Summary
基板上への細胞接着のトポロジーは、可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で測定されます。
Abstract
表面トポロジー、基板上に成長する細胞の例は 、可変アングル全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で決定されます。細胞は透明なスライド上で培養し、均一にそれらの形質膜に分布する蛍光マーカーと共にインキュベートする。照明はエバネセント電磁界の様々な侵入深さを持つ内部全反射（TIR）の可変角度の下で平行レーザビームによって発生します。約10異なる角度で照射により蛍光画像の記録は、数ナノメートルの精度で細胞 - 基質の距離を計算することを可能にする。種々の細胞株、 例えばがん細胞と少ない悪性細胞との間の密着性の違いは、このように決定されています。また、化学的又は光線力学的治療の際の細胞接着の変化の可能性を調べることができます。超解像顕微鏡光曝露の他の方法と比較して保持されます生きている細胞の非常に小さい、無被害が発生することが予想されています。
Introduction
屈折率n 1の媒質中を伝搬する光ビームが屈折率n 2の第2の媒質へのインターフェースを満たしたときに、<nの1、全反射は、臨界角より大きい発生率Θのすべての角度で発生ΘC =アークサイン（N 2 / N 1）。全く反映されているにもかかわらず、入射光ビームは、I（Z）= I 0 EZ / D（Θ）に従ってインターフェイスから垂直距離zで指数関数的に減衰し、第二の媒体に浸透エバネセント電磁界を彷彿とさせます。で与えられるように私は（z）は、波長λにおける浸透深さに電磁場の強度に対応するとd（Θ）
D（Θ）=（λ/4π）（N 1 2罪Θ2 - N 2）-1 / 2
文献1,2に報告されているように、私は0 eが透過率T（Θ）と比n 2 / nは1で乗算。この光の電場ベクトルが入射面（入射と反射ビームによって張ら平面をIE）に対して垂直に偏光である場合は、この透過率は次式で与えられます。
T（Θ）= 4 cosの2Θ/ [1 - （N 2 / NL 1）2]
TIRFM測定で検出された蛍光強度は、光吸収は、サンプルのすべての層の上に統合されており、検出Ωの立体角と同様に、関連する色素の蛍光量子収率ηと乗算する必要があります。以前に3報告したように、この強度は次のように記述することができます
I F（Θ）=（Θ）OC（z）での電子のz / D（Θ）DZ
もし独立したfはすべての要因蛍光色素の濃度c（z）はほぼ一定であるとみなされた場合ROM入射角Θと座標zは実験定数Aの式（3）内に含まれているが、解析的に解くことができます
-いずれかのすべての座標のz≥Δ、界面からの距離Δを有する細胞の細胞質内に例えばで。この場合、積分はz =Δがために、Z =∞の結果から計算しなければならない
私はF = A C T（Θ）はD（Θ）のe-Δ/ D（Θ）
-インタフェースから距離Δに位置するT / 2とz =Δ+ T / 2、厚さtの薄い層内すなわち 、 例えば細胞膜-またはz =Δの間。この場合、蛍光強度は次のように計算できます
私はF = A C T（Θ）TE-Δ/ D（Θ）は 、
トンはΔに比べて小さい場合。
画像収集と評価が必要では、以前に報告したように3
- サンプルの上に励起光の均一な分布、
- 2層モデルの妥当性（基質と細胞質の屈折率n 1とn 2と、それぞれ）。原形質膜が非常に薄い場合には、保持しており、細胞外培地（セルと基板との間）の層は、入射光の波長に比べて小さい場合。
加えて、適度な開口数（通常≤0.90）顕微鏡対物レンズのは、誘電体の界面近傍界での放射の異方性に起因する輝度のばらつきを避けるために有利である。
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Protocol
1。細胞の播種およびインキュベーション
- シード個々の細胞、 例えば U373-MGまたはU-251-MGの神経膠芽腫細胞をスライドガラス上に100細胞/ mm 2の典型的な密度にする（ 例えば RPMI-1640、10％ウシ胎児血清を添加した培地中で4872時間のためにそれらを育てると抗生物質）で37℃、5％CO 2のインキュベーターを用いた。
- 8μM（培地中の）4、または細胞質マーカーの濃度で60分間適用例 6-ドデカノイル-2 -ジメチルナフタレン（laurdan）、膜マーカーで細胞をインキュベートし、 例えばカルセインacetomethlyesterは、少なくとも40分間印加4,5;5μMの3、または光増感膜関連の濃度は、 例えば、プロトポルフィリンIXは、その前駆体5 -アミノレブリン酸（1mMの5-ALA）を用いて4時間のインキュベーションの際に誘導した。
- 蛍光顕微鏡の前に緩衝生理食塩水（PBS）培地またはリン酸で細胞を洗浄。</ LI>
2。 VA-TIRFM
- 正立顕微鏡、 例えばツァイスAxioplanを使用しており、文献に記載されているように、照明装置によって、そのコンデンサーを交換してください。半球状または光学的にオブジェクトをスライドします （ 図1を参照）に結合された半円筒形のガラスプリズムで3。
- その試料の表面（テレセントリック瞳孔線）上の平行ビームでガラスプリズム、さらに光学部品（ 例えば凹面鏡）による撮影後、再び結果並列コリメートされたレーザービームを使用しています。電場ベクトルが入射面に垂直偏光であるように注意してください。
- 試料面に結像されると発生率（オブジェクトの線）の可変角度で試料に照射されるコンデンサーの内部に位置調整可能なミラーを使用しています。 goniometric測定3によって決定された調整可能なミラーは、それぞれの位置は入射よく定義された角度に対応するステップモータによって駆動することができる
- ΘC = 61.3°ガラス-水移行のための固定値として臨界角を使用して調整可能なミラーの角度位置のキャリブレーションを行います。 Θcは蛍光色素（ 例えば 1mMのフラビンモノヌクレオチド、FMN）を水に溶解させ、Θの変化に応じて可視化することができる。でミラーの位置Θ=ΘCミラー位置決めプログラムに格納されています。
- 温度、ゲイン、録音時間と変速速度を含むカメラのパラメータを指定します（バック点灯アンドールIXON EMCCD、DV887DC、アンドールテクノロジー、ベルファースト、イギリス6）、設定します。
- 適切な倍率と優先的に適度な開口数（ 例えば、40×/ 63×0.75 / 0.90水浸）の対物レンズを使用し、顕微鏡内のオブジェクトのスライドをローカライズします。ガラスプリズムと試料の光学的接触を確実にするためにイマージョンオイルを使用しています。の変動により、同一試料の蛍光画像を記録照明の角度（Θ≥ΘΘCとCセル-ガラス界面のための64.5°に対応）。 0.5°または1°刻みで66°-74°の角度範囲が推奨されます。蛍光検出のための適切なロングパスまたはバンドパス·フィルタを使用します。
3。データ解析
- 様々な角度Θと同様、カメラの設定（背景差別のために）、励起波長とガラス（N 1 = 1.52）と細胞（N 2 = 1.37）に対する屈折率で記録された画像（ 例えば 、ASCIIフォーマットで）読み込む評価プログラム（; NanoCell LabViewの）に挿入します。各パラメータセット浸透深さd（Θ）と透過率のためにTは（Θ）は自動的に計算されます。
- 細胞 - 基質距離Δは式（5）（膜マーカー）または式（4）（細胞質マーカー）によると、不均質を有する個々の画像の評価に使用される画像を選択照明（顕E、G。ストライプ）が除外されることがあります。
- 細胞 - 基質トポロジーの画像を計算して表示するのに適したカラーコードを選択します。 図2に示すように、個々の画素の評価プロファイルの間に、表示させることができます。これらのプロファイルは、フィットの質の指標として用いることができる。
- 評価プロトコルを格納します。
4。代表的な結果
代表的な実験は、親切教授ヤンモレンハウアー、分子腫瘍学専攻、南デンマーク大学、オーデンセによって供給される遺伝子組み換えU251-MGの神経膠芽腫細胞を用いて行われる。それらのU251細胞のサブクローン2腫瘍抑制遺伝子でTP53またはPTENはテトオン誘導性発現系、これらの細胞が減少し腫瘍形成の可能性を発揮し、より少ない悪性とみなすことができること等を用いて過剰発現されています。抑制遺伝子のない高悪性U251-MG細胞を対照として用い、およびU251-アールMGは野生型細胞は、さらに比較のために役立つ。 （;：391 nmで、パルスエネルギー：12 PJ、繰り返し率：波長ドライバーPDL 800-B Picoquant、ベルリン、ドイツでLDH400 40 MHz）をピコ秒光パルスの準連続シリーズを発するレーザダイオードを励起光源として使用されます。
図において、活性化されたTP53腫瘍抑制遺伝子を持つとlaurdan（8μM、60分）と一緒にインキュベートU251-MGの神経膠芽腫細胞の3 TIRFM画像は、66.0°の入射角69.0°、73.0°の侵入深さに対応するために描かれているそれぞれ約140nm、75 nmおよび60 nmのエバネセント電磁界。侵入深さの蛍光の減少に伴って強度が低下（スケールを参照）、細胞のより表面的な部位（その辺で例えばフォーカルコンタクト）に由来する。細胞-基質間距離（0から600 nmの範囲のカラーコードによって図3dで可視化）に強く間のセルにわたって変化LY数ナノメートル（白黄色）と250から300ナノメートル（暗赤色）、 すなわち焦点連絡先やより大きなセル基板の距離はすぐ近くにあります。細胞-基質距離はU251-MG制御と80から100ナノメートル（黄色の典型的な値を持つ野生型細胞のためではなく、一定である同じことが、活性化抑制遺伝子PTEN（ 図4d）とU251-MGの神経膠芽腫細胞のために保持します。 図4b ）と150から200ナノメートル（橙赤色、 図4a）。
図1：正立顕微鏡のVA-TIRFM用の照明装置。ステップモータにより駆動される調整可能なミラーが±0.25°の角度分解能を可能にします。
1つのPIXについては、 図2。評価プロファイルEL（図）。 LN [I、F / Tは（Θ）] 1 / D（Θ）の関数としてプロットすると、傾きは、細胞-基質距離Δを表しています。このスロープは、一般的に±10％程度の精度で決定されます。つの値が - 不均一な照明に起因する - のマークが付けられ、評価から除外されました。
照明の様々な角度（AC）で記録され、示されて0から600 nmの範囲で細胞-基質間の距離。laurdan（60分8μM）とのインキュベーションにより活性TP53抑制遺伝子とU251-MGの神経膠芽腫細胞の図3 TIRFM画像カラーコードにより、（d）は、励起波長：391 nmで検出：≥420 nmで、画像サイズ：210×210μmのμmの拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4に、カラーコードで示さ0から600 nmの範囲でU251-MGのglioblatoma細胞の細胞-基質間距離;（a）は野生型（b）管理;活性化抑制遺伝子TP53と（c）の細胞と、（d）活性化抑制遺伝子PTENと細胞;励起波長：391 nmで検出：≥420 nmで、画像サイズ：210×210μmのμmの拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
メソッドは、ナノメートルの精度で細胞 - 基質間の距離を測定するために記述されている。現在、 例えば構造化照明7または単一分子検出8-10と同様に誘導放出の枯渇に基づく超解像顕微鏡の方法、（STED）顕微鏡11は、かなりの関心が持たれている。これらの技術はいずれも、しかし、50 nm以下の軸方向の分解能を可能にしていません。また、50100 W / cm 2のかなり高い放射照度は、単一分子方法とSTED顕微鏡のために3,000人以上のW / cm 2のために必要とされる。これは桁違いに太陽放射照度（約100mW / cm 2）を超えて、生きた細胞になるように急速な損傷が発生する可能性があります。 VA-TIRFM実験では、しかし、放射照度は、セル12、生体に害なしで数分または数時間の露光時間を可能にして、20未満のMW / cm 2に限定することができるように、MULとの長期的な実験tipleエクスポージャーが十分に可能に表示されます。各実験のための主要な前提条件は良い角度校正およびクリーンなオブジェクトスライドの均質な照明です。
VA-TIRFMは、技術的または生物学的表面、透明基板への細胞接着の例測定に関連する数多くのトピックに適用することができる。細胞増殖、細胞遊走や細胞死（ 例えばアポトーシス）、従って、より詳細に検討することができる。最近では、細胞接着に対する細胞内コレステロールの役割は4を検討した。特に、それは、細胞 - 基質接点の数が最終的にそれらの基板からの細胞の多くの剥離につながる、3050パーセントによってコレステロールの枯渇により減少したことが判明した。細胞接着はまた、一般的にがんや他の病気の13光線力学療法（PDT）で使用される光増感剤の適用時に検討した。それが判明し、非光毒性、光の用量細胞 - 基質間距離の照射により接着斑が4,5維持しながらわずかに、（おそらくセルのいくつかの腫れが原因で）減少した。したがって、PDTに起因する転移の形成は、発生する可能性はありませんでした。本実験では、腫瘍（神経膠芽腫）と少ない悪性細胞間の細胞接着の違いを示しています。唯一将来の実験は、この異なる挙動は、診断薬理学的または治療用途に使用できるかどうかを証明します。
それは、細胞-基質接触の測定がTIRF顕微鏡14の初めに遡ることが強調されるべきである。角度分解能は、しかし、これまでのところ、15ではなく、複雑な装置を必要とし、細胞-基質トポロジーの可変角度TIRFM 3許可ルーチン測定のためのコンパクトな照明装置の開発のみ。このプリズム型TIRFMに加えて、小型化は単一のスポット（またはアニュラスが）のエッジに近い客観型TIRFM 16,17によって導入されました顕微鏡対物レンズの開口面が点灯しているので、光がある角度で試料上に落ちるかもしれΘ≥Θ℃。したがって、約66から75°の角度範囲を許容高開口数対物レンズが必要とされている。角度Θのチューニングは、しかし、たとえ商業化TIRFM顕微鏡で、行うことが困難である100μm未満の距離内にレーザー焦点の定義されたシフトを必要とします。高開口（および高倍率）対物レンズのさらなる欠点は、フィールドの異方性とかなり限られたオブジェクトフィールドの近くにあります。したがって、本稿で説明したように客観的な型TIRFM実験装置と比較して、細胞 - 基質トポロジーを測定するための好ましい。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、土地、バーデン·ヴュルテンベルク州とアオイ連合ユーロぺフォンエリーゼのためダイエオリエEntwicklungに感謝-資金ZAFH光子N、無資金研究助成金のためにエリーゼのためBundesministerium Bildung undのForschung（BMBF）のために。 1792C08ならびにプロジェクト "Auramiを"資金調達のためのバーデン·ヴュルテンベルク·財団社。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA |
|
| Laminar flow | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
| DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin | BIOCHROM | Cultivation medium | |
| Glass object slides | Marienfeld | Pure white glass | Special cleaning procedure used |
| 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) | Molecular Probes | Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol) | |
| Microscope | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
| Laser diode | PicoQuant | LDH 400 with driver PDL 800-B | Wavelength: 391 nm |
| Single mode fiber system | Point Source | kineFlex | Used with collimating optics |
| EMCCD camera | Andor | DV887DC | Back illuminated camera |
References
- Gingell, D., Todd, I. Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement. Biophys. J. 26, 507-526 (1979).
- Reichert, W. M., Truskey, G. A. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence. J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).
- Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device. J. Microsc. 211, 19-29 (2003).
- Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields. Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).
- Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM). J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).
- Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution. J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).
- Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).
- Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. STED microscopy with continuous wave beams. Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).
- Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells. J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).
- Dougherty, T. J. Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours. Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).
- Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Schneckenburger, H. Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).
