Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Поколение, очистка и характеристика Cell-инвазивных видов белка DISC1

doi: 10.3791/4132 Published: August 30, 2012

Summary

Поколения, очистки и клеточной вторжения внутриклеточных, цитоплазматические полную длину DISC1 белка aggresomes из клеточных культур и помечены, мультимерные рекомбинантного DISC1 фрагмент белка в

Abstract

Агрегации белков рассматривается как общий признак хронических дегенеративных заболеваний мозга, как, например, в нейродегенеративных заболеваний, болезни Альцгеймера (Ар, тау), болезнь Паркинсона (α-синуклеина), болезнь Хантингтона (полиглутаминовых, гентингтина), и другие. Агрегации белков, как полагают, происходят из-за нарушения proteostasis, то есть дисбаланс между возникновением и деградации неправильно свернутых белков. Следует отметить, что те же белки находятся собраны в спорадическими формами этих заболеваний, которые мутанта в редких вариантах семейных формах.

Шизофрения является хроническим прогрессирующим состояние мозга, что во многих случаях идет вместе с постоянными и необратимыми когнитивного дефицита. В подходе гена кандидата, мы исследовали, может ли Нарушенные-в-шизофрения 1 (DISC1), ген, клонированный в шотландской семьи с привязкой к хроническим психическим заболеванием 1, 2, может быть найдено в виде нерастворимых агрегатов в Braiп спорадических случаев шизофрении 3. Использование CC SMRI, мы определили примерно в 20% случаев с CMD, но не нормальное управление или пациентов с нейродегенеративных заболеваний sarkosyl нерастворимые DISC1 иммунореактивности после биохимического фракционирования. Последующие исследования в пробирке показали, что агрегация склонность DISC1 под влиянием болезни связанные полиморфизма S704C 4, и что DISC1 aggresomes генерируется в пробирке клетки были инвазивные 5, подобное тому, что было показано для Ар 6, тау 7-9, α -синуклеина 10, полиглутаминовых 11, или SOD1 агрегатов 12. Эти результаты побудили нас предположить, что по крайней мере подмножество случаев с CMD, те, с общей DISC1 может быть белка конформационные нарушения.

Здесь мы расскажем, как мы генерируем DISC1 aggresomes в клетках млекопитающих, очистить их от градиента сахарозы и использовать их для клеточной инвазии StudiES. Кроме того, мы расскажем, как мы создаем исключительно мультимерные С-концевой фрагмент DISC1, этикетки и очистить его для исследования клетки инвазивности. Использование рекомбинантных мультимеры DISC1 мы достичь аналогичных инвазивности клетки, как и для аналогичной надписью синтетических α-синуклеина фрагмент. Мы также показываем, что этот фрагмент взят в естественных условиях, когда стереотаксически вводили в мозг получателя животных.

Protocol

1. Подготовка Aggresome клетки донора: Трансфекция мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP) или расширенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP)-отмеченном человека Full Length (Флорида) DISC1

  1. Семенной 1,5 х 10 6/10 см блюдо нейробластомы человека NLF (НПР; Детской больницы Филадельфии, Филадельфия, Пенсильвания) клеток в десяти 10 см блюд и расти в течение ночи. NLF клетки культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS, пенициллин / Strepomycin, L-глютамин. На следующий день, клетки должны быть на уровне 70-80% слияния.
  2. Временно трансфекции каждые 10 см Блюдо с 15 мкг плазмидной ДНК и Metafectene реагентов трансфекции (Biontex, Martinsried, Германия). Короче говоря, для 10 см блюдо, 15 мкг плазмидной ДНК и 30 мкл Metafectene были добавлены к 750 мкл Opti-MEM, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин. 5 блюд трансфицировали pcDNA3.1 mRFP / УЗФБ с метками человека (Флорида) DISC1 и 5 блюд с EGFP-плазмиды в одиночку.

2. AggresomeОчистка от трансфицированных клеток донора

Протокол, описанный здесь, является сочетание методов для очистки Леви-органов из мозговой ткани 13 и протокол выделить крупные агрегаты и aggresomes 14. Так как уже существующие методы основаны на использовании моющих средств, изоляции моющие средства без белков для применения в клеточной инвазии анализа имеет решающее значение.

  1. 48 ч после трансфекции, следить за выражением УЗФБ и mRFP/eGFP-DISC1 и подтвердить образование aggresomes под флуоресцентным микроскопом (рис. 1).
  2. Вымойте клетки с PBS рН 7,4, царапина с 400 мкл PBS каждому, добавить 1X коктейля ингибитора протеазы (Roche, Indianapolis, IN) и разрушают клетки, используя Precellys24 гомогенизатора (Бертен технологий, Франция). Короче говоря, добавляют 1 мл клеточной суспензии в 2-х трубной лизиса мл и добавляют 10 керамические бусины. Лизиса клеток с 3 х 60 импульсов сек. Механической силой процесса можетповышения температуры внутри образца выше 37 ° С, так следует позаботиться, чтобы охладить образец на лед после лизиса процедуры.
  3. Охладить клетки на льду и добавляют 10 мМ MgCl 2, 40 ед / мл ДНКазы и инкубировать в течение 60 мин при 37 ° C
  4. Подготовка решений 80%, 50%, 20% сахарозы (вес / объем) в PBS рН 7,4 (10 мл каждая).
  5. Подготовка градиента сахарозы в 15 мл трубки сокола, начиная с 2 мл 80% сахарозы, затем 50% и 20%. Залить градиентом медленно и будьте осторожны, чтобы не нарушить уже налил слоев. Слой переваривается лизат в верхней части градиента и центрифуги в течение 15 мин при 1000 мкг при 4 ° C.
  6. Осторожно собрать межфазных между 50-80% сахарозы слоя с помощью пипетки и смешать с 5 объемами PBS рН 7,4. Центрифуга в течение 15 мин при 1000 мкг при 4 ° C. Повторите промывание два раза. В этом интерфазе, aggresomes являются люминесцентные и могут быть визуализированы в микроскоп, под воздействием ультрафиолетового излучения.
  7. Удалите супернатант иресуспендируют осадок в 250-500 мкл PBS рН 7,4. Этот осадок содержит очищенный aggresomes (рис. 2).

3. Лечение получателя SH-SY5Y Клетки с mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes

  1. Семенной 5 х 10 4 получателем SH-SY5Y человеческих клеток нейробластомы конститутивно выражения GFP-DISC1 (598-854) на стерильные покровные стекла в каждую лунку 24-луночный планшет. SH-SY5Y клетки культивируют в DMEM/F-12 среде с добавлением пенициллина / стрептомицина, без незаменимых аминокислот (NEAA) и 10% FBS.
  2. 24 час позже, добавьте 10 мкл в каждую лунку и инкубировать в течение 48-72 часов.
  3. Вымойте клетки: 3 х PBS рН 7,4 и утолить внеклеточной флуоресценции с 0,04% трипановым синим в течение 5 мин.
  4. Исправить клетки с 4% PFA в PBS рН 7,4 в течение 10 мин на льду, мыть один раз стерильной H 2 O и установить покровные на предметные стекла с золотой продлить с DAPI монтаж среды (Invitrogen, США).
  5. Подтвердите поглощение /вторжение экзогенно применяется aggresomes по колокализации работу с белками выраженных клеток реципиента в Z-стек изображений.

Тем не менее, поглощение / Вторжение экзогенных белков не может быть обнаружено по существу параллельно с набором хозяин клеточного белка. В нашем примере mRFP с метками DISC1 aggresomes новобранца растворимые GFP с метками DISC1 (598-854) белок выразил в клетку-хозяина (см. Рисунок 3). Представленные фотографии были сделаны на Zeiss LSM 510 конфокальной или микроскоп Zeiss AxioVision Apotome2.

4. Поколение рекомбинантных DISC1 (598-785)

В предыдущей публикации мы проанализировали способность различных DISC1 фрагменты белка самостоятельно взаимодействовать на основе наличия самоассоциации области. Среди всех белковых фрагментов испытания человека DISC1 (598-785) отображается самая сильная склонность мультимеризацию 4 (рис. 4). Таким образом, человек DISC1 (598-785), был клонирован в pET15b (нетVagen, Madison, Wisconsin), содержащих N-терминал 6-гистидин тегов, выраженное в E. палочки BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, США), и очищенный в денатурирующих условиях в 8 моль / л мочевины, как описано 4. Короче говоря, протокол приводится ниже.

  1. BL21-(IDE3) Rosetta E. палочки были выращены в 2 х 500 мл 2YT, содержащего 5 мМ-аргинин-HCl, 5 мМ MgSO4, 100 мкг / мл carbencillin, 35 мкг / мл хлорамфеникола до OD 600: 0.6-0.8 и DISC1 (598-785) выражение индуцированного с 1 мМ IPTG.
  2. DISC1 (598-785) была высказана в течение 4 часов при 37 ° C, выражение было прекращено, собирая бактерии путем центрифугирования.
  3. Бактериальных ресуспендировали в 50 мл ТЕ-буфера (50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 5 мМ EDTA) плюс 2 мМ PMSF, 1% TX-100, 250 мкг / мл лизоцима, 20 мМ MgCl 2 и 400 мл U/50 ДНКазы I. Для обеспечения полного лизиса, реакция инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
  4. Добавить 10 мМ β-mercaptoethanol (ME) и 500 мМ NaCl и инкубировать в течение еще 30 мин.
  5. Спином вниз бактериальных телец включения при 20000 г в течение 30 мин при 4 ° C.
  6. Ресуспендируют гранул в 50 мл экстракционного буфера содержащего 50 мМ Трис, рН 8,0, 5 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 8 М мочевины и 10 мМ β-ME и удаления мусора с помощью центрифугирования при 20000 г в течение 30 мин при 4 ° C.
  7. Вымойте Ni-NTA агарозы матрицу с буфером для экстракции. Инкубируйте ресуспендированных, precleared экстракт белка с Ni-NTA матрицы в течение 2 часов при комнатной температуре.
  8. Вымойте Ni-NTA матрица с добычей буфера, содержащего 12 мМ имидазола.
  9. Элюируйте белка медленно с 15 мл элюции буфером, содержащим 50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазола, 8 М мочевины, 1 мМ PMSF, 5 мМ ЭДТА и 10 мМ β-ME.
  10. Диализировать белка поэтапно в PBS рН 7,4, содержащем 10 мМ β-ME.

Из 1 л бактериальной культуры, начиная можно выделить до 50 мг рекомбинантного DISC1 (598-785), протЭйн.

α-синуклеина рефолдинг

Для экспериментов с α-синуклеина, 500 мкг рекомбинантного белка (Sigma-Aldrich, США) растворяли в PBS в концентрации 1 мг / мл. Для получения олигомеров, рефолдинг была выполнена в течение ночи при 37 ° C, как описано в предыдущей публикации 10.

5. Маркировка рекомбинантного DISC1 (598-785) с DyLight594

  1. До последующего процесса маркировки, DISC1 (598-785) белка быть освобождены от β-ME. Таким образом, белок диализуют 3 раза PBS рН 7,4 в разведении 1:2000.
  2. Метка 1 мг DISC1 (598-785) с DyLight 594 малеимида (Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, растворить 1 мг / мл белка в PBS рН 7,4 и добавьте 5 мМ TCEP восстановить бесплатное тиоловых групп. Добавить 20 мкл ДМФ растворяли краски реакции и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
  3. Диализировать белка 3 х в PBS рН7,4 при соотношении 1:2000 в течение 2 часов каждая.

Для дальнейшего повышения чистоты меченых белков Его 6-отмеченных привязку очистки на Ni-NTA колонке выполняется.

  1. Вымойте 1 мл Ni-NTA матрицы (Qiagen, Германия) с 10 мл PBS рН 7,4.
  2. Применение меченых, диализуют белка в колонну и дайте ему поработать над колонной медленно.
  3. Вымойте белка с 3 х 20 мл PBS рН 7,4
  4. Элюируйте белка с PBS рН 7,4, 500 мМ имидазола по каплям при мониторинге цветные полосы на Ni-NTA колонке для уменьшения объема элюата.
  5. Диализировать элюата 3 х до 10 мМ NaPi рН 7,4 в разведении 1:2000 в течение 2 часов каждая.
  6. С помощью стерильного шприца 0,45 мкм фильтр для фильтрации элюата, аликвоты в 5 х 100 мкл образцов и оснастки замораживание в жидком азоте. Общее количество белка должно составлять 0,5 - 1 мкг / мл в каждый 100 мкл.

дополнительно концентрATION шаг

  1. Для стереотаксической инъекции крыс, белок был сосредоточен 10-кратный в скорости переменного тока (Eppendorf Концентратор 5301). Окончательные условия буфер 100 мМ NaPi.

α-синуклеина маркировки

Маркировки и очистки (Ni-NTA колонке) рекомбинантного α-синуклеина был выполнен параллельно с DISC1 (598-785). Общее исходное вещество было 500 мкг вместо 1 мг для DISC1 (598-785).

6. Лечение получателя SH-SY5Y Клетки с Маркированный рекомбинантного DISC1 (598-785) Протеин

  1. Семенной 5x10 4 получателем SH-SY5Y человеческих клеток нейробластомы конститутивно выражения GFP-DISC1 (598-854) на стерильные покровные стекла в каждую лунку 24-луночный планшет.
  2. Добавить меченого белка в среде для культивирования клеток в концентрации 5-10 мкг / мл и инкубируют в течение 48-72 часов.
  3. Вымойте клетки: 3 х PBS рН 7,4 и утолить добычеellular флуоресценции с 0,04% трипановым синим в течение 5 мин.
  4. Исправить клетки с 4% PFA в PBS рН 7,4 в течение 10 мин на льду, мыть один раз стерильной H 2 O и установить покровные на предметные стекла с золотой продлить с DAPI монтаж среды (Invitrogen, США).
  5. Подтвердите поглощение / вторжения экзогенно применяется рекомбинантный белок по колокализации работу с белками выраженных клеток реципиента в Z-стек изображения, создаваемые при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Тем не менее, набор эндогенного белка не может быть обнаружено по существу параллельно с вторжением хозяин клеточного белка, Z-стек изображений все еще может подтвердить инвазивный характер белка.

В нашем примере рек. DISC1 (598-785) * по крайней мере в части новобранцев растворимые GFP с метками DISC1 (598-854) белок выразил в клетку-хозяина (рис. 5А). Для рекомбинантного α-синуклеина вторжения, но не призыв показано на рисунке (рис. 5б). Представленные фотографии были сделанына Zeiss LSM 510 конфокальной или Zeiss AxioVision Apotome2 микроскоп.

Введение концентрированного (около 4 мкл 2,5 мкг / мкл), обозначенный DISC1 (598-785) * в MPFC результаты в распространении белка вокруг места инъекции, которые могут быть обнаружены даже после перфузии животных с 4% PFA в PBS рН 7,4 с родамина filterset. В нашем примере DISC1 (598-785) занимают различные числа нейронов и могут быть проверены с Z-стека изображений (рис. 6).

В целом, введение белков, отличных от тех, которые используются здесь, не обязательно приводят к клеточной вторжения. Вторжение событие существенно зависит от природы белка, тем не менее, чистый очистка является необходимым условием для дальнейшего анализа.

7. Представитель Результаты

Aggresomes, состоящий из рекомбинантного FL DISC1-EGFP очищенный из клеток NLF вторглись получателя SH-SY5Y сеООО с низкой эффективностью (около 0,3% 5), как показано на колокализации с конфокальной микроскопии (рис. 3). Как сообщалось ранее, DISC1 (598-785) выразили и очищают от E. палочки образуется мультимеров 4 были одинаково клетки-инвазивных при КПД около 20% 5 (рис. 5А) похож на α-синуклеина, который был использован в параллельном качестве положительного контроля (рис. 5В). Маркированный рекомбинантного DISC1 (598-785) выразили и очищают от E. палочка была также клетки-инвазивной для нейронов в естественных условиях, когда мультимерные белка стереотаксически вводят в медиальной префронтальной коре крыс (рис. 6; Pum, Bader, Хьюстон, Korth, не опубликовано).

Рисунок 1
Рисунок 1. Клеток нейробластомы NLF временно выражения FP-DISC1 (красный). Красные флуоресцентные aggresomes может быть детеИДКТК в клетках.

Рисунок 2
Рисунок 2. Очищенный mRFP с метками DISC1 aggresomes после очистки в градиенте сахарозы.

Рисунок 3
Рисунок 3. Флуоресцентная картина вторглись aggresomes. mRFP с метками flDISC1 aggresomes были очищены и инкубировали с SH-SY5Y клеток нейробластомы гиперэкспрессией растворимые GFP с метками DISC1 (598-854). Поглощения меченого aggresomes контролируется Z-стек изображений на Laser-Scan микроскоп (Zeiss LSM 510).

Рисунок 4
Рисунок 4. SEC-профиль рек. DISC1 (598-785), содержащих S704 и C704 одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP). Оба варианта показывают нарушение приказал олигомеризации и формирования высокого молекулярного веса мультimers (красная стрелка). Эта картина изменилась с момента публикации Leliveld и соавт., Биохимии 2009 года.

Рисунок 5
Рисунок 5. Флуоресцентные Z-стек картина инвазивных DyLight-меченых рекомбинантных DISC1 (598-785). SH-SY5Y клеток нейробластомы выразив растворимой GFP-DISC1 (598-854) инкубируют с меченым, рекомбинантного белка в концентрации 5 мкг / мл. (A) Красный агрегатов показывает вторжение в Рек. DISC1 (598-785), белки и желтые точки показывают набора растворимых GFP-DISC1 (598-854) в агрегатах. (B) рекомбинантного α-синуклеина (красный) проникает в клетки без набора с частотой около 20%. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 6
Рисунок 6. Иммунофлуоресцентного картинувводили меченый, рекомбинантный DISC1 (598-785) белка. Z-стек изображений подтверждает наличие рек. DISC1 (598-785) белков в нейронах коры головного мозга крысы окрашивали антителами против нейронов ядер (NeuN, зеленый).

Discussion

В этой работе мы описываем очистки mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes из трансфицированных линии клеток нейробластомы, подготовка и маркировки рекомбинантного белка DISC1 видов и их применение в клеточной вторжения экспериментов клетки реципиента в пробирке и в естественных условиях.

Очистка родной mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes была разработана с протоколами, чтобы изолировать тело Леви-структур и крупных агрегатов 13, 14, но изменен, чтобы избежать использования моющих средств и минимизировать риск ложных положительных клеток вторжения, которые могут возникнуть в связи с моющим средством при содействии проницаемости мембран.

Одним из возможных улучшение будущем может быть, чтобы еще больше повысить чистоту aggresomes с помощью ультразвука полностью отделить оставшиеся мембраны и цитоскелета от aggresomes. При увеличении общей чистоты, общее количество событий вторжения, зафиксированного на большой aggresomes маУ быть увеличена 5. Если ограниченное определение из предложенных 3-фазный сахарозы является достаточным для aggresomes других видов белка должна быть проверена, в этом смысле протокол изложенные здесь следует рассматривать в качестве отправной точки для индивидуальной оптимизации. Очищенный aggresomes оказались весьма надежными в наших руках, дополнительные шаги стирки (без моющих средств), чтобы устранить следы сахарозы не значительно уменьшить общий выход.

В предыдущей публикации мы рассказали, что олигомер сборки DISC1 зависит от различных областей мультимеризацию в С-концом 4 (рис. 4). Мы выбрали этот фрагмент для рекомбинантного растворимого выражение в E. палочки и последующих и Ni-NTA очистки. Чтобы следить за его мультимеризацию и сравнить его клетки инвазивность с описанным клеточного белка, как инвазивные α-синуклеина, мы обозначили DISC1 (598-785) с флуоресцентным красителем DyLight594, и сравнил ееклеточных инвазивность с одинаково помечены α-синуклеина. Клеточных инвазивности рекомбинантного DISC1 фрагмент резко возросло по сравнению с родным, полная длина DISC1 aggresomes, вероятно, из-за меньшего размера и намного выше чистота. Опять же, чистота, кажется, играет решающую роль в клеточной инвазии.

В нашем примере инвазивных aggresomes работу растворимого белка гомолог линии клеток-мишеней, который был рекомбинантно выражается в растворимые, то есть клетки-дисперсной форме. Выражение флуоресцентного белка (GFP например, или RFP) в клеточной линии получателем является преимуществом, так как позволяет колокализации инвазивных aggresomes и рекомбинантных белков в пределах клетки получателя с помощью Z-стек изображений.

Cell-инвазивной DISC1 aggresomes и многомерные фрагменты выразил и очищают от E. палочка может стать определяющей чертой белка конформационного заболевания, связанные с DISC1, DISC1opathies 15.

Поиск и устранение неисправностей:

Температура aggresome выход после очистки сахарозы градиент:

Градиента сахарозы введена в данный протокол хорошо работает с eGFP/mRFP-DISC1 (Флорида) aggresomes. Aggresomes, состоящие из других белков может быть переменных размеров, следовательно, концентрации сахарозы должна быть оптимизирована за счет других пользователей.

Вашем очистки рекомбинантных белков:

Любой бактериальных загрязнений в процессе очистки рекомбинантного белка также будут помечены в последующих шагов протокола. Чтобы избежать загрязнений, запустить белка на SDS-PAGE и убедитесь, что рекомбинантного белка не менее 95% чистой окрашиванием Кумасси-Blue. Для обеспечения высокого качества и урожайности, протокол должен быть оптимизированы для каждого индивидуального белка.

Температура маркировке EFтивность рекомбинантных белков:

Любые загрязнения, которые содержат бесплатные SH-групп снизит эффективную маркировку белка. Таким образом, обширная диализа и Ni-NTA основе очистки является обязательным.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Нейрон-Eranet обнаружить (BMBF 01EW1003) в СК и JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033), чтобы CKVB поддерживается грантом Forschungskommission медицинского факультета Университета Дюссельдорфа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093 Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
DMEM/F-12 Invitrogen 11320-033 Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
PBS Invitrogen 14190-250
Metafectene Biontex T020-1.0 Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol.
Ni-NTA agarose Qiagen 30210 The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well.
DNase I Roche 04716728001 There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Opti-MEM Invitrogen 31985-062 Serum-free medium works as well
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122 Supplement for SH-SY5Y and NLF medium
Non-essential-amino-acids (NEAA) Sigma-Aldrich M7145 Supplement for SH-SY5Y medium
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154 Toxic reagent
DyLight 594 Maleimide Thermo-Fisher Scientific 46608 Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors.
ProLong Gold with DAPI Invitrogen P36935 This antifade liquid mountant gave superior results in our hands.
Protease Inhibitor cocktail Roche 11873580001 Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution.
Synthetic a-synuclein Sigma S7820 Refold as described in text.
Table of specific reagents.
Precellys 24 Bertin Technologies 03119.200.RD000 We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol.
5301 Concentrator (speedvac) Eppendorf 5301 000.210 Only necessary if protein has to be concentrated.
LSM 510 and Axiovision Apotome2 Zeiss See manufacturers catalog Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events.
Cell culture plastic material Nunc 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here.
Table of specific material and equipment.
Number Buffer name content Comments
1. Bacterial growth medium 16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml carbencillin, 35 μg/ml chloramphenicol Grow bacteria to OD600: 0.6-0.8 induce expression with 1 mM IPTG.
2. Bacterial resuspension buffer 50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lysozyme, 20 mM MgCl2 and 400 U/50 ml DNase I Resupend bacterial pellet from 1 L overnight culture in 50 ml resuspension buffer.
3. Protein extraction buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME
4. Ni-NTA column wash buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME, 12 mM imidazole Modified extraction buffer with 12 mM imidazole added.
5. Ni-NTA column elution buffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA and 10 mM b -ME The elution buffer contains 10 mM b -ME, which is dialyzed later on.
6. PBS 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4, adjust to pH 7.4
7. Labeling buffer PBS containing 5 mM TCEP
Table of recipes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Millar, J. K. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  2. St Clair, D. Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet. 336, 13-16 (1990).
  3. Leliveld, S. R. Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease. J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).
  4. Leliveld, S. R. Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C. Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).
  5. Ottis, P. Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes. Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).
  6. Meyer-Luehmann, M. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, 1781-1784 (2006).
  7. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).
  8. Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change. J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).
  9. Clavaguera, F. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).
  10. Desplats, P. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).
  11. Ren, P. H. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).
  12. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).
  13. Iwatsubo, T. Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease. Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).
  14. Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. Isolation of aggresomes and other large aggregates. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).
  15. Korth, C. DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1. Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).
Поколение, очистка и характеристика Cell-инвазивных видов белка DISC1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).More

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter