Nanotopology细胞粘附在可变角度的全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）

Summary

细胞粘附在基板上的拓扑结构是由可变角度的总内部反射荧光显微镜（VA-TIRFM）与纳米精度测量。

Abstract

表面的拓扑结构， 例如，在衬底上生长的细胞中，确定由可变角度总内部反射荧光显微镜（VA-TIRFM）与纳米精度。将细胞培养在透明的幻灯片，并与荧光标记物均匀地分布在它们的细胞膜中孵育。照明发生由一个平行的激光束根据变量的总内部反射（TIR）的角度，用不同的穿透深度的瞬态电磁场。荧光图像后，在约10个不同的角度照射的记录允许，计算细胞衬底的距离的精度为几纳米。这样确定的各种细胞株， 例如，肿瘤细胞和恶性细胞少，密合性的差异。此外，可能发生的变化时的细胞粘附化学或光动力治疗可以进行检查。与其他方法相比，超分辨率显微镜的光照射保持活细胞的非常小，并且没有损坏预期发生。

Introduction

当光束传播通过的介质的折射率n _1，满足的第二介质的折射率n ₂ <n _1的一个接口，全内反射发生的所有角度，这是大于临界角的入射角_ΘΘ=反正弦（N ₂ / N _1）。尽管被全反射入射光束的唤起的瞬态电磁场，渗入所述第二介质和呈指数衰减，与从界面的垂直距离z根据I = I _0（z）的^{_{易通/天（Θ）。}} I（z）的对应的电磁场和d（Θ）的强度，所给出的在波长λ的穿透深度

_{D（θ）=（λ/4π）（1} ²罪^2Θ - N ^{_{2 2）-1} / 2}

据报道在文献^1,2中 _，I（0） 站 |电子乘以传输系数T（Θ），比n ₂ / n _1个与入射光的强度相对应。如果该光束的电场矢量的偏振垂直于入射平面的（ 即所跨越的入射和反射光束的平面），该传输系数由下式给出

T（Θ）= 4余弦^2Θ/ [1 - （n _2个 / nL的_^1）2]

对于检测到的荧光强度在TIRFM测量中，光吸收具有集成的样品的所有层和乘以有关染料的荧光量子收率η，以及检测与立体角Ω。正如以前报道的^3，这种强度可以通过以下进行说明

我_F（Θ）= ^{AT（Θ）OC（Z）E-Z / D（Θ）DZ}

如果所有这些因素是独立的f的ROM的入射角Θ和坐标z均包括在实验常数A.等式3可以解析解，如果荧光基团的浓度c（z）的被认为是几乎恒定的

-或者， 例如 ，在所有坐标Z≥Δ的细胞质内的细胞，从该接口具有的距离Δ。在这种情况下，积分计算从z =Δ到z =∞导致

_I F = A C ^{T（Θ）D（Θ）E-Δ/ D（Θ）}

-或之间的Z =Δ -吨/ 2和z =Δ+ t / 2只， 即一层薄薄的厚度t内， 例如位于从界面的距离Δ的细胞膜。在这种情况下，可以计算出的荧光强度为

_I F =是C ^{T（Θ）TE-Δ/ D（Θ）}

如果tΔ比较小。

耳鼻喉科“>从方程（4）和（5）细胞-基底距离Δ，如果可以计算出的荧光强度_I F的图像被记录为可变角度Θ，如果_In（I F / T d的）（公式4）或ln（I _F / T）（公式5）被评价为1次/ d的函数的这些角度，对于本文中所用的膜标记laurdan（第下文）根据公式5进行评价。

正如以前报道的^3，图像采集和评估要求
- 在样本激发光的均匀分布的，
-有效性的2层模型（与折光率n ₁和n _2分别为在基板和细胞质，分别）。这认为，如果等离子体膜是非常薄的，如果在细胞外介质中的层（细胞和衬底之间）与入射光的波长相比是很小的。

此外，温和的数值孔径（通常为A≤0.90）的显微镜物镜是有利的，以避免由于辐射的各向异性，在近场中的电介质界面亮度偏差。

Protocol

1。播种和培养细胞

1. 种单个细胞， 例如 U373-MG或U-251-MG的成胶质细胞瘤细 ​​胞在一个典型的密度为100个细胞/ mm ^2的载玻片上，并成长为4872小时，在培养基中（ 例如与10％胎牛血清的RPMI 1640培养基和抗生素）使用的培养箱，在37℃和5％CO _2的 。
2. 孵育细胞的膜标记物， 例如 6-十二烷酰基-2-二甲基氨基萘（laurdan）60分钟施加在8μM（培养液中^）4，或细胞质标记的浓度， 例如：钙黄绿素acetomethlyester申请在40分钟浓度为^5μM3，或相关联的膜光敏剂， 例如，原卟啉IX诱导后，培养4小时，其前体5 -氨基乙酰丙酸（5-ALA，1毫摩尔^）4,5。
3. 洗涤细胞用培养基或磷酸盐缓冲盐水（PBS）在荧光显微镜之前</ P>

2。 VA-TIRFM

1. 使用一个直立的的显微镜， 例如蔡司Axioplan，并更换冷凝器的照明设备，按文献。 3具有半球形或半圆筒状的玻璃棱镜光学耦合到的对象滑动（参见图1）。
2. 使用的平行准直的激光束成像后的玻璃棱镜和进一步的光学元件（ 例如凹面镜）再次结果的样品的表面上的平行光束（远心光瞳射线）。照顾，电场矢量垂直于入射平面的被极化。
3. 使用可调节的反射镜，位于成像的样品平面中，并按照可变入射角（对象射线）照亮样品内部的冷凝器。可调反射镜可以由步进电机驱动的，其中每个位置对应于一个良好定义的入射角，测角测量³所确定的
4. 校准可调反射镜的角位置，使用临界角_Θ= 61.3°的玻璃水转变为一个固定的值。 _Θc可以是可视化后，溶解于水中时的荧光染料（ 例如，1 mM的黄素单核苷酸，FMN）Θ的变化。镜子的位置在_Θ=Θc被存储在镜定位程序。
5. 设置的摄像头（背照式EMCCD安道尔IXON，DV887DC，ANDOR科技，贝尔法斯特，英国^6）参数，包括温度，增益，记录时间和换挡速度。
6. 使用适当的倍率的物镜和优先温和的数值孔径（ 例如 40×/ 0.75，或63×/ 0.90水浸泡）和本地化的对象在显微镜滑动。使用浸油，以保证样品与玻璃棱镜的光学接触。变化的记录时相同的样品的荧光图像照明角度_（Θ≥Θc与_θC对应于64.5°的小区-玻璃界面）。建议为0.5°或1°66°-74°的角度范围内的步骤。使用适当的长通或带通滤波器，用于荧光检测。

3。数据分析

1. 阅读的图像（ 例如以ASCII格式）记录在不同的角度Θ，以及相机设置（背景歧视），激发波长和对玻璃的折射率（n _1个 = 1.52）和细胞（n _2个 = 1.37）到评估程序（LabView的纳米单元）。对于每组参数的渗透深度d（Θ），透射系数T（Θ）的自动计算。
2. 选择用于评价细胞 - 基底距离Δ根据等式5（膜标记）或公式4（细胞质标记），个人的图像不均匀的图像照明（揭示E，G条纹）可能会被排除在外。
3. 计算图像的的细胞基质拓扑结构，选择适当的颜色代码显示。期间可以被显示，如在图2中所示的各个像素的评价公司。作为拟合的质量的指标，可以使用这些配置文件。
4. 存储的评价协议。

4。代表性的成果

与基因工程U251-MG胶质母细胞瘤细胞的1月莫伦豪尔，分子肿瘤学系教授，南丹麦大学，欧登塞提供的代表进行了实验。在两个亚克隆那些U251细胞的肿瘤抑制基因TP53或PTEN过度表达用的Tet-诱导的表达系统，例如，这些细胞显示出降低的致瘤性，并可能被视为恶性程度较低。高度恶性的U251-MG的抑制基因细胞，而不被用作对照，和U251-MG野生型细胞用于进一步比较。发射准连续系列的皮秒脉冲（LDH400与驱动程序PDL 800-B，Picoquant，柏林，德国，波长：391纳米，脉冲能量：12 PJ;重复率：40兆赫）的激光二极管作为激发源使用。

在图3中TIRFM U251-MG与活化的TP53抑癌基因和与laurdan（8μM，60分钟）温育的成胶质细胞瘤细 ​​胞的图像的图6-3描述了入射角为66.0°，69.0°和73.0°的穿透深度相应于瞬态电磁场为约140 nm，75 nm和60 nm处，分别随着降低穿透深度荧光强度减小（见尺度）和来源于更为肤浅的站点的细胞（ 例如，它们的边缘上的接触斑）。电池基片的距离（ 图三维可视化的范围从0到600纳米的颜色代码）强烈变化的细胞之间的上LY几个纳米（白色，黄色）和250-300纳米（暗红色）， 即接触斑和更大的电池基片的距离都在酒店附近。这同样适用于U251-MG的成胶质细胞瘤细 ​​胞活化的抑制基因PTEN（ 图4d），而细胞-基底距离U251-MG的控制和野生型细胞与约80-100 nm的典型值（黄色， 图4b是相当恒定的）和150-200纳米（橙红色; 图4a）。

图1。VA-TIRFM在直立显微镜的照明装置。由步进电动机驱动的可调节的反射镜允许±0.25°的角分辨率。

图2。评价一个像素的档案EL（示意图）。当LN _[ⅠF / T（Θ）]作为1次/ d（Θ）的函数作图，斜率表示细胞衬底距离Δ。此斜率通常测定的精度为±10％左右。从评估的价值之一 - 产生不均匀的亮度 - 已标记和排除。

图3。TIRFM技术的图片，U251-MG的成胶质细胞瘤细 ​​胞与活化TP53孵育laurdan（8μM，60分钟）记录在不同的照明角度（交流）时抑制基因;所示细胞基板在0-600纳米的范围内的距离通过颜色代码（D）;激发波长为391纳米，检测：≥420 nm的图像尺寸：210微米×210微米。 点击此处查看大图 。

（四） 图4。细胞基底的距离的U251-MG glioblatoma的细胞在0-600纳米的范围内显示由一个彩色码（一）野生型（b）控制;（三）细胞活化的抑制基因TP53;细胞激活抑癌基因PTEN，激发波长为391纳米，检测：≥420纳米，图像大小：210微米×210微米。 点击此处查看大图 。

Discussion

描述了一种方法，用于测量细胞衬底与纳米精度的距离。目前，超高分辨率显微镜的方法， 例如 ，基于结构照明⁷或单分子检测^8-10以及受激发射损耗（STED）显微镜是相当大的兴趣。然而，没有这些技术允许的轴向分辨率低于50nm。此外，需要相当高的为50100 W / cm ²的辐照度为单分子的方法和超过3000瓦/厘米²的受激发射损耗显微镜。这超过太阳辐照度（约100毫瓦/厘米^2）由几个数量级，使之迅速对活细胞的伤害是可能发生的。然而，在VA-TIRFM实验，辐照度可以被限制到小于20 mW / cm ^2的 ，允许几个几分钟甚至几小时的曝光时间没有任何伤害的活细胞^12，所以，持久的实验与MULtiple风险出现的可能。每个实验的主要先决条件是良好的的角校准和均匀照明的清洁对象的幻灯片。

VA-TIRFM技术可施加到相关的技术或生物的表面， 例如测量细胞粘附到透明基板的许多主题。细胞生长，细胞迁移或细胞死亡（ 如细胞凋亡），因此，进行研究更详细。最近，细胞内胆固醇的作用，对细胞粘附检查^4。特别是，它，细胞衬底接点的数目减少胆固醇耗竭后3050％，最后导致的一个更大的数目从它们的底物的细胞的剥离。细胞粘附光敏剂在光动力疗法（PDT），癌症和其他疾病的¹³常用应用后也进行了研究。原来，在辐照与非光敏性光剂量细胞基质的距离略有降低（这可能是由于在一定的细胞肿胀），而保持粘着斑^4,5。因此，形成的转移因于PDT不太可能发生。本实验显示细胞粘附瘤（胶质母细胞瘤）和恶性程度较低的细胞之间的差异。只有未来的实验将证明此不同的行为是否可用于诊断，药理或治疗中的应用。

应当强调的是，测量细胞衬底接点追溯到TIRF显微镜¹⁴的开头。的角分辨率，然而，需要相当复杂的设备^15，到目前为止，只发展一个紧凑的照明装置，用于可变角TIRFM技术³许可例行测量细胞基板拓扑。在除了该棱镜型TIRFM技术，小型化介绍了客观型TIRFM技术^16,17，其中一个单一的点（或环）接近的边缘被照亮的显微镜物镜的开口面的，使得光可能落到样品根据一个角度_Θ≥ΘC。因此，高孔径物镜允许约66-75°的角度范围内是必要的。调谐的角度Θ，但是，需要的激光焦点的距离小于100微米，这是难以执行，即使在一个商业化的运用TIRFM显微镜内定义的移位。高光圈（高倍率）物镜处于更加不利的是近场各向异性和相当有限的对象字段。因此，在比较与客观型的TIRFM实验设置本稿件为测量细胞基质拓扑结构是最好的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera