Summary
Topologie de l'adhésion cellulaire sur un substrat est mesurée avec une précision nanométrique par microscopie à angle variable fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM).
Abstract
Topologie de surface, par exemple des cellules en croissance sur un substrat, est déterminée avec une précision nanométrique à angle variable par microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM). Les cellules sont cultivées sur des lames transparentes, et mis en incubation avec un marqueur fluorescent réparti de façon homogène dans la membrane plasmique. Illumination se produit par un faisceau laser parallèle sous des angles variables de réflexion interne totale (TIR) à différentes profondeurs de pénétration du champ électromagnétique évanescent. L'enregistrement des images de fluorescence lors d'une irradiation à environ 10 sous différents angles permet de calculer les distances cellule-substrat avec une précision de quelques nanomètres. Les différences d'adhérence entre différentes lignées cellulaires, les cellules cancéreuses et les cellules par exemple moins malignes, sont ainsi déterminés. En outre, les changements possibles de l'adhésion cellulaire sur un traitement chimique ou photodynamique peut être examiné. En comparaison avec d'autres méthodes de super-résolution exposition à la lumière microscope est maintenudes dommages très petite, et pas de cellules vivantes devrait avoir lieu.
Introduction
Lorsqu'un faisceau lumineux se propageant à travers un milieu d'indice de réfraction n 1 répond à une interface avec un second milieu d'indice de réfraction n 2 <n 1, la réflexion totale interne se produit à tous les angles d'incidence Θ, qui sont plus grand que l'angle critique Θ = c arcsin (n 2 / n 1). Tout en étant totalement réfléchie du faisceau lumineux incident évoque un champ électromagnétique évanescent qui pénètre dans le second milieu, et décroît exponentiellement avec la distance perpendiculaire à partir de l'interface z selon I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) correspond à l'intensité du champ électromagnétique et d (Θ) de la profondeur de pénétration de longueur d'onde λ, telle que donnée par
d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2
Comme indiqué dans la littérature 1,2, I 0 e multiplié par le facteur de transmission T (Θ) et le rapport n 2 / n 1. Si le vecteur de champ électrique de ce faisceau de lumière est polarisée perpendiculairement au plan d'incidence (c'est à dire le plan défini par l'incident et le faisceau réfléchi), ce facteur de transmission est donnée par
T (Θ) = 4 cos Θ 2 / [1 - (n 2 / nL 1) 2]
Pour l'intensité de fluorescence détectée à des mesures TIRFM, absorption de la lumière doit être intégrée sur toutes les couches de l'échantillon et multiplié par le rendement quantique de fluorescence du colorant η pertinent ainsi que de l'angle solide de détection de Ω. Comme indiqué précédemment 3, cette intensité peut être décrite par
I F (Θ) = A (Θ) OC (z) e-z / j (Θ) dz
si tous les facteurs qui sont indépendants f rom l'angle d'incidence Θ et la coordonnée z sont inclus dans l'équation A. constante expérimentale 3 peut être résolu analytiquement, si la concentration (z) c de fluorophores est considéré comme à peu près constante
- Soit à toutes les coordonnées z ≥ Δ, par exemple, dans le cytoplasme des cellules ayant un Δ la distance de l'interface. Dans ce cas, l'intégrale doit être calculée à partir de z = Δ z = ∞ entraînant
I F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / j (Θ)
- Ou entre z = Δ - t / 2 et z = Δ + t / 2, c'est à dire à l'intérieur d'une couche mince d'épaisseur t, par exemple, une membrane de la cellule située à une distance à partir de l'interface de Δ. Dans ce cas, l'intensité de la fluorescence peut être calculé comme
I F = A c T (Θ) te-Δ / j (Θ),
si t est faible par rapport à Δ.
Comme indiqué précédemment 3 d'acquisition d'images, et de l'évaluation nécessite
- Une répartition homogène de la lumière d'excitation sur l'échantillon,
- La validité d'un modèle de couche 2-(avec les indices de réfraction n 1 et n 2 pour le substrat et le cytoplasme, respectivement). Il en est, si la membrane plasmique est très mince, et si la couche du milieu extracellulaire (entre la cellule et le substrat) est faible par rapport à la longueur d'onde de la lumière incidente.
En outre, une ouverture modérée numérique(Typiquement 0,90 ≤ A) de l'objectif de microscope est avantageux d'éviter les écarts de luminosité dues à l'anisotropie du rayonnement dans le champ proche de l'interface diélectrique.
