Nanotopology клеточной адгезии по переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM)

Summary

Топология адгезии клеток на подложке измеряется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (VA-TIRFM).

Abstract

Топологию поверхности, например, клеток, растущих на подложке, определяется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM). Клетки культивируются на прозрачных слайдов и инкубировали с флуоресцентным маркером равномерно распределены в их плазматической мембраны. Освещение происходит путем параллельного пучка лазера при переменным углом полного внутреннего отражения (ПВО) с различной глубиной проникновения затухающих электромагнитных полей. Запись флуоресцентных изображений при облучении около 10 различных углов позволяет рассчитывать клетки с субстратом расстояния с точностью до нескольких нанометров. Различия адгезии между различными клеточными линиями, например, раковых клеток и менее злокачественных клеток, таким образом, определена. Кроме того, возможны изменения клеточной адгезии при химическом или фотодинамической терапии могут быть рассмотрены. По сравнению с другими методами супер-разрешение воздействия световой микроскопии сохраняетсяочень маленький, и без повреждения живых клеток, как ожидается, произойдет.

Introduction

Когда луч света, распространяющегося через среду с показателем преломления п ₁ соответствует интерфейс для второй среде с показателем преломления п ₂ <N _1, полное внутреннее отражение происходит на всех углах падения Θ, которая больше, чем критический угол Θ _с = агсзш (N ₂ / N _1). Несмотря на полное отражение падающего света вызывает затухающих электромагнитных полей, который проникает во вторую среду и убывает экспоненциально с перпендикулярной расстоянии г от интерфейса в соответствии с I (г) = I ^{_{0-эз / D (Θ).}} Я (г) соответствует интенсивности электромагнитного поля и D (Θ) с глубиной проникновения на длине волны λ, определяемый

D (Θ) = (λ/4π) (п ₁ ² грехов ² Θ - N _{² 2)} ^{-1 / 2}

Как сообщалось в литературе, ^1,2, I ₀ электронной умножается на коэффициент пропускания T (Θ) и соотношение N ₂ / N _1. Если вектор напряженности электрического поля этой световой луч поляризован перпендикулярно плоскости падения (т.е. плоскости, натянутой на падающий и отраженный луч), этот коэффициент передачи определяется

T (Θ) = 4 соз ² Θ / [1 - (N ₂ / NL ₁₎ ^2]

Для обнаружены интенсивности флуоресценции в TIRFM измерений, поглощение света должно быть интегрировано над всеми слоями образца и умножается на квантовый выход флуоресценции η соответствующих красителей, а также с твердым угол обнаружения Ω. Как сообщалось ранее ^3, эта интенсивность может быть описан

Я _F (Θ) = AT (Θ) ° С (г) ^{е-Z / D (Θ)} йг

если все факторы, которые не зависят F ROM от угла падения Θ и координаты г, включены в экспериментальную постоянной Уравнение A. 3 может быть решена аналитически, если концентрация с (г) флуорофоров они считаются почти постоянной

- Либо вообще координат г ≥ Δ, например, в цитоплазме клетки, имеющие расстояние Δ от интерфейса. В этом случае интеграл должен быть рассчитана г = Δ для г = ∞ в результате

I _F = C T (Θ) D (Θ) ^{E-Δ / D (Θ)}

- Или между г = Δ - т / 2 и Z = Δ + т / 2, т. е. в тонком слое толщиной т, например, клеточные мембраны расположены на расстоянии Δ от интерфейса. В этом случае интенсивность флуоресценции может быть рассчитана как

I _F = C T (Θ) ^{тэ-Δ / D (Θ),}

Если Т мала по сравнению с Δ.

ENT "> Из уравнений (4) и (5) клетки с субстратом расстояния Δ может быть рассчитана, если изображение интенсивности флуоресценции I _F записываются для переменными углами Θ, а если п (I _F / T г) (уравнение 4) или п (I _F / T) (формула 5) вычисляется как функция 1 / сут в течение этих углов. Для мембранных маркеров лаурдана используемые в этой статье (ст. ниже) оценка была выполнена в соответствии с формулой. 5.

Как сообщалось ранее ^3, получения изображений и оценки требуется
- Равномерное распределение света возбуждения по образцу,
- Срок действия 2-х слойной модели (с показателями преломления N ₁ и N ₂ к подложке и цитоплазмы, соответственно). Это справедливо, если плазма мембрана очень тонкая, и если слой внеклеточной среде (между клеткой и подложкой) мала по сравнению с длиной волны падающего света.

Кроме того, умеренное числовой апертурой(Обычно ≤ 0,90) от объектива микроскопа выгодно, чтобы избежать отклонения яркости из-за анизотропии излучения в ближнем поле диэлектрик.

Protocol

1. Посев и инкубация клеток

1. Семенной отдельных клеток, например, U373-MG или U-251-MG клетки глиобластомы при типичной плотностью 100 клеток / мм ² на предметное стекло и выращивать их для 4872 часов в культуральной среде (например, RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков), используя инкубаторе при температуре 37 ° C и 5% CO _2.
2. Инкубируйте клетки с мембраной маркер, например, 6-додеканоил-2-диметиламино нафталина (лаурдана) применяется в течение 60 мин при концентрации 8 мкм (в культуральной среде) ^4, или цитоплазме маркер, например, кальцеин acetomethlyester применяется в течение 40 мин при концентрации 5 мкМ ^3, или мембраны связаны фотосенсибилизатора, например протопорфирина IX индуцированных на 4 ч инкубации с его предшественник 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК; 1 мМ) ^4,5.
3. Вымойте клеток с культуральной среды или фосфатным буферным раствором (PBS) до флуоресцентной микроскопии. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. Используйте прямой микроскоп, например, Zeiss Axioplan, и заменить его конденсатора освещения устройство, как описано в работе. 3 с полусферической или полу-цилиндрической стеклянной призмы оптически связанных с объектом слайда (см. Рисунок 1).
2. Используйте параллельные коллимированный лазерный луч, который после съемки в стеклянной призмы и дальнейшего оптических компонентов (например, вогнутое зеркало) снова приводит к параллельным пучком на поверхности образца (телецентрической лучей ученика). Позаботьтесь о том, вектора электрического поля поляризован перпендикулярно плоскости падения.
3. Используйте регулируемые зеркала, расположенного внутри конденсатора, который изображается в плоскости образца и освещает образец под переменным углом падения (объект луч). Регулируемые зеркала может быть вызвано шаговых двигателей, где каждая позиция соответствует и определенный угол падения, как это определено угломерных измерений ³
4. Калибровка углового положения регулируемые зеркала помощью критического угла Θ _с = 61,3 ° на стакан воды переходу в виде фиксированного значения. _С Θ могут быть визуализированы при изменении Θ, когда флуоресцентного красителя (например, 1 мМ флавинмононуклеотид, FMN) растворяется в воде. Положение зеркала на Θ = Θ _с хранится в программе позиционирования зеркала.
5. Установите параметры камеры (задней подсветкой Андор IXON EMCCD, DV887DC, ANDOR технологии, Belfast, UK ^6), в том числе температуры, усиление, время записи и сдвига скорости.
6. Используйте объектив соответствующего увеличения и преимущественно умеренный числовой апертурой (например, 40 × / 0,75 или 63 × / 0,90 погружения в воду) и локализовать объект слайда в микроскоп. Использование иммерсионного масла для обеспечения оптического контакта образца с стеклянной призмы. Запись флуоресцентных изображений идентичных образцов при измененииУгол освещения (Θ ≥ Θ Θ _с с _с соответствующей до 64,5 ° для клетки-стекло). Угловом диапазоне 66 ° -74 ° с шагом 0,5 ° или 1 ° рекомендуется. Используйте соответствующий длинный пас или фильтр полосы пропускания для флуоресцентной детекции.

3. Анализ данных

1. Читайте изображения (например, в формате ASCII), записанные под разными углами Θ, а также настройки камеры (для фона дискриминации), длина волны возбуждения и показатели преломления для стекла (п ₁ = 1,52) и клеток (N ₂ = 1.37) в оценке программы (LabView; NanoCell). Для каждого набора параметров глубины проникновения D (Θ) и коэффициента пропускания T (Θ) рассчитываются автоматически.
2. Выберите изображений, используемых для оценки клеточного субстрата расстояния Δ по формуле 5 (мембрана маркером) или уравнение 4 (цитоплазма маркер), отдельные изображения с неоднороднымосвещение (выявление д, ж. полосы) могут быть исключены.
3. Рассчитать изображения клетки с субстратом топологии и выберите соответствующий цветовой код для отображения. Во время оценки профилей отдельные пиксели могут быть показаны, как показано на рисунке 2. Эти профили могут быть использованы в качестве индикатора качества подгонки.
4. Хранить оценке протокол.

4. Представитель Результаты

Представитель эксперименты проводятся с генетически модифицированным U251-MG клеток глиобластомы любезно предоставлены профессором янв Mollenhauer, кафедра молекулярной онкологии, Университет Южной Дании, Оденсе. В двух субклонами тех U251 клетки генов-супрессоров опухолей TP53 или PTEN чрезмерно выражены с использованием Tet-On индуцибельной системы экспрессии, так что эти клетки обладают пониженной потенциальной онкогенных и может рассматриваться как менее злокачественные. Высоко злокачественных U251-MG клетки без ген-супрессор используются в качестве элементов управления и U251-MG клеток дикого типа служат для дальнейшего сравнения. Лазерный диод излучает почти непрерывный ряд пикосекундных импульсов (LDH400 с водителем PDL 800-B, Picoquant, Берлин, Германия; длина волны: 391 нм, энергия импульса: 12 PJ; частота повторения: 40 МГц) используются в качестве источника возбуждения.

На рисунке 3 TIRFM изображений U251-MG клеток глиобластомы с активированным TP53 супрессоров опухолей ген и инкубировали с лаурдана (8 мкМ, 60 мин) изображены на углах падения 66,0 °, 69,0 ° и 73,0 ° соответствующей глубины проникновения затухающих электромагнитных полей около 140 нм, 75 нм и 60 нм соответственно. С уменьшением флуоресценции глубина проникновения уменьшается в интенсивности (см. масштабах) и происходит от более поверхностных участках клеток (например, фокальных контактов по краям). Cell-подложка расстояния (визуализируется на рисунке 3d на цветовой код, начиная от 0-600 нм) сильно варьируют по ячейкам между нают несколько нанометров (бело-желтый) и 250-300 нм (темно-красный), т. е. фокальные контакты и больше клетки с субстратом расстояния находятся в непосредственной близости. То же самое касается U251-MG клеток глиобластомы с активированным геном PTEN супрессоров (рис. 4d), ​​в то время как клетки с субстратом расстояния, а для постоянных U251-MG контроля и клеток дикого типа с типичными значениями 80-100 нм (желтый, рисунок 4б ) и 150-200 нм (оранжево-красные; рис. 4а).

Рисунок 1. Освещение устройства для VA-TIRFM в вертикальном микроскопом. Регулируемые зеркала приводом от шагового двигателя позволяет угловое разрешение ± 0,25 °.

Рисунок 2. Оценка профиля для одной пикселейEL (схема). Когда Л. Н. [I _F / T (Θ)] строится как функция 1 / D (Θ), наклон представляет клетки с субстратом расстояние Δ. Этот склон обычно определяется с точностью около ± 10%. Одно значение - в результате неоднородного освещения - была отмечена и исключены из оценки.

Рисунок 3 TIRFM изображений U251-MG клетки глиобластомы с активированным TP53 ген-супрессор при инкубации с лаурдана (8 мкМ, 60 мин.) Записаны под разными углами освещения (переменного тока); клетки с субстратом расстояния в диапазоне 0-600 нм показали по цветовой код (г); длины волны возбуждения: 391 нм, обнаружение: ≥ 420 нм, размер изображения:. 210 мкм × 210 мкм Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 4 клетки с субстратом расстояния U251-MG glioblatoma клеток в диапазоне 0-600 нм показали цветового кода;. (А) дикого типа (б) контроля; (с) клеток с активированным геном TP53 супрессоров, (г) клеток с активированным геном PTEN супрессоров; длины волны возбуждения: 391 нм, обнаружение: ≥ 420 нм, размер изображения:. 210 мкм × 210 мкм Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Discussion

Описан метод измерения клетки с субстратом расстояния с нанометровой точностью. В настоящее время методы супер-разрешение микроскопа, например, на основе структурированной подсветки ⁷ или на одну молекулу обнаружения ^8-10, а также вынужденное излучение истощения (STED) микроскопии ¹¹ представляют значительный интерес. Ни один из этих методов, однако, допускает осевое разрешение ниже 50 нм. Кроме того, достаточно высокая освещенность 50100 Вт / см ² необходимо для единой методики молекулы и более 3000 Вт / см ² в течение Стед микроскопии. Это превышает солнечного излучения (около 100 мВт / см ²⁾ на несколько порядков, так что быстрого повреждения живых клеток, вероятно, произойдет. В VA-TIRFM эксперименты, однако, излучение может быть ограничена до менее чем 20 мВт / см ^2, что позволяет выдержки в несколько минут или даже часов без вреда для живой клетки ^12, так что длительные эксперименты с мноКратные экспозиции появятся также возможно. Главные предпосылки для каждого эксперимента хороший угловой калибровки и равномерная освещенность чистых слайдов объекта.

VA-TIRFM может быть применен к многочисленным темам, связанным с технической или биологической поверхности, например, измерения клеточной адгезии на прозрачной подложке. Рост клеток, миграцию клеток или гибели клеток (например, апоптоз), следовательно, могут быть изучена более подробно. В последнее время роль внутриклеточного холестерина на клеточной адгезии было рассмотрено ^4. В частности, выяснилось, что количество клеточного субстрата контактов сократилось на истощение холестерина на 30-50%, в конечном итоге приводит к отряду большего числа клеток от субстрата. Адгезия клеток изучался также при применении фотосенсибилизаторов широко используется в фотодинамической терапии (PDT) рака и других болезней ^13. Выяснилось, что при облучении без фототоксических световых дозах клетки с субстратом расстоянияБыли немного снижается (возможно, из-за некоторого набухания клетки), а фокальные адгезии были сохранены ^4,5. Таким образом, формирование метастазов в связи с PDT не может произойти. Настоящее эксперименты показывают различия клеточной адгезии между опухоли (глиобластомы) и менее злокачественные клетки. Только будущих экспериментов окажется ли это различное поведение может быть использован для диагностики, фармакологических или терапевтических целях.

Следует подчеркнуть, что измерения клетки с субстратом контакты восходят к началу TIRF микроскопии ^14. Угловое разрешение, однако, необходима довольно сложная оборудование ^15, до сих пор, и только развитие компактное устройство освещения для переменным углом TIRFM ³ допускается рутинные измерения клеточного субстрата топологии. В дополнение к этой призмы типа TIRFM, миниатюризация была введена цели типа TIRFM ^16,17, где одно место (или кольцо) близко к краюдиафрагмы плоскости объектива микроскопа горит, так что свет может упасть на образец под углом Θ ≥ Θ _C. Таким образом, высокая апертура объективов позволяет угловом диапазоне около 66-75 ° необходимы. Настройка угла Θ, однако, требует определенного смещения фокуса лазера на расстоянии менее 100 мкм, которые трудно выполнить, даже в коммерческий микроскоп TIRFM. Другим недостатком высокой светосилой (и большом увеличении) объективные линзы вблизи поля анизотропии и довольно ограниченное поле объекта. Таким образом, в сравнении с объективными типа TIRFM экспериментальные установки, как описано в этой рукописи являются предпочтительными для измерения клетки с субстратом топологии.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera