Nanotopology av celleadhesjon på Variable-Angle Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM)

Summary

Topologien av celleadhesjon på et substrat måles med nanometer presisjon av variabel vinkel total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (VA-TIRFM).

Abstract

Overflaten topologien, f.eks av celler som vokser på et substrat, blir bestemt med nanometerpresisjon etter variabel vinkel total innvendig refleksjon fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM). Celler dyrkes på transparente lysbilder og inkubert med en fluorescerende markør homogent fordelt i deres plasmamembranen. Belysning skjer ved en parallell laserstråle under varierende vinkler av total innvendig refleksjon (TIR) ​​med ulike inntrengningsdybdene av den flyktige elektromagnetisk felt. Opptak av fluorescens bilder ved bestråling på ca 10 forskjellige vinkler tillater å beregne celle-substrat avstander med en presisjon på noen få nanometer. Forskjeller av vedheft mellom forskjellige cellelinjer, f.eks kreftceller og mindre ondartede celler, er således bestemt. I tillegg kan mulige endringer av celleadhesjon ved kjemiske eller fotodynamisk behandling undersøkes. I sammenligning med andre metoder for super-oppløsning mikroskopi lyseksponering holdessvært liten, og ingen skader av levende celler er forventet å oppstå.

Introduction

Når en lysstråle forplanter seg gjennom et medium av brytningsindeks n ₁ møter et grensesnitt til en andre medium av brytningsindeks n ₂ <n _1, oppstår total innvendig refleksjon i alle vinkler av insidens Θ, som er større enn den kritiske vinkelen Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Tross for å være helt reflektert hendelsen lysstrålen fremkaller en evanescent elektromagnetisk felt som trenger inn i det andre medium, og nedbrytes eksponentielt med vinkelrett avstand z fra grensesnittet ifølge I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) svarer til intensiteten av det elektromagnetiske feltet og d (Θ) til inntrengningsdybden på bølgelengde λ, som gis av

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² Sin ² Θ - n _{² 2)} ^{-1 /} ₂

Som rapportert i litteraturen ^1,2, ₀ I e multiplisert med transmittans T (Θ) og forholdet n ₂ / n _1. Hvis den elektriske feltvektor i denne lysstrålen er polarisert vinkelrett på planet av insidensen (dvs. planet utspent av hendelsen og den reflekterte stråle), er denne gitt ved transmittans

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 - (N ₂ / nL ₁₎ ^2]

For det oppdagede fluorescensintensiteten i TIRFM målinger, har lys absorpsjon skal integreres over alle lag av prøven og multiplisert med fluorescens kvanteutbytte η av relevant fargestoff samt med den faste vinkel deteksjon Ω. Som rapportert tidligere ^3, kan denne intensiteten beskrives ved

I _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

hvis alle faktorer som er uavhengige f ROM innfallsvinkelen Θ og koordinatsystemet z er inkludert i den eksperimentelle konstant A. Likning 3 kan løses analytisk, dersom konsentrasjonen c (z) av fluoroforer anses å være nesten konstant

- Enten på alle koordinater z ≥ Δ, f.eks i cytoplasma av celler som har en avstand Δ fra grensesnittet. I dette tilfellet, har integralet beregnes fra z = Δ til z = ∞ resulterer i

I _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

- Eller mellom z = Δ - t / 2 og z = Δ + t / 2, det vil si innenfor et tynt lag av tykkelse t, f.eks en cellemembran plassert i en avstand Δ fra grensesnittet. I dette tilfellet, kan den fluorescensintensiteten beregnes som

I _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

hvis t er liten i forhold til Δ.

ent "> Fra Likningene (4) og (5) celle-substrat avstander Δ kan beregnes, hvis bilder av fluorescensintensitet I _F føres for variable vinkler Θ, og hvis ln (I _F / T d) (Eq. 4) eller ln (I _F / T) (Eq. 5) evalueres som en funksjon av 1 / d for disse vinkler. For membranen markør laurdan brukt i denne artikkelen (s. nedenfor) evalueringen ble utført i henhold til Eq. 5.

Som rapportert tidligere ^3, bildeopptak og evaluering krever
- Homogen fordeling av eksitasjon lys over prøven,
- Gyldigheten av et 2-lags-modellen (med brytningsindekser n ₁ og n ₂ for substratet og cytoplasma, henholdsvis). Dette holder, hvis plasmamembranen er svært tynn, og hvis lag av det ekstracellulære medium (mellom cellen og substratet) er liten sammenlignet med bølgelengden til innfallende lys.

I tillegg, en moderat numerisk apertur(Vanligvis en ≤ 0,90) av mikroskopobjektivlinsehuset er fordelaktig å unngå avvik lysstyrke grunnet anisotropi av stråling i nærfeltet av den dielektriske grensesnittet.

Protocol

1. Såing og Inkubasjon av celler

1. Seed individuelle celler, f.eks U373-MG eller U-251-MG glioblastoma celler på en typisk densitet på 100 celler / mm ² på en glass-slide og vokse dem for 4872 hr i dyrkingsmedium (f.eks RPMI 1640 supplert med 10% kalvefosterserum og antibiotika) ved hjelp av en inkubator ved 37 ° C og 5% CO _2.
2. Inkuber celler med en membran markør, f.eks 6-dodecanoyl-2-dimetylamino naftalen (laurdan) søkt i 60 min ved en konsentrasjon på 8 um (i kulturmedium) ^4, eller en cytoplasma markør, f.eks calcein acetomethlyester søkt 40 min ved et konsentrasjon på 5 uM ^3, eller en membran forbundet fotosensibiliserende, f.eks protoporfyrin IX indusert ved 4 timers inkubasjon med dets forløper 5-aminolevulinsyre (5-ALA, 1 mM) ^4,5.
3. Vask cellene med dyrkingsmedium eller fosfat-bufret saltvann (PBS) før fluorescensmikroskopi. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. Bruk en oppreist mikroskop, f.eks Zeiss Axioplan, og erstatte kondensatoren ved en belysning enheten, som beskrevet i Ref. 3 med en hemi-sfærisk eller en halvsylindriske glassprisme optisk koplet til objektet lysbildet (se figur 1).
2. Bruke en parallell kollimert laserstråle som etter bildebehandling ved glassprisme og ytterligere optiske komponenter (f.eks hulspeil) igjen resulterer i en parallell stråle på overflaten av prøven (telesentrisk elev ray). Passe på at den elektriske feltvektor er polarisert vinkelrett på planet av forekomsten.
3. Bruk en justerbar speil ligger inne kondensatoren som avbildes i prøven planet og belyser prøven under en variabel innfallsvinkel (objekt ray). Den justerbare speil kan være drevet av en trinnmotor, hvor hver posisjon svarer til en veldefinert innfallsvinkelen, som bestemt ved målinger goniometric ³
4. Kalibrer vinkelposisjon av justerbare speil med kritisk vinkel Θ _c = 61,3 ° for et glass-vann overgang som en fast verdi. Θ _c kan bli visualisert ved variasjon av Θ når et fluorescerende fargestoff (f.eks 1 mM flavin mononucleotide, FMN) oppløses i vann. Posisjonen til speilet på Θ = Θ _c er lagret i speilet posisjonering programmet.
5. Parametrisere kameraet (bakbelyst Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, ⁶ UK), inkludert temperatur, gain, opptakstid og shift hastighet.
6. Bruk en objektiv av passende forstørrelse og fortrinnsvis moderat numerisk blenderåpning (f.eks 40 × / 0,75 eller 63 × / 0,90 nedsenking i vann) og lokalisere objektet lysbildet i mikroskop. Bruk immersjonsolje å sikre optisk kontakt av prøven med glassprisme. Record fluorescensbilder av identiske prøver ved variasjon avvinkelen belysning (Θ ≥ Θ _c med Θ _c tilsvarende 64,5 ° for en celle-glass Interface). En vinkelformet spekter av 66 ° -74 ° med trinn på 0,5 ° eller 1 ° anbefales. Bruk en passende langpasning eller band pass filter for fluorescens deteksjon.

3. Dataanalyse

1. Les bilder (f.eks i ASCII format) registrert i forskjellige vinkler Θ, samt kamerainnstillinger (for bakgrunnen diskriminering), eksitasjon bølgelengde og brytningsindekser for glass (n ₁ = 1,52) og celler (n ₂ = 1,37) inn i evalueringen program (LabView, NanoCell). For hvert sett av parametere inntrengningsdybde d (Θ) og transmittans T (Θ) beregnes automatisk.
2. Velg bilder som brukes til evaluering av celle-substrat avstander Δ henhold til ligning 5 (membran markør) eller Equation 4 (cytoplasma markør), Individuelle bilder med inhomogenebelysning (avslørende e, g. striper) kan utelukkes.
3. Beregn bilder av celle-substrat topologi og velg en passende fargekode for visning. Under evalueringen profiler individuelle piksler kan vises, som avbildet i figur 2. Disse profiler kan bli brukt som en indikator for kvaliteten av passform.
4. Oppbevar evalueringen protokollen.

4. Representant Resultater

Representative eksperimenter utføres med genmodifisert U251-MG glioblastoma celler vennlig levert av professor Jan Mollenhauer, Institutt for molekylær onkologi, University of South Danmark, Odense. I to subkloner av disse U251 celler de tumorsuppressorgener TP53 eller PTEN er over-uttrykt ved hjelp av en Tet-On induserbare uttrykk system, slik at disse cellene viser en redusert tumorigent potensial og kan betraktes som mindre ondartet. Svært maligne U251-MG celler uten suppressor genet brukes som kontroller, og U251-MG villtype celler tjene for en ytterligere sammenligning. En laserdiode emitting en kvasi sammenhengende serie av picosecond pulser (LDH400 med sjåfør PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Tyskland; bølgelengde: 391 nm; pulsenergien: 12 pj; repetisjonsrate: 40 MHz) brukes som en eksitasjon kilde.

I figur 3 TIRFM bilder av U251-MG glioblastoma celler med en aktivert TP53 tumor suppressor gen og inkubert med laurdan (8 mikrometer, 60 min) er avbildet for innfallsvinkler på 66,0 °, 69,0 ° og 73,0 ° tilsvarende penetrasjon dypet av flyktig elektromagnetisk felt av ca 140 nm, 75 nm og 60 nm, respektivt. Med synkende inntrengningsdybde fluorescens avtar i intensitet (se skalaer) og stammer fra flere overfladiske områder av cellene (f.eks focal kontakter på sine kanter). Cell-substrat avstander (visualisert i Figur 3d av en fargekode som strekker seg 0-600 nm) sterkt variere over cellene mellom påly noen få nanometer (hvit-gul) og 250-300 nm (mørk rød), dvs. focal kontakter og større celle-substrat avstander er i nærheten. Det samme gjelder for U251-MG glioblastoma celler med en aktivert suppressor genet PTEN (figur 4d), ​​mens celle-substrat avstander er ganske konstant for U251-MG kontroll og villtype celler med typiske verdier for 80-100 nm (gult, Fig. 4b ) og 150-200 nm (oransje-rødt, figur 4a).

Figur 1. Belysningsinnretningen for VA-TIRFM i oppreist mikroskop. En justerbar speil drevet av en stegmotor tillater en vinkeloppløsning ± 0,25 °.

Figur 2. Evaluering profil for en pixel (skjematisk). Da ln [I _F / T (Θ)] er plottet som en funksjon av 1 / d (Θ) representerer stigningstallet celle-substrat avstand Δ. Denne skråningen er ofte bestemmes med en nøyaktighet på ca ± 10%. En verdi - som følge av inhomogene belysning - har blitt merket og ekskludert fra evalueringen.

Figur 3 TIRFM bilder av U251-MG glioblastoma celler med aktivert TP53 suppressor genet ved inkubasjon med laurdan (8 pM, 60 min). Fart i ulike vinkler av belysning (ac); celle-substrat avstander i størrelsesorden 0-600 nm vist av en fargekode (d); eksitasjonsbølgelengde: 391 nm, deteksjon: ≥ 420 nm, bildestørrelse:. 210 mikrometer × 210 mikrometer Klikk her for å se større figur .

Figur 4 Cell-substrat avstander U251-MG glioblatoma celler i området av 0-600 nm vist av en fargekode,. (A) villtype (b) kontroller, (c) celler med aktivert suppressor genet TP53, (d) celler med aktivert suppressor genet PTEN, eksitasjonsbølgelengde: 391 nm, deteksjon: ≥ 420 nm, bildestørrelse:. 210 mikrometer × 210 mikrometer Klikk her for å se større figur .

Discussion

En fremgangsmåte er beskrevet for å måle celle-substrat avstander med nanometerpresisjon. Dag, metoder for super-oppløsning mikroskopi, for eksempel basert på strukturert belysning ⁷ eller på eneste molekyl gjenkjenning ^8-10 samt stimulert emisjon utarming (Schibsted) mikroskopi ¹¹ er av betydelig interesse. Ingen av disse teknikkene, men tillater en aksial oppløsning under 50 nm. I tillegg ganske høy irradians av 50100 W / cm ² er nødvendig for ett molekyl metoder og mer enn 3000 W / cm ² for Schibsted mikroskopi. Dette overstiger solinnstråling (ca 100 mW / cm ²⁾ ved flere størrelsesordener, slik at rask skader levende celler er sannsynlig. I VA-TIRFM eksperimenter, kan imidlertid irradians være begrenset til mindre enn 20 mW / cm ^2, tillater eksponeringstider av flere minutter eller timer uten skade på levende celler ^12, slik at langvarige eksperimenter med multiple eksponeringer vises godt mulig. Viktigste forutsetningene for hvert forsøk er gode kantete kalibrering og homogen belysning av rene objekt lysbilder.

VA-TIRFM kan påføres mange emner innen tekniske eller biologiske overflater, f.eks målinger av celleadhesjon til en gjennomsiktig substrat. Cellevekst, cellemigrering eller celledød (f.eks apoptose) kan derfor studert mer i detalj. Nylig ble rollen av intracellulær kolesterol på celleadhesjon undersøkt ^4. Spesielt viste det seg at antall celle-substrat kontakter ble redusert ved uttømming av cholesterol av 3050%, endelig fører til avløsning av et større antall celler fra substratet deres. Celleadhesjon ble også undersøkt ved anvendelse av fotosensitisere som vanligvis brukes i fotodynamisk terapi (PDT) av kreft og andre sykdommer ^13. Det viste seg at ved bestråling med ikke-phototoxic lys doser celle-substrat avstanderble noe redusert (muligens på grunn av noen hevelse av cellen), mens kontaktpunktene sammenvoksninger ble opprettholdt ^4,5. Derfor, var dannelsen av metastaser grunnet PDT ikke sannsynlig. Present eksperimenter viser forskjeller av celleadhesjon mellom tumor (glioblastoma) og mindre maligne celler. Bare fremtidige eksperimenter vil bevise om denne annen adferd kan brukes for diagnostiske, farmakologiske eller terapeutiske applikasjoner.

Det bør understrekes at målinger av celle-substrat kontakter dateres tilbake til begynnelsen av TIRF mikroskopi ^14. Vinkeloppløsning imidlertid nødvendig heller komplisert utstyr ^15, så langt, og bare utviklingen av en kompakt belysning enhet for variabel vinkel TIRFM ³ tillatte rutinemessige målinger av celle-substrat topologi. I tillegg til dette prisme-type TIRFM ble miniatyrisering introdusert av objektiv-attraksjon ^16,17 TIRFM, hvor en enkelt flekk (eller ringrom) nær kanten avblenderåpningen planet av mikroskopobjektivlinsehuset lyser, slik at lyset kan dryppe på prøven under en vinkel Θ ≥ Θ _C. Derfor er høye blenderåpning objektiver tillater en vinkelområde på ca 66-75 ° nødvendig. Avstemning av vinkelen Θ krever imidlertid en definert forskyvning av laser fokus innenfor en avstand på mindre enn 100 um, noe som er vanskelig å utføre, selv i en kommersialiserte TIRFM mikroskop. Ytterligere ulemper med høy blenderåpning (og høy forstørrelse) objektiv er nær felt anisotropi og heller begrenset objekt felt. Derfor, i sammenligning med objektiv-type TIRFM forsøksoppsett som beskrevet i dette manuskriptet er å foretrekke for å måle celle-substrat topologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera