा अन्य प्रोटीन प्रजाति के aggresomes के लिए पर्याप्त है के लिए परीक्षण किया जा सकता है, इस अर्थ में प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित व्यक्तिगत अनुकूलन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में माना जाना चाहिए. शुद्ध aggresomes हमारे हाथ, अतिरिक्त धोने कदम (डिटर्जेंट) के बिना कुल उपज काफी कम sucrose के निशान को खत्म करने में काफी मजबूत साबित हुई.

हम पिछले एक प्रकाशन में वर्णित है कि DISC1 की oligomer विधानसभा 4 सी टर्मिनस (4 चित्रा) में अलग multimerization डोमेन पर निर्भर है. हम ई. में पुनः संयोजक घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए इस टुकड़ा चुना कोलाई और बाद में और नी NTA शुद्धि. अपने multimerization की निगरानी करने और α-synuclein प्रोटीन कोशिका की तरह आक्रामक के साथ अपने सेल invasiveness की तुलना करने के लिए, हम साथ फ्लोरोसेंट डाई DyLight594 DISC1 (598-785) लेबल, और की तुलना में अपनीसमान रूप से लेबल α synuclein का उस के साथ सेल invasiveness. रीकॉम्बीनैंट DISC1 टुकड़ा की सेल invasiveness देशी, पूर्ण DISC1 aggresomes लंबाई, अपने छोटे आकार और बहुत उच्च शुद्धता के कारण होने की संभावना की है कि तुलना में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई थी. फिर, शुद्धता के लिए सेल invasiveness में एक निर्णायक भूमिका निभा रहा है.

हमारे उदाहरण में आक्रामक aggresomes लक्ष्य सेल लाइन के घुलनशील सजात प्रोटीन है कि recombinantly एक घुलनशील, यानी फार्म सेल छितरी हुई में व्यक्त किया गया था भर्ती किया था. प्राप्तकर्ता सेल लाइन में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे GFP या आरएफपी) की अभिव्यक्ति एक फायदा है क्योंकि यह प्राप्तकर्ता सेल सीमा के भीतर आक्रामक aggresomes और पुनः संयोजक प्रोटीन के Z-ढेर इमेजिंग के माध्यम से colocalization की अनुमति देता है.

सेल इनवेसिव DISC1 aggresomes और multimeric टुकड़े व्यक्त की और ई. से शुद्ध कोलाई एक प्रोटीन गठनात्मक DISC1, डि से संबंधित रोगों की एक विशेषता परिभाषित किया जा सकता है15 SC1opathies.

मुसीबत शूटिंग:

Sucrose ढाल शुद्धि के बाद कम aggresome उपज:

sucrose इस प्रोटोकॉल में शुरू ढाल eGFP/mRFP-DISC1 aggresomes (FL) के साथ अच्छी तरह से काम करता है. अन्य प्रोटीन से मिलकर Aggresomes चर आयामों की हो इसलिए sucrose सांद्रता अन्य उपयोगकर्ताओं के द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए सकता है.

पुनः संयोजक प्रोटीन की अपर्याप्त शुद्धिकरण:

पुनः संयोजक प्रोटीन की शोधन प्रक्रिया में किसी भी बैक्टीरिया contaminants भी प्रोटोकॉल के बाद के चरणों में लेबल किया जाएगा. Contaminations से बचने के लिए, एक एसडीएस पृष्ठ पर प्रोटीन को चलाने के लिए और पुष्टि करते हैं कि प्रोटीन रीकॉम्बीनैंट Coomassie ब्लू के साथ धुंधला करके कम से कम 95% है शुद्ध. उच्चतम गुणवत्ता और उपज सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटोकॉल के लिए प्रत्येक व्यक्ति के प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना है.

कम लेबलिंग एफईपुनः संयोजक प्रोटीन की ficiency:

कोई contaminations है कि मुक्त एसएच समूहों शामिल प्रोटीन की कुशल लेबलिंग में कमी होगी. इसलिए, व्यापक डायलिसिस और नी NTA आधारित शुद्धि अनिवार्य है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम न्यूरॉन Eranet डिस्कवर (01EW1003 BMBF) सी.के. और JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) के लिए वित्त पोषित किया गया था CKVB डसेलडोर्फ के विश्वविद्यालय के मेडिकल संकाय के Forschungskommission की एक अनुदान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093 Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
DMEM/F-12 Invitrogen 11320-033 Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
PBS Invitrogen 14190-250
Metafectene Biontex T020-1.0 Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol.
Ni-NTA agarose Qiagen 30210 The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well.
DNase I Roche 04716728001 There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Opti-MEM Invitrogen 31985-062 Serum-free medium works as well
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122 Supplement for SH-SY5Y and NLF medium
Non-essential-amino-acids (NEAA) Sigma-Aldrich M7145 Supplement for SH-SY5Y medium
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154 Toxic reagent
DyLight 594 Maleimide Thermo-Fisher Scientific 46608 Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors.
ProLong Gold with DAPI Invitrogen P36935 This antifade liquid mountant gave superior results in our hands.
Protease Inhibitor cocktail Roche 11873580001 Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution.
Synthetic a-synuclein Sigma S7820 Refold as described in text.
Table of specific reagents.
Precellys 24 Bertin Technologies 03119.200.RD000 We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol.
5301 Concentrator (speedvac) Eppendorf 5301 000.210 Only necessary if protein has to be concentrated.
LSM 510 and Axiovision Apotome2 Zeiss See manufacturers catalog Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events.
Cell culture plastic material Nunc 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here.
Table of specific material and equipment.
Number Buffer name content Comments
1. Bacterial growth medium 16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml carbencillin, 35 μg/ml chloramphenicol Grow bacteria to OD600: 0.6-0.8 induce expression with 1 mM IPTG.
2. Bacterial resuspension buffer 50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lysozyme, 20 mM MgCl2 and 400 U/50 ml DNase I Resupend bacterial pellet from 1 L overnight culture in 50 ml resuspension buffer.
3. Protein extraction buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME
4. Ni-NTA column wash buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME, 12 mM imidazole Modified extraction buffer with 12 mM imidazole added.
5. Ni-NTA column elution buffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA and 10 mM b -ME The elution buffer contains 10 mM b -ME, which is dialyzed later on.
6. PBS 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4, adjust to pH 7.4
7. Labeling buffer PBS containing 5 mM TCEP
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References

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जनरेशन, शोधन, सेल इनवेसिव DISC1 प्रोटीन प्रजाति की विशेषता और
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Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).More

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).

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