Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

Summary

Topologia de adesão celular num substrato é medida com uma precisão nanométrica de ângulo variável por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM-VA).

Abstract

Topologia de superfície, por exemplo, que as células crescem sobre um substrato, é determinada com uma precisão nanométrica por Variable Angle-Fluorescence Microscopy Internal Reflection total (TIRFM-VA). As células são cultivadas em lâminas transparentes e incubaram-se com um marcador fluorescente homogeneamente distribuídos na sua membrana plasmática. Iluminação ocorre por um feixe de laser paralelo sob um ângulo variável de reflexão interna total (TIR), com diferentes profundidades de penetração do campo electromagnético evanescente. A gravação de imagens de fluorescência após irradiação a cerca de 10 diferentes ângulos permite calcular distâncias célula-substrato, com uma precisão de alguns nanómetros. As diferenças de adesão entre as linhas de células diferentes, por exemplo, células cancerosas e células malignas, menos são assim determinados. Além disso, as variações possíveis de adesão das células mediante tratamento químico ou fotodinâmica pode ser examinado. Em comparação com outros métodos de super-resolução de exposição de microscopia de luz é mantidadanos muito pequena, e não de células vivas é de esperar a ocorrência.

Introduction

Quando um feixe de luz que se propaga através de um meio de índice de refracção n ₁ encontra uma interface para um segundo meio de índice de refracção n ₂ <n _1, a reflexão interna total ocorre em todos os ângulos de incidência Θ, que são maiores do que o ângulo crítico Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Apesar de ter sido totalmente reflectido do feixe de luz incidente evoca um campo electromagnético evanescente que penetra no segundo meio e decai exponencialmente com a distância perpendicular a partir da interface de z de acordo com a I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) corresponde à intensidade do campo electromagnético e d (Θ) para a profundidade de penetração no comprimento de onda λ, como dada pela

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ^{2 2} Θ pecado - n _{² 2)} ^{-1 / 2}

Conforme relatado na literatura ^1,2, I ₀ e multiplicada com o factor de transmissão T (Θ) e a relação de n ₂ / n _1. Se o vector do campo eléctrico do feixe de luz é perpendicular ao plano de polarização da incidência (isto é, o plano gerado pelo incidente e do feixe reflectido), este factor de transmissão é dada pela

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 - (n ₂ / nL ₁₎ ^2]

Para a intensidade de fluorescência detectada no TIRFM medições, a absorção de luz tem de ser integrado ao longo de todas as camadas da amostra e multiplicado com o rendimento quântico de fluorescência do corante η relevantes, bem como com o ângulo sólido de detecção Ω. Como relatado anteriormente ^3, esta intensidade pode ser descrita pela

Eu _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

se todos os fatores que são f independente rom o ângulo de incidência e do Θ z coordenadas estão incluídos dentro da Equação A. experimental constante 3 pode ser resolvido analiticamente, se a concentração c (z) de fluoróforos é considerado para ser quase constante

- Quer no todo z ≥ Δ coordenadas, por exemplo, dentro do citoplasma das células com uma distância Δ partir da interface. Neste caso, a integral tem de ser calculada a partir de z = Δ para z = ∞ resultando

Eu _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

- Ou entre z = Δ - t / 2 e z = Δ + t / 2, ou seja, dentro de uma fina camada de espessura t, por exemplo, uma membrana celular, localizado a uma distância a partir da interface Δ. Neste caso, a intensidade de fluorescência pode ser calculado como

Eu _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

se t é pequeno em comparação com Δ.

> ent "A partir das Equações (4) e (5) da célula-substrato distâncias Δ pode ser calculado, se as imagens de intensidade de fluorescência, _F I são registados por ângulos variáveis ​​Θ, e se ln (I _F / T d) (Eq. 4) ou ln (I _F / T) (Eq. 5) é avaliada como uma função de 1 / d para esses ângulos. Para a membrana laurdan marcador utilizado no presente documento (s. abaixo), a avaliação foi realizada de acordo com a Equação 5..

Como relatado anteriormente ³ de aquisição de imagem, e requer a avaliação
- Distribuição homogênea da luz de excitação sobre a amostra,
- A validade de um modelo de 2-camadas (com os índices de refracção n ₁ e n ₂ para o substrato e do citoplasma, respectivamente). Isto aplica-se a membrana do plasma é muito fina e, se a camada do meio extracelular (entre a célula e o substrato) é pequeno em comparação com o comprimento de onda da luz incidente.

Além disso, a abertura de uma moderada numérica(Tipicamente 0,90 ≤ A) da lente da objectiva do microscópio é vantajosa para evitar desvios de brilho devido a anisotropia da radiação no domínio próximo da interface dielétrico.

Protocol

1. Sementeira e incubação de células

1. Semente de células individuais, por exemplo, U373-MG ou células U-251 MG-glioblastoma a uma densidade típica de 100 células / mm ² sobre uma lâmina de vidro e crescê-los para 4872 horas em meio de cultura (por exemplo, meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela e antibióticos), utilizando uma incubadora a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Incubar as células com um marcador de membrana, por exemplo, 6-dodecanoil-2-dimetilamino-naftaleno (laurdan) aplicado durante 60 minutos a uma concentração de 8 mM (em meio de cultura) ^4, ou um marcador de citoplasma, por exemplo, calceína acetomethlyester aplicado durante 40 minutos a uma concentração de 5 uM ^3, ou de uma membrana associada fotossensibilizador, por exemplo, protoporfirina IX induzida após 4 horas de incubação com o seu precursor, o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA, 1 mM), ^4,5.
3. Lavar as células com meio de cultura ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da microscopia de fluorescência. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. Usar um microscópio vertical, por exemplo, Zeiss Axioplan, e substituir o condensador por um dispositivo de iluminação, tal como descrito na ref. 3 com um hemi-esférica ou de um prisma de vidro cilíndrico hemi-opticamente acoplado à corrediça objecto (ver Figura 1).
2. Usar um feixe laser colimado paralelo que após imagiologia pelo prisma de vidro e outros componentes ópticos (por exemplo, espelho côncavo) novamente resulta num feixe paralelo à superfície da amostra (raio da pupila telecêntrica). Tomar cuidado para que o vector de campo eléctrico é perpendicular polarizada ao plano de incidência.
3. Use um espelho ajustável localizado no interior do condensador que é imaginada no plano da amostra e ilumina a amostra sob um ângulo variável de incidência (ray objeto). O espelho ajustável pode ser accionado por um motor de passo, em que cada posição corresponde a um ângulo de incidência bem definida, tal como determinado por medições goniométricas ³
4. Calibrar a posição angular do espelho ajustável usando o ângulo crítico Θ _c = 61,3 ° para uma transição de vidro-água como um valor fixo. Θ _c podem ser visualizados mediante variação do Θ quando um corante fluorescente (por exemplo, 1 mM de mononucleótido de flavina, FMN) é dissolvido em água. A posição do espelho em Θ Θ = _c é armazenado no programa de posicionamento do espelho.
5. Definir os parâmetros da câmera (iluminação traseira Andor ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, Reino Unido ^6), incluindo temperatura, tempo de gravação, ganho e velocidade de deslocamento.
6. Use uma lente objectiva de ampliação apropriado e preferencialmente moderado abertura numérica (por exemplo, 40 × / 0,75 ou 63 × / 0,90 imersão em água) e localizar o slide objecto no microscópio. Usar óleo de imersão para assegurar um contato óptica da amostra com o prisma de vidro. Gravar imagens de fluorescência das amostras idênticas mediante variação doângulo de iluminação (Θ ≥ Θ Θ _c com _c correspondendo a 64,5 ° de um interface de célula de vidro). Uma variação angular de 66 ° -74 ° com passos de 0,5 ° ou 1 ° é recomendada. Use um passe longo ou apropriado filtro passa banda para a detecção de fluorescência.

3. Análise de Dados

1. Ler as imagens (por exemplo, em formato ASCII) gravadas em vários ângulos Θ, bem como as configurações da câmara (para a discriminação de fundo), o comprimento de onda de excitação e os índices de refracção do vidro (n ₁ = 1,52) e células (n ₂ = 1,37) para o programa de avaliação (LabView; NanoCell). Para cada conjunto de parâmetros a profundidade de penetração d (Θ) e de transmissão factor T (Θ) são calculados automaticamente.
2. Selecione as imagens utilizadas para avaliação de célula-substrato distâncias Δ acordo com a Equação 5 (marcador de membrana) ou Equação 4 (marcador de citoplasma), as imagens individuais com heterogêneailuminação (e revelador, g. riscas) podem ser excluídos.
3. Calcule imagens de células-substrato topologia e seleccionar um código de cor apropriada para exibição. Durante perfis de avaliação dos pixels individuais podem ser apresentados, como descrito na Figura 2. Estes perfis podem ser usados ​​como um indicador da qualidade do ajuste.
4. Armazenar o protocolo de avaliação.

4. Resultados representativos

Experiências representativas são realizadas com células geneticamente modificadas U251-MG glioblastoma, gentilmente cedidos pelo Prof Janeiro Mollenhauer, Departamento de Oncologia Molecular, Universidade do Sul da Dinamarca, Odense. Em dois subclones destas células U251 os genes supressores de tumor TP53 ou PTEN estão sobre-expressa utilizando um sistema de Tet-On expressão indutível, de tal modo que as mesmas exibem um potencial tumorigénico reduzida e pode ser considerado como menos maligna. Altamente malignas U251-MG células sem gene supressor são utilizadas como controlos, e U251-Células do tipo MG silvestres servem para uma posterior comparação. Um díodo laser emitindo uma série de impulsos quase contínua picossegundos (LDH400 com condutor PDL 800-B, Picoquant, Berlim, Alemanha; comprimento de onda: 391 nm; pulso de energia: 12 pJ; taxa de repetição: 40 MHz) é usado como uma fonte de excitação.

Na Figura 3 imagens TIRFM de U251-MG células de glioblastoma com um gene supressor de tumor TP53 activado e incubado com laurdan (8 uM; 60 min) são representadas por ângulos de incidência de 66,0 °, 69,0 ° e 73,0 ° correspondendo a profundidade de penetração do campo electromagnético evanescente de cerca de 140 nm, 75 nm e 60 nm, respectivamente. Com a diminuição da profundidade de penetração de fluorescência diminui de intensidade (ver tabelas), e origina a partir de locais mais superficiais do que as células (por exemplo, os contactos focais nas suas extremidades). Célula-substrato distâncias (visualizado na Figura 3d por um código de cores que varia de 0-600 nm) variam fortemente sobre as células entre emly alguns nanômetros (branco-amarelo) e 250-300 nm (vermelho escuro), ou seja, contatos focais e maiores de células-substrato distâncias são muito próximos. O mesmo é válido para U251-MG células de glioblastoma com um gene supressor de PTEN activado (Figura 4d), ​​enquanto célula-substrato distâncias são mais ou menos constante para U251-MG e controle de células de tipo selvagem, com os valores típicos de 80-100 nm (amarelo; Figura 4b ) e 150-200 nm (laranja-vermelho; Figura 4a).

Figura 1. Dispositivo de iluminação para VA-TIRFM em um microscópio vertical. Um espelho ajustável accionado por um motor passo permite uma resolução angular de ± 0,25 °.

Figura perfil Avaliação 2. Por um pixel (esquemática). Quando ln [I _F / T (Θ)] é representada como uma função de 1 / d (Θ), o declive representa a célula-substrato distância Δ. Esta inclinação é normalmente determinada com uma precisão de cerca de ± 10%. Um valor - resultante de iluminação não homogênea - tem sido marcada e excluídas da avaliação.

Figura 3 imagens TIRFM de U251-MG com células de glioblastoma activado gene supressor TP53 após incubação com laurdan (8 uM; 60 min). Gravada em vários ângulos de iluminação (ac); célula-substrato distâncias na gama de 0-600 nm mostrado por um código de cores (d); comprimento de onda de excitação: 391 nm, detecção: ≥ 420 nm; tamanho da imagem: 210. mM mM × 210 Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4 Células-substrato distâncias de U251-MG glioblatoma células na gama de 0-600 nm mostrados por um código de cores,. (A) de tipo selvagem (b) Controlos, (c) células activadas com gene supressor TP53, (d) células com PTEN gene supressor ativado; comprimento de onda de excitação: 391 nm, detecção: ≥ 420 nm; tamanho da imagem: 210. mM mM × 210 Clique aqui para ver maior figura .