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Protocol
1. Ensemencement et incubation des cellules
- Cellules individuelles de semences, par exemple U373-MG ou des cellules de glioblastome U-251-MG à une densité typique de 100 cellules / mm 2 sur une lame de verre et les cultiver pour 4872 heures en milieu de culture (par exemple RPMI 1640 supplémenté avec 10% sérum de veau foetal et des antibiotiques) à l'aide d'un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Incuber les cellules avec un marqueur membranaire, par exemple 6-dodécanoyl-2-diméthylamino naphtalène (Laurdan) appliqué pendant 60 minutes à une concentration de 8 pM (dans un milieu de culture) 4, ou un marqueur cytoplasmique, par exemple calcéine acetomethlyester appliqué pendant 40 minutes à une concentration de 5 pM 3, ou un photosensibilisateur associé à la membrane, par exemple lors de la protoporphyrine IX induite 4 heures d'incubation avec son précurseur acide 5-aminolévulinique (5-ALA; 1 mM) 4,5.
- Laver les cellules avec du milieu de culture ou du tampon phosphate salin (PBS) avant la microscopie de fluorescence. </ Li>
2. VA-TIRFM
- Utiliser un microscope droit, par exemple Zeiss Axioplan, et remplacer le condensateur par un dispositif d'éclairage, tel que décrit dans la référence. 3 avec un hémi-sphérique ou un prisme de verre semi-cylindrique couplé optiquement à la porte-objet (voir figure 1).
- Utiliser un faisceau laser collimaté parallèle qui, après formation d'image par le prisme de verre et d'autres composants optiques (par exemple un miroir concave) à nouveau les résultats en un faisceau parallèle à la surface de l'échantillon (rayons pupille télécentrique). Veiller à ce que le vecteur de champ électrique est polarisée perpendiculairement au plan d'incidence.
- Utiliser un miroir ajustable à l'intérieur du condenseur qui forme une image dans le plan d'échantillon et illumine l'échantillon sous un angle d'incidence variable (rayon d'objet). Le miroir réglable peut être entraîné par un moteur pas à pas, où chaque position correspond à un angle d'incidence bien définie, telle que déterminée par des mesures goniométriques 3
- Étalonnage de la position angulaire du miroir réglable à l'aide de l'angle critique Θ = 61,3 ° C pour une transition de verre de l'eau en tant que valeur fixe. Θ c peuvent être visualisées sur la variation de Θ quand un colorant fluorescent (par exemple 1 mM flavine mononucléotide, FMN) est dissous dans de l'eau. La position du miroir à Θ = Θ c est stocké dans le programme de positionnement de miroir.
- Définissez les paramètres de la caméra (rétro-éclairé Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR technologie, Belfast, Royaume-Uni 6), dont la température, le gain de temps d'enregistrement, et la vitesse de déplacement.
- Utilisez un objectif de grossissement approprié et de préférence modérée ouverture numérique (par exemple 40 × / 0,75 ou 63 × / 0,90 immersion dans l'eau) et de localiser le porte-objet du microscope. Utiliser de l'huile d'immersion pour assurer un contact optique de l'échantillon avec le prisme de verre. Enregistrer des images de fluorescence des échantillons identiques lors de la variation de laangle d'éclairage (Θ ≥ Θ Θ c avec c, correspondant à 64,5 ° pour une interface cellule-verre). Une plage angulaire de 66 ° -74 ° par pas de 0,5 ° ou 1 ° est recommandé. Utilisez un laissez-passer approprié à long ou un filtre passe-bande pour la détection de la fluorescence.
3. Analyse des données
- Lire les images (par exemple au format ASCII) enregistrées à différents angles Θ, ainsi que les paramètres de l'appareil (pour la discrimination de fond), la longueur d'onde d'excitation et les indices de réfraction du verre (n 1 = 1,52) et des cellules (n = 2 1,37) dans le programme d'évaluation (LabView; NanoCell). Pour chaque ensemble de paramètres de la profondeur de pénétration d (Θ) et le facteur de transmission T (Θ) sont calculées automatiquement.
- Sélectionnez les images utilisées pour l'évaluation de la cellule-substrat distances Δ selon l'équation 5 (marqueur membranaire) ou l'équation 4 (marqueur cytoplasme), les images individuelles avec inhomogèneéclairage (e révélatrice, rayures g.) peuvent être exclues.
- Calculer des images de cellules-substrat topologie et sélectionnez un code de couleur approprié pour l'affichage. Pendant des profils d'évaluation de pixels individuels peuvent être affichés, comme le montre la figure 2. Ces profils peuvent être utilisées comme indicateur de la qualité de l'ajustement.
- Rangez le protocole d'évaluation.
4. Les résultats représentatifs
Expériences représentatives sont réalisés avec des cellules génétiquement modifiées glioblastome U251-MG aimablement fournis par le professeur Jan Mollenhauer, Département de moléculaire en oncologie, Université du Sud du Danemark, Odense. Dans ces deux sous-clones de cellules U251 les gènes suppresseurs de tumeur TP53 ou PTEN sont surexprimés en utilisant un système Tet-On expression inductible, de sorte que ces cellules présentent un potentiel tumorigène réduite et peut être considéré comme moins malin. Très malignes U251-MG cellules sans gène suppresseur sont utilisés comme témoins, et U251-MG cellules de type sauvage servir pour une autre comparaison. Une diode laser émettant une série quasi continu d'impulsions picosecondes (LDH400 avec chauffeur PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Allemagne, longueur d'onde: 391 nm; impulsion d'énergie: 12 pJ; taux de redoublement: 40 MHz) est utilisée comme une source d'excitation.
La figure 3 images de TIRFM U251 MG-cellules de glioblastome avec un actif gène suppresseur de tumeur TP53 et incubées avec Laurdan (8 um; 60 min) sont représentées pour des angles d'incidence de 66,0 °, 69,0 ° et 73,0 ° correspondant à des profondeurs de pénétration de l' champ électromagnétique évanescent d'environ 140 nm, 75 nm et 60 nm, respectivement. Avec la diminution de la fluorescence diminue la profondeur de pénétration de l'intensité (voir écailles) et provient de plus d'un des sites superficiels des cellules (par exemple les contacts correspondants sur leurs bords). Cellule-substrat distances (visualisée dans 3d figure par un code couleur allant de 0 à 600 nm) varient fortement sur les cellules entre lely quelques nanomètres (blanc-jaune) et 250-300 nm (rouge foncé), des contacts focaux et les grands c.-à-cellule-substrat distances sont situés à proximité. La même chose vaut pour U251-MG cellules de glioblastome avec un actif gène suppresseur PTEN (figure 4d), tandis que la cellule-substrat distances sont assez constants pour U251-MG contrôle et de cellules de type sauvage avec des valeurs typiques de 80-100 nm (jaune, figure 4b ) et 150-200 nm (rouge-orange; figure 4a).
Figure 1. Dispositif d'éclairage pour VA-TIRFM dans un microscope droit. Un miroir réglable entraînée par un moteur pas à pas permet une résolution angulaire de ± 0,25 °.
Le profil d'évaluation Figure 2. Pour un pixel (schéma). Lorsque ln [I F / T (Θ)] est représentée en fonction de 1 / d (Θ), la pente représente la distance Δ substrat cellulaire. Cette pente est généralement déterminée avec une précision de l'ordre de ± 10%. Une valeur - résultant de l'illumination homogène - a été marqué et exclus de l'évaluation.
Figure 3 images TIRFM de U251-MG cellules de glioblastome avec activées TP53 gène suppresseur par incubation avec Laurdan (8 uM; 60 min). Enregistrées à différents angles d'éclairage (ac); cellule-substrat distances de l'ordre de 0-600 nm montré par un code couleur (d); longueur d'onde d'excitation: 391 nm, détection: ≥ 420 nm; taille de l'image.: 210 um um × 210 Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4 cellules-substrat distances U251-MG cellules glioblatoma dans la gamme de 0-600 nm indiquées par un code couleur;. (A) de type sauvage (b) les contrôles; (c) les cellules avec un gène suppresseur activé TP53; (d) cellules avec PTEN suppresseur gène activé, longueur d'onde d'excitation: 391 nm, détection: ≥ 420 nm; taille de l'image.: 210 um um × 210 Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
On décrit une méthode de mesure de la cellule-substrat distances avec une précision nanométrique. À l'heure actuelle, les méthodes de microscopie de super-résolution, fondée par exemple sur l'éclairage structuré 7 ou sur simple 8-10 de détection des molécules ainsi que l'appauvrissement de l'émission stimulée (STED) microscopie à 11 sont d'un intérêt considérable. Aucune de ces techniques, cependant, permet une résolution axiale inférieure à 50 nm. En outre, l'irradiance assez élevé de 50 100 W / cm 2 est nécessaire pour les méthodes de molécules uniques et plus de 3.000 W / cm 2 pour la microscopie STED. Cela dépasse l'irradiance solaire (environ 100 mW / cm 2) par plusieurs ordres de grandeur, de sorte que les dommages aux cellules vivantes rapide est susceptible de se produire. Dans VA-TIRFM expériences, cependant, l'irradiance peut être limitée à moins de 20 mW / cm 2, ce qui permet des temps d'exposition de plusieurs minutes, voire quelques heures, sans aucun dommage pour les cellules vivantes 12, de sorte que les expériences de longue durée avec mulsieurs expositions semblent bien possible. Principales conditions préalables pour chaque expérience sont bonnes calibration angulaire et un éclairage homogène de diapositives objets propres.
VA-TIRFM peut être appliqué à de nombreux sujets liés à des surfaces techniques ou biologiques, par exemple des mesures d'adhérence des cellules à un substrat transparent. La croissance cellulaire, la migration cellulaire ou la mort cellulaire (apoptose par exemple) peut donc être étudié plus en détail. Récemment, le rôle du cholestérol intracellulaire sur l'adhésion cellulaire a été examiné 4. En particulier, il s'est avéré que le nombre de cellules-substrat contacts a été réduit lors de l'épuisement du cholestérol par 3050%, conduisant finalement à un détachement d'un plus grand nombre de cellules de leur substrat. L'adhésion cellulaire a également été étudié à la demande de photosensibilisateurs couramment utilisés en thérapie photodynamique (PDT) de cancer et d'autres maladies 13. Il s'est avéré que lors d'une irradiation avec des doses lumineuses non phototoxiques cellule-substrat distancesont légèrement diminué (peut-être due à un gonflement de la cellule), tandis que les adhésions focales ont été maintenus 4,5. Par conséquent, la formation de métastases en raison de HAP n'était pas susceptible de se produire. Expériences actuelles montrent des différences de l'adhésion cellulaire entre la tumeur (glioblastome) et les cellules malignes moins. Seuls les futures expériences prouvera si ce comportement différent peut être utilisé pour des applications diagnostiques, pharmacologiques ou thérapeutiques.
Il convient de souligner que les mesures de la cellule-substrat contacts remontent au début de la microscopie TIRF 14. Résolution angulaire, cependant, besoin d'équipement assez complexe 15, à ce jour, et que le développement d'un dispositif d'éclairage compact pour angle variable TIRFM 3 mesures de routine permis de cellule-substrat topologie. En plus de cette TIRFM prisme de type, la miniaturisation a été introduite par l'objectif de type TIRFM 16,17, où un seul point (ou anneau) à proximité du bord dele plan d'ouverture de l'objectif de microscope est éclairée, de sorte que la lumière peut tomber sur l'échantillon sous un angle Θ ≥ Θ C. Par conséquent, lentilles d'objectif de haute ouverture permettant une plage angulaire d'environ 66-75 ° sont nécessaires. Réglage de l'angle Θ, cependant, exige un changement défini de la focalisation du laser à une distance de moins de 100 um, ce qui est difficile à réaliser, même dans un microscope TIRFM commercialisé. D'autres inconvénients de grande ouverture (et fort grossissement) lentilles de l'objectif sont anisotropie en champ proche et champs de l'objet plutôt limitées. Par conséquent, en comparaison avec des configurations TIRFM objectif de type expérimentales telles que décrites dans ce manuscrit sont préférables pour la cellule de mesure-substrat topologie.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Land de Bade-Wurtemberg et la Europäische Union Europäischer Fonds regionale Entwicklung für die - pour le financement ZAFH-PHOTON n, le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) pour la recherche des subventions non. 1792C08 ainsi que la GmbH Baden-Württemberg-Stiftung pour le financement du projet "Aurami".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA |
|
| Laminar flow | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
| DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin | BIOCHROM | Cultivation medium | |
| Glass object slides | Marienfeld | Pure white glass | Special cleaning procedure used |
| 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) | Molecular Probes | Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol) | |
| Microscope | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
| Laser diode | PicoQuant | LDH 400 with driver PDL 800-B | Wavelength: 391 nm |
| Single mode fiber system | Point Source | kineFlex | Used with collimating optics |
| EMCCD camera | Andor | DV887DC | Back illuminated camera |
References
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