Discussion

É descrito um método para a medição de célula-substrato distâncias com uma precisão nanométrica. Presentemente, os métodos de resolução super-microscopia, por exemplo, com base na iluminação estruturada ⁷ ou em ^8-10 de detecção de moléculas isoladas, assim como depleção emissão estimulada (STED) Microscopia ¹¹ são de considerável interesse. Nenhuma destas técnicas, contudo, permite uma resolução axial inferior a 50 nm. Além disso, a irradiância bastante elevada de 50,100 W / cm ² é necessário para os métodos de moléculas isoladas e mais de 3,000 W / cm ^2, para microscopia STED. Este valor ultrapassa radiação solar (cerca de 100 mW / cm ²⁾ em várias ordens de magnitude, de modo que os danos para as células vivas rápida é provável que ocorra. Em VA-TIRFM experiências, no entanto, a irradiação pode ser limitado a menos de 20 mW / cm ^2, o que permite tempos de exposição de alguns minutos, ou até mesmo horas, sem qualquer dano para as células vivas ^12, de modo que as experiências de longa duração com mulexposições tiple aparecer bem possível. Principais pré-requisitos para cada experimento são de calibração angular boa e iluminação homogênea de slides objeto limpo.

VA-TIRFM pode ser aplicado a numerosos tópicos relacionados com superfícies técnicas ou biológica, por exemplo, medições de adesão das células a um substrato transparente. O crescimento celular, migração celular ou a morte celular (por exemplo, apoptose) pode, portanto, ser estudada mais em pormenor. Recentemente, o papel do colesterol intracelular na adesão das células foi examinada ^4. Em particular, descobriu-se que o número de célula-substrato foi reduzido sobre os contactos de depleção de colesterol em 3050%, conduzindo, finalmente, a separação de um número maior de células do seu substrato. A adesão celular foi também estudada por aplicação de fotossensibilizadores usados ​​em terapia fotodinâmica (PDT) de cancros e outras doenças ^13. Descobriu-se que, após a irradiação com doses não-fototóxicas luz célula-substrato distânciasforam ligeiramente reduzido (possivelmente devido a um inchaço da célula), enquanto que as adesões focais foram mantidos ^{a 4,5.} Por conseguinte, a formação de metástases, devido a PDT não era provável de ocorrer. Experiências atuais mostram diferenças de adesão celular entre tumor (glioblastoma) e células menos malignos. Apenas experiências futuras provará se este comportamento diferente pode ser utilizado para aplicações de diagnóstico, farmacológicos ou terapêuticos.

Deve sublinhar-se que as medições de célula-substrato contactos datam do começo da microscopia TIRF ^14. Resolução angular, no entanto, precisava de equipamento bastante complexo ^15, até agora, e só para o desenvolvimento de um dispositivo de iluminação compacto para variável de ângulo TIRFM ^três medições de rotina permitidos de células-substrato topologia. Além deste tipo TIRFM prisma, miniaturização foi introduzido por objetivo do tipo TIRFM ^16,17, em que uma única mancha (ou anel) perto da borda deo plano da abertura da lente da objectiva do microscópio é iluminado, de modo que a luz pode cair sobre a amostra sob um ângulo Θ ≥ Θ _C. Por conseguinte, as lentes de grande abertura objectivos que permitam uma gama angular de cerca de 66-75 ° são necessários. Ajustando o ângulo Θ, no entanto, requer uma mudança definida do foco do laser dentro de uma distância de menos de 100 um, o que é difícil de executar, mesmo em um microscópio TIRFM comercializado. Outras desvantagens de alta abertura (e alta ampliação) lentes objetivas são anisotropia campo próximo e campos de objeto bastante limitado. Portanto, em comparação com as configurações de objectiva de tipo TIRFM experimentais, tal como descrito no texto são preferíveis para a medição de célula-substrato topologia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